Nghiên cứu định lượng nồng độ ADN BK polyomavirus bằng kỹ thuật taqman probe real - time PCR

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 29 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG NỒNG ĐỘ ADN BK POLYOMAVIRUS BẰNG KỸ THUẬT TAQMAN PROBE REAL-TIME PCR Hoàng Xuân Sử*; Trịnh Thị Mỹ Anh**; Nguyễn Sỹ Lánh*** Phan Quốc Toản****; Nguyễn Giang Hòa****; Đinh Thị Thu Hằng* TÓM TẮT Mục tiêu: thiết lập được kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BK polyomavirus ADN. Vật liệu và phương pháp: kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BK polyomavirus ADN trong công trình này được nghiên cứu thiết lập với cặp mồi, probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1 sử dụng phần mềm Primer3plus, Bioedit và đánh giá bước đầu trên bộ mẫu chuẩn ADN cùng mẫu huyết tương, nước tiểu của 10 bệnh nhân sau ghép thận có BK polyomavirus (+) và 10 mẫu máu ngoại vi của người hiến máu tình nguyện BK polyomavirus (-). Kết quả và kết luận: phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, 0,05 μ probe, 5 μl ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion đủ thể tích 20 μl, chu trình nhiệt: (50 o C/2 phút) (95 o C/15 phút) (94 o C/15 giây, 58 o C/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7 o C. Kỹ thuật Taqman probe real-time PCR đạt ngưỡng phát hiện 1 copy/µl trên panel mẫu với độ tin cậy 95%, bước đầu đánh giá cho kết quả tương đương khi so sánh với kit RealStar® BKV PCR 1.0 trên 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, góp phần chủ động trong việc theo dõi và giám sát BK polyomavirus ở bệnh nhân sau ghép thận ở Việt Nam. * Từ khóa: BK polyomavirus; Bệnh thận do B polyomavirus; Định lượng; Ghép thận; Taqman probe real-time PCR. Quantification of BK Polyomavirus Load in Vietnamese Renal Transplant Recipients by an In-house Taqman Probe Real-time PCR Assay Summary Objectives: To establish an in-house real-time PCR assay using Taqman probe for detection and quantification of BKV DNA load in renal transplant recipients. Materials and methods: An in- house quantitative real-time PCR assay was established with specific primer pairs and Taqman probe targeting VP1 gene of BKV using Primer3plus and Bioedit. We also initially evaluated performance of the developed assay on 10 fold serial dilutions of plasmid DNA inserted VP1 gene sequence of BKV as well as clinical specimens collected from 10 recipients infected with * Học viện Quân y ** Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia *** Bệnh viện Việt Đức **** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/02/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/05/2018 Ngày bài báo được đăng: 30/05/2018 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 30 BKV after renal transplantation and peripheral blood samples from 10 healthy blood donors negative for BKV DNA. Results and conclusion: The optimization of real-time PCR assay had the following components: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Germany); 0 05 μM probe, 5 μl DNA template, and deionized H2O equals to 20 μl, was performed using the Rotor- GeneQ instrument with the cycling conditions as follows: 50 o C for 2 mins, denaturation at 95 o C for 15 mins, followed by 45 cycles of amplification at 94 o C for 15s, 58 o C for 60s. In the developed assay, the limit of detection is 1 copy/µl on DNA panel at 95% confidence. In conclusion, this Taqman probe real-time PCR assay achieved a concordant result with the RealStar BKV PCR 1.0 kit on 20 clinical specimens contributes to monitoring and surveilance of BKV of kidney transplant recipients in Vietnam. * Keywords: BK polyomavirus; BK polyomavirus-associated nephropathy; Quantification; Renal transplantation; Taqman probe real-time PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Hơn 40 năm đã qua kể từ khi B polyomavirus (BKV) lần đầu tiên được phân lập từ nước tiểu của một bệnh nhân (BN) ghép thận (viết tắt là BK) bị hẹp niệu quản [2], nhưng loài virut cơ hội này vẫn cần được nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ chế bệnh học của nhiều bệnh liên quan. BKV là thành viên của nhóm nhỏ Polyoma của Papovaviruses, bao gồm BKV, JC virut và Simian 40 virut (SV-40), là một loại virut khá phổ biến với tỷ lệ huyết thanh dương tính ở trẻ em trung bình 80% [4]. Nhiễm B V thường không có triệu chứng lâm sàng, tuy nhiên một số triệu chứng cũng được ghi nhận là sốt và viêm đường hô hấp trên thể nhẹ [5]. Sau khi nhiễm nguyên phát, B V vẫn còn tiềm ẩn ở nhiều cơ quan trong cơ thể, đặc biệt trong các tế bào biểu mô niệu đạo và biểu mô thận. hi cơ thể trong tình trạng bị ức chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào có liên quan đến tái hoạt động và sao chép của virut, dẫn đến kích hoạt một chuỗi phản ứng và phân giải tế bào [6]. Ở BN ghép thận, sau khi BKV nhân lên, đi vào các mao mạch, xuất hiện trong nước tiểu (viruria) và tấn công bộ phận ghép, dẫn đến tổn thương khác nhau. hoảng 1/3 số BN có viruria sẽ phát triển B V trong máu (viremia), nếu không được can thiệp kịp thời sẽ phát triển thành bệnh thận do B V (B V- associated nephropathy, B VN) với tỷ lệ dao động 1 - 10%, dẫn đến thải ghép, mất chức năng thận ghép [5]. Việc tái hoạt động của BKV ở người nhận ghép thận với dấu hiệu thường gặp là virut phát tán trong nước tiểu với tỷ lệ 20 - 60% BN [6]. Trong khi đó, ở những người khỏe mạnh hay BN có khả năng miễn dịch, hiện tượng tái hoạt động của B V và xuất hiện B V viruria rất hiếm. Ngoài liên quan đến thận ghép, B V thường gặp ở người nhận ghép tủy xương [7], hay một số báo cáo cũng cho thấy B V và B V viruria ở BN ghép tạng không phải thận như ghép tim, phổi và gan. Nhìn chung, BKV có mặt trong máu hoặc nước tiểu không liên quan đến suy giảm chức năng thận ở những BN này [4, 5, 8, 9]. Như vậy, đến nay BKV được khẳng định là nguyên nhân quan trọng hàng đầu dẫn đến B VN ở BN sau ghép thận 4]. Hiện tượng mất mô thận ghép thấy ở 45% BN BKVN [10]. Chính vì vậy, việc chẩn đoán sớm và ức chế hoàn toàn BKV TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 31 nhân lên sau ghép thận là đích điều trị cuối cùng nhằm hồi phục cả chức năng và hình thái của thận ghép. Định lượng nồng độ BKV ADN bằng real-time PCR có giá trị trực tiếp trong phát hiện tái hoạt động của virut cũng như giám sát điều trị [1]. BKV với hệ gen là ADN dạng vòng, kích thước 5,13 kb, trong đó gen VP1 mã hóa cho viral protein 1 thường sử dụng trong chẩn đoán. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về B V được công bố ở Việt Nam. Một số cơ sở y tế đã sử dụng kít thương mại như Realstar BKV PCR (Altona Diagnostics, Đức), Artus® BK Virus RG PCR Kit (Qiagen, Đức) xác định tải lượng BKV ADN, tuy nhiên giá thành các kít này rất cao, đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng bộ và chưa đề cập đến khía cạnh các kít này có thể không phù hợp với một số chủng BKV ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện công trình này nhằm: Thiết lập được kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN, góp phần chủ động trong việc theo dõi và giám sát BKV ở BN sau ghép thận. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Mẫu bệnh phẩm. Lựa chọn mẫu máu ngoại vi (06 mẫu, ký hiệu PB 1, 2, 5, 7, 8, 10), nước tiểu (04 mẫu, ký hiệu PBK3, 4, 6, 9) của 10 BN sau ghép thận có BKV (+), trong đó 1 BN B VN (PB 10) được khẳng định bằng mô bệnh học kết hợp với phân tích trình tự gen VP1 của BKV, 9 BN còn lại khẳng định bằng semi-nested PCR theo Arthur và CS [11] (nhóm bệnh) và 10 mẫu máu ngoại vi của người hiến máu tình nguyện BKV (-) (nhóm chứng). Các mẫu bệnh phẩm được cung cấp nhờ hợp tác nghiên cứu giữa Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Khoa Thận, Lọc máu - Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Huế. 2. Thiết lập kỹ thuật Taqman probe real-time PCR. 200 µl mẫu huyết tương, cặn nước tiểu được sử dụng để tách chiết BKV ADN theo quy trình bộ kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ), thu 100 µl mẫu ADN. Cặp mồi, Taqman probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1 sử dụng phần mềm Primer3plus và Bioedit dựa trên trình tự tham chiếu của gen VP1 BKV đã công bố trên Genbank có tên qBK-F/R, qBK-Pr và đặt Hãng IDT, Mỹ tổng hợp, có trình tự qBK-F: 5’- TAGGCGCCAACCATTAGAC-3’; qB -R: 5’- ACGTAATGGCACTTGCTCG-3’; qB -Pr: 5’-FAM- GAGCAGCCGCAGCCCATATAGGC- BHQ1-3’. Quá trình tối ưu kỹ thuật real- time PCR bao gồm khảo sát trên chu trình nhiệt, trong đó lần lượt đánh giá nhiệt độ gắn mồi khác nhau; tối ưu các thành phần tham gia trên cơ sở phản ứng real- time PCR tiêu chuẩn. Phản ứng real-time PCR có thành phần như sau: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 - 0,5 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, 0,05 - 0,3 μ probe, 5 μl ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion DNAase/RNAse free đủ thể tích 20 μl. Quá trình khuếch đại thực hiện trên máy real-time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen, Đức) với chu trình: (50oC/2 phút) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 32 (95oC/15 phút) (94oC/15 giây, 56 - 60oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC. Kết quả real-time PCR tối ưu được lựa chọn tại giá trị khảo sát cho chu kỳ ngưỡng thấp nhất. 3. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN. * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN trên bộ mẫu chuẩn ADN: Bộ mẫu chuẩn ADN được thiết lập từ mẫu plasmid tinh khiết pGEMT-VP1 pha loãng trong nước khử ion tạo dải nồng độ 100 - 108 (copy/µl). Plasmid pGEMT-VP1 này thiết lập qua con đường tái tổ hợp, chứa trình tự gen VP1 của BKV phân lập từ BN BKVN và khẳng định bằng giải trình tự [2]. Bộ mẫu chuẩn ADN là cơ sở để đánh giá kỹ thuật real-time PCR thiết lập cũng như xác định nồng độ BKV ADN. * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN trên mẫu lâm sàng: Kỹ thuật real-time PCR được khảo sát trên 10 mẫu BKV ADN của BN sau ghép thận có BKV (+) và 10 mẫu BKV (-) là huyết tương người khỏe mạnh hiến máu tình nguyện đã xác định BKV (-) bằng semi-nested PCR theo Arthur và CS [11]. Đồng thời, chúng tôi định lượng BKV ADN đối chứng với bộ kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0 (Altona Diagnostics, Đức) có chứng chỉ CE-IVD [12]. Tất cả các thử nghiệm tối ưu và định lượng đều tiến hành lặp lại ít nhất 2 lần, xác định giá trị trung bình, mỗi lần chạy đều có chứng âm là nước khử ion và chứng dương. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Thiết lập và tối ưu kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN. Kỹ thuật real-time PCR được thiết lập và tối ưu trên mẫu chứng dương là huyết tương BN sau ghép thận bị BKVN. Sử dụng phần mềm chuyên dụng để thiết kế một bộ mồi, probe hoàn toàn mới cho kỹ thuật Taqman probe real-time PCR có khả năng xác định BKV ADN phù hợp với các chủng của Việt Nam và quốc tế. Để hiệu suất phản ứng real-time PCR lý tưởng, chúng tôi lần lượt tối ưu các điều kiện cũng như thành phần phản ứng. a. b Hình 1: Biểu đồ khuếch đại tối ưu kỹ thuật real-time PCR phát hiện BKV AND. (A: Tối ưu nồng độ mồi. 1 - 4: Nồng độ mồi tương ứng là 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 µM; dc: Đối chứng âm là nước kh ion; B: Tối ưu nồng độ probe từ 0,05 - 0,3 µM) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 33 Từ kết quả hình 1A cho thấy: nồng độ mồi cho giá trị Ct sớm nhất 0,2 µ . Như vậy, đây là nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng real-time PCR BKV. Trên cơ sở nồng độ mồi tối ưu, nồng độ probe được khảo sát ở các mức 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 µM. ết quả cho thấy, nồng độ probe 0,05 µM là nồng độ thấp nhất mà vẫn cho kết quả đáng tin cậy. Do đó, nồng độ probe tối ưu được lựa chọn cho phản ứng real-time PCR BKV ADN là 0,05 µM (hình 1B). Chu trình nhiệt tối ưu được xác định như sau: (50oC/2 phút) (95oC/15 phút) (94oC/15 giây, 58oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC. Bảng 1: Thành phần tối ưu của kỹ thuật real-time PCR. STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µ ) 1 QuantiTect Probe PCR master mix 1X 10 2 qBK-F/R 5 µM 0,2 µM 0,8 3 Probe qBK-Pr 5 µM 0,05 µM 0,2 4 Nước khử ion DNA/RNAase free - 4 5 BKV ADN 5 Tổng 20 2. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN. Trong công trình này, trên cơ sở có sẵn mẫu chuẩn dương plasmid tái tổ hợp chứa gen đích VP1, lựa chọn mẫu plasmid có nồng độ, độ tinh sạch cao (nồng độ 1010 copies/µl, A260/280: 2,01 được xác định bằng máy đo quang phổ Nanodrop ND-1000) làm mẫu chuẩn. Theo cách này, bộ mẫu chuẩn có độ đồng bộ cao nhất và có thể pha loãng thành các nồng độ chính xác, cũng là hướng thiết lập được WHO và NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control, Viện Quốc gia về Kiểm chuẩn Sinh học) khuyến cáo. Các mẫu plasmid có dải nồng độ 100 - 108 (copies/µl) được chia nhỏ thành nhiều ống, mỗi ống chứa ADN plasmid đủ dùng cho 1 phản ứng, bảo quản ở điều kiện -20oC. Kỹ thuật real-time PCR sau khi tối ưu đánh giá trên bộ mẫu chuẩn BKV ADN này cho hiệu suất phản ứng PCR đạt 103,7%, sai số 0,005 - các giá trị gần như lý tưởng, cho thấy quy trình tối ưu real-time PCR cũng như thao tác kỹ thuật tốt, bộ mẫu chuẩn đạt nồng độ có độ chính xác cao. Theo tính toán, ngưỡng phát hiện của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu chuẩn ADN thiết lập này có thể đạt 1 copy/µl với độ tin cậy 95% - ngưỡng đạt được ở một số kít thương mại hiện nay (dữ liệu không trình bày). Đây là cơ sở để đánh giá kỹ thuật real- time PCR định lượng nồng độ BKV ADN trên các mẫu lâm sàng (hình 2). TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 34 Hình 2: Biểu đồ khuếch đại định lượng nồng độ BKV ADN trên mẫu lâm sàng và đường chuẩn standard curve bằng kỹ thuật real-time PCR phát triển. (SK2-SK4: 3 mẫu chuẩn với nồng độ lần lượt là 103; 102; 101 (copies/µl); PBK1-PBK3: Các mẫu bệnh phẩm BK (+); NC: Đối chứng âm là nước kh ion) Bước đầu, chúng tôi đã đánh giá đồng thời kỹ thuật real-time PCR phát triển (đặt tên là kít LDA_BK) và bộ kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0 (Hãng Altona) trên các mẫu lâm sàng gồm 10 mẫu bệnh phẩm dương tính với BKV và 10 mẫu âm tính. Kết quả giá trị trung bình các lần thử nghiệm trên 10 mẫu bệnh phẩm B V dương tính được thống kê theo bảng 2, còn 10 mẫu âm tính đều không xuất hiện tín hiệu huỳnh quang với cả 2 bộ kít. Bảng 2: Nồng độ các mẫu bệnh phẩm B V dương tính. STT Mã Nồng độ copy/ m Log copy/ ml Sự khác biệt ( og) Hệ số biến thiên CV% (log) Kít LDA_BK Kít Altona Kít LDA_BK Kít Altona 1 PBK1 1.88E+04 1.36E+04 4.27 4.13 0.14 2.37 2 PBK2 2.90E+04 1.69E+04 4.46 4.23 0.24 3.84 3 PBK3* 9.98E+08 5.1E+08 9.00 8.71 0.29 2.33 4 PBK4* 1.10E+07 1.01E+07 7.04 7.00 0.04 0.39 5 PBK5 5.16E+03 5.13E+02 3.71 2.71 1.00 22.1 6 PBK6* 9.45E+08 2.08E+08 9.98 9.32 0.66 4.82 7 PBK7 1.70E+03 1.35E+03 3.23 3.13 0.10 2.23 8 PBK8 1.13E+06 3.67E+05 6.05 5.56 0.49 5.95 9 PBK9* 2.48E+05 1.21E+05 5.39 5.08 0.31 4.2 10 PBK10 3.24E+04 1.70E+04 4.51 4.23 0.28 4.53 (*: Mẫu nước tiểu) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 35 Từ kết quả đánh giá cho thấy, kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN được phát triển đã xác định trên 10 mẫu bệnh phẩm BKV (+), kết quả tương đương so với kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0, thể hiện qua khác biệt về số log giữa 2 giá trị nồng độ (sử dụng 2 kít khác nhau) và hệ số biến thiên (CV%) cùng một mẫu. Giá trị nồng độ được xác định bằng kít LDA_BK từ 103 - 108 copies/ml. Chỉ có một mẫu PBK5 nồng độ khác biệt là 1 log, CV 22,1%, điều này có thể được lý giải do 2 bộ kít khác nhau về chiến lược thiết kế mồi, các bộ mẫu chuẩn, cũng như sai khác giữa những lần thao tác. Đồng thời, do số lượng mẫu đánh giá trong công trình này còn hạn chế nên chưa thể khẳng định sự khác biệt của một mẫu là PB 5 có ý nghĩa thống kê hay không. Phát hiện B V viremia bằng kỹ thuật real-time PCR được khẳng định có giá trị chẩn đoán dương tính và giá trị chẩn đoán âm tính cao hơn cho B VN so với phát hiện viruria bằng xét nghiệm tế bào decoy hay PCR. Tuy nhiên, tương tự như xét nghiệm real-time PCR trong theo dõi tải lượng virut khác, hiện có sự khác biệt đáng kể trong cách phát triển kỹ thuật dẫn đến khó khăn khi so sánh kết quả giữa phòng thí nghiệm khác nhau cũng như xác định một giá trị ngưỡng trong chẩn đoán và điều trị B VN. Tuy nhiên, Hirsch và CS đã xác định mức nồng độ B V ADN > 104 copies/ml huyết tương trong hơn 4 tuần ở BN sau ghép thận có liên quan đến B VN với độ đặc hiệu 93% 9], giá trị này được nêu trong các hướng dẫn gần đây 6 . huyến nghị này cũng được các trung tâm trên thế giới sử dụng và khảo nghiệm, sai khác về nồng độ được chấp nhận ít nhất 1 log. Ghép thận là phương pháp điều trị thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho BN bệnh thận mạn giai đoạn cuối. Ở nước ta ước tính có khoảng 80.000 BN bị bệnh thận mạn giai đoạn cuối và mỗi năm khoảng 4.000 BN có nhu cầu ghép thận. Việc theo dõi điều trị BN sau ghép thận đóng vai trò quan trọng trong duy trì chức năng thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy cơ mất mô ghép hay suy chức năng thận ghép. Nguyên nhân dẫn đến suy chức năng của thận ghép đồng loại chủ yếu do BKV nhân lên trong tế bào biểu mô ống thận, làm tổn thương, hoại tử ống thận trực tiếp. Ống thận hoại tử tỷ lệ với BKV nhân lên, tuy nhiên khi BKV nhân lên bị giới hạn trong vùng tủy thận sẽ không làm ảnh hưởng đến chức năng thận ghép. Do đó, ở giai đoạn sớm này của bệnh rất khó xác định biểu hiện của BKVN. Chỉ khi BKV bắt đầu nhân lên xảy ra ở vùng vỏ thận, có mối liên quan rõ với hoại tử tế bào biểu mô ống thận và nồng độ creatinin huyết thanh tăng. Cơ chế dẫn đến rối loạn chức năng mô ghép thận đồng loại được xác định là do rò rỉ và nước tiểu chảy ngược từ ống thận bị tổn thương vào khoang kẽ và mao mạch quanh ống thận. Do đó, tổn thương và hoại tử ống thận cấp là dấu hiệu quan trọng của BKVN. BKV hoạt động và BKVN phát triển phụ thuộc vào hiệu quả điều trị giảm liều thuốc ức chế miễn dịch và đáp ứng miễn dịch kháng virut của cơ thể chủ. Diễn biến của tái hoạt động BKV phát hiện trực tiếp bằng xác định tải lượng BKV ADN hỗ trợ phát hiện gián tiếp qua theo dõi đáp ứng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 36 miễn dịch đặc hiệu với B V. Do đó, sử dụng kỹ thuật real-time PCR tối ưu xác định tải lượng BKV ADN giúp theo dõi, giám sát chỉ số này trong máu và nước tiểu, là công cụ rất có giá trị trong tiên lượng BKVN, cần được nghiên cứu phát triển ở Việt Nam. KẾT LUẬN Đã thiết lập thành công kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN trong huyết tương, nước tiểu ở BN sau ghép thận với ngưỡng phát hiện 1 copy/µl trên panel mẫu, độ tin cậy 95%. Phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, 0,05 μ probe, 5 μl ADN khuôn, nước khử ion DNAase/RNAse free đủ thể tích 20 μl, với chu trình nhiệt được thực hiện trên máy real-time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen, Đức). Kỹ thuật real-time PCR này bước đầu được đánh giá cho kết quả tương đương so với kít RealStar® BKV PCR 1.0 trên 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đinh Thị Thu Hằng, Hoàng Xuân S . Đặc điểm kiểu gen của BK polyomavirus trên bệnh nhân sau ghép thận ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN. Khoa học Y Dược. 2018, tập 34, số 1 tr.1-6. 2. Gardner S.D et al. New human papovavirus (B.K.) isolated from urine after renal transplantation. Lancet. 1971, 1 (7712), pp.1253-1257. 3. Reploeg M.D, G.A Storch, D.B Clifford. BK virus: a clinical review. Clin Infect Dis. 2001, 33 (2), pp.191-202. 4. Sawinski D. S. Goral. BK virus infection: an update on diagnosis and treatment. Nephrol Dial Transplant. 2015, 30 (2), pp.209-217. 5. Sharma R et al. BK virus in kidney transplant: Current concepts, recent advances, and future directions. Exp Clin Transplant. 2016, 14 (4), pp. 377-384. 6. Pavlakis M. A, Haririan, D.K. Klassen. BK virus infection after non-renal transplantation. Adv Exp Med Biol. 2006, 577, pp.185-189. 7. Loeches B et al. BK virus in liver transplant recipients: a prospective study. Transplant Proc. 2009, 41 (3), pp.1033-1037. 8. Remund K.F, M Best, J.J. Egan. Infections relevant to lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 2009, 6 (1), pp.94-100. 9. Hirsch H.H et al. Polyomavirus- associated nephropathy in renal transplantation: critical issues of screening and management. Adv Exp Med Biol. 2006, 577, pp.160-173. 10. Bohl D.L, D.C. Brennan. BK virus nephropathy and kidney transplantation. Clin J Am Soc Nephrol. 2007, 2 Suppl 1, pp.S36-46. 11. Arthur R.R, S. Dagostin, K.V. Shah. Detection of BK virus and JC virus in urine and brain tissue by the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 1989, 27(6): pp. 1174-9. 12. RealStar® BKV PCR Kit 1.0_https://www.altona-diagnostics.com. 2016.