Nghiên cứu độc lực của một số chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (ahpnd) trên tôm chân trắng (litopenaeus vannamei) nuôi tại Thừa Thiên Huế

Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 3: 202-211 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(3): 202-211 www.vnua.edu.vn 202 NGHIÊN CỨU ĐỘC LỰC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP (AHPND) TRÊN TÔM CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) NUÔI TẠI THỪA THIÊN HUẾ Nguyễn Ngọc Phước1*, Nguyễn Thị Xuân Hồng1, Nguyễn Công Chung2 1Khoa Thuỷ sản, Trường Đại học Nông Lâm Huế 2Chi cục thú y vùng 3 *Tác giả liên hệ: nguyenngocphuoc@huaf.edu.vn Ngày nhận bài: 13.03.2020 Ngày chấp nhận đăng: 24.04.2020 TÓM TẮT Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích xác định một số yếu tố độc lực và khả năng gây bệnh gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Nerosis Disease - AHPND) của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên tôm chân trắng nuôi tại Thừa Thiên Huế. Trong nghiên cứu này, 8 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đã được phân lập từ tôm chân trắng bị bệnh có triệu chứng điển hình của AHPND như gan tụy teo nhỏ, nhạt màu, tôm bị mềm vỏ, ruột rỗng và xuất hiện các đốm đen trong khối gan tụy. Các chủng vi khuẩn được định danh là V. parahaemolyticus bằng kit API 20E (BioMerieux). Bốn trong 8 chủng vi khuẩn phân lập được xác định gây bệnh AHPND bằng kit IQ Plus™ AHPND/EMS Plasmid Kit. Kết quả kháo sát các yếu tố độc lực cho thấy khả năng di động của các chủng gây bệnh AHPND, cũng như khả năng sản sinh caseinase, phospholipase, haemolysin cao hơn so với chủng vi khuẩn không mang gen độc lực. Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho thấy liều gây chết 50% (LD50) của các chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND phân lập được là 105 cfu/mL. Ngược lại, tôm không có triệu chứng lâm sàng và không xảy ra tỷ lệ chết ở nghiệm thức cảm nhiễm chủng vi khuẩn không mang gen độc lực. Kết quả nghiên cứu cho thấy các yếu tố độc lực có liên quan chặt chẽ đến khả năng gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp của vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm. Từ khoá: Vibrio parahaemolyticus, độc lực vi khuẩn, tôm chân trắng, hoại tử gan tụy cấp, AHPND. Study on the Virulence Factors of Vibrio parahaemolyticus Caused Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in Farmed White Leg Shrimp (Litopenaeus vanamei) in Thua Thien Hue Province ABSTRACT The aim of this study was to identified the virulence factors and the pathogenesis of Vibrio parahaemolyticus in farmed white leg shrimp in Thua Thien Hue province. In this study, 8 isolates of V. parahaemolyticus was recovered from diseased white leg shrimp that showed typical clinical signs of AHPND such as pale-to-white hepatopancreas (HP), significant atrophy of the HP, softshells, guts with discontinuous, or no contents, black spots or streaks visible within the HP. The bacteria were identified as V. parahaemolyticus by using API 20E kit (BioMerieux). Four of 8 isolates have been detected that caused AHPND by using IQ Plus™ AHPND/EMS Plasmid Kit. Data of this study showed that the production of caseinase, phospholipase, haemolysin and mobility of these isolates were significantly stronger than others. The LD50 of isolate that caused AHPND was 105 cfu/mL. By contrast, experimental shrimp were healthy without any clinical signs and no mortality was observed in the treatment immersed in the isolate lacking toxin genes. This study showed strong relationship between virulence factors and pathogenesis of V. parahaemoliticus caused AHPND in shrimp. Keywords: Vibrio parahaemolyticus, white shrimp, virulence factor, Acute hepatopancreatic nerosis disease, AHPND. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Mục tiêu phát triển NTTS của chính phủ Việt Nam đến năm 2020 với tổng diện tích nuôi trồng đạt 1.200.000ha và tổng sản lượng thuỷ sản nuôi trồng nước mặn, lợ đạt 1.408.000 tấn. Trong đó, diện tích nuôi tôm chân trắng là 60.000ha và sản lượng đạt 310.000 tấn (Tổng Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Thị Xuân Hồng, Nguyễn Công Chung 203 cục Thuỷ sản, 2012). Tuy nhiên, dịch bệnh trong NTTS đang là thách thức lớn hiện nay cho sự phát triển bền vững ngành thuỷ sản. Thiệt hại do vi khuẩn Vibrio gây ra vẫn tiếp tục gia tăng trong những năm gần đây trên nhiều đối tượng nuôi trồng thuỷ sản, trong đó V. parahaemolyticus được xem là tác nhân chính gây ra nhiều dịch bệnh trên tôm nuôi và là tác nhân chính gây ra bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Nerosis Disease - AHPND) hay còn gọi là Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) trên tôm nuôi trong giai đoạn dưới 1 tháng tuổi (Lightner & cs., 2012) gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm ở Việt Nam và trên thế giới. Tuy vậy, không phải tất cả các dòng V. parahaemolyticus đều có khả năng gây bệnh EMS trên tôm mà chỉ có một số dòng có độc lực gây ra (Loc & cs., 2013). Nghiên cứu trên toàn bộ hệ gen giữa các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND và không gây bệnh AHPND, các nhà khoa học đã xác định các chủng vi khuẩn gây bệnh AHPND có mang plasmid chứa gen độc lực Pir gồm gen PirA và PirB (Kondo & cs., 2014; Lo & cs., 2014; Tinwongger & cs., 2014; Lightner, 2014; Lee & cs., 2014; Tinwongger & cs., 2014; Yang & cs., 2014; Kondo & cs., 2015; Han, 2016). Các gen PirA/B mã hoá hai loại protein độc tố có kích thước proteins lần lượt là 12,7kDa và 50,1kDa. Plasmid có thể chuyển thông tin di truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác dẫn đến hiện tượng độc lực được kích hoạt và sản sinh độc tố khiến dịch bệnh AHPND lan rộng trong nghành công nghiệp nuôi tôm trên thế giới (Corteel, 2016). AHPND đã gây ra hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt tại một số nước có sản lượng tôm nuôi lớn như Trung Quốc (2009), Việt Nam (2010), Malaysia (2011), Thái Lan (2012) (FAO, 2013), Mexico (2013) (De Schryver & cs., 2014; Zorriehzahra & Banaederakhshan, 2015). Tại Việt nam, AHPND ảnh hưởng đến hầu hết các vùng nuôi tôm trên cả nước với tổng diện tích tôm nuôi bị ảnh hưởng khoảng 28.000ha vào năm 2012. Theo báo cáo của Chi cục Thú y, mặc dù diện tích vùng nuôi tôm bị ảnh hưởng bởi AHPND giảm từ năm 2012 đến năm 2016, số lượng vùng nuôi bị ảnh hưởng tăng từ 192 xã lên 299 xã (Cục Thú y, 2014; 2015; 2016). Vì vậy, việc phân lập và khảo sát độc lực các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm chân trắng tại Thừa Thiên Huế sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn về phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm và cho các bệnh do Vibrio gây ra trên các đối tượng nuôi thuỷ sản khác. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thu và phân lập vi khuẩn từ tôm chân trắng Mẫu tôm chân trắng với các dấu hiệu bệnh lý điển hình như dạt bờ, gan tụy nhạt màu, teo nhỏ, ruột màu trắng nhạt không có thức ăn được thu từ các ao nuôi tại xã Điền Hương, huyện Phong Điền và xã Phú Thuận huyện Phú Vang từ tháng 2 đến tháng 9 năm 2019. Dùng cồn 70 khử trùng mặt ngoài cơ thể tôm, rồi dùng dao mổ tiệt trùng rạch một đường trên khối gan tụy. Sử dụng que cấy nhựa vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm từ khối gan tụy và cấy lên đĩa môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS) Agar (HiMedia, Ấn Độ. Đĩa cấy được ủ ở 28°C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường TCBS Agar được ghi nhận về màu sắc, hình dạng và kích thước, sau đó các khuẩn lạc màu xanh được cấy chuyền sang môi trường CHROMagar. Các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường CHROMagar giữ ở -80°C trong môi trường 15% glycerol để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2. Định danh vi khuẩn 2.2.1. Xác định một số chỉ tiêu về hình thái, sinh lý, sinh hoá Hình dạng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa được xác định dựa theo cẩm nang của Cowan và Steels (Barrow & Feltham, 1993) và sử dụng kit API 20E (BioMerieux, Pháp). Chủng V. parahaemolyticus STIR0012014 từ Đại học Stirling, Vương quốc Anh được sử dụng để so sánh. Nghiên cứu độc lực của một số chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi tại Thừa Thiên Huế 204 2.2.2. Định danh vi khuẩn bằng môi trường phân lập đặc trưng CHROMagarTM Vibrio Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường TCBS, được lựa chọn để cấy chuyền sang môi trường CHROMagarTM Vibrio (CHROMagar Microbiology, Pháp) để xác định màu sắc, hình dạng và được định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.3. Khảo sát các yếu tố độc lực của vi khuẩn trong điều kiện in vitro 2.3.1. Sàng lọc các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus tạo khuẩn lạc màu tím hoa cà trên môi trường CHROMagar được sàng lọc có khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp bằng bộ test IQ Plus™ AHPND/EMS Plasmid Kit trên máy PCR Pockit Express (GeneReach Biotechnology Corporation, Đài Loan) theo hướng dẫn sản phẩm của nhà sản xuất dùng để xác định các chủng V. parahaemolyticus có mang AHPND/EMS plasmid chứa gen PirA và PirB phá huỷ khối gan tụy tôm. 2.3.2. Khả năng di động của vi khuẩn Tính di động của vi khuẩn được thực hiện trên đĩa pestri nhựa có chứa môi trường Trypto- casein soy broth (TSB) và 0,3% agar (Natral & cs., 2011). 10µL huyền phù vi khuẩn (ở mật độ 106 cfu/mL) được nhỏ ở giữa đĩa thạch và đường kính di động của vi khuẩn được đo sau 24h (giờ) ủ ở 28C. 2.3.3. Hoạt tính thuỷ phân của enzyme: caseinase, haemolysin và phospholipase Tất cả các thí nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn của Natrah & cs. (2011). Hoạt tính thuỷ phân của enzyme caseinase, phospholipase và hoạt tính dung huyết được thực hiện bằng cách nhỏ 10µL huyền phù vi khuẩn lần lượt lên môi trường Tryptone casein soy agar (TSA) có chứa 4% bột sữa tách béo (Woolworths, Úc) hoặc môi trường TSA có bổ sung 1% egg yolk emulsion (Sigma-Alrich) hoặc đĩa thạch máu (5% máu cừu). Các đĩa thạch thí nghiệm ủ ở 28C, xác định đường kính khuẩn lạc và vòng thuỷ phân sau 48-72 giờ. Các thí nghiệm được bố trí với 6 lần lặp lại cho mỗi hoạt tính nghiên cứu. 2.3.4. Xác định khả năng tan máu tôm trên môi trường Rose-Bengal Khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được xác định dựa trên hoạt động thủy phân tế bào máu tôm trên môi trường Rose- Bengal (Chang & cs., 2000). Cho 1mL máu tôm vào 15mL Rose Bengal agar (Himedia, Ấn Độ) đã được hấp tiệt trùng và để nguội 45-50C, lắc nhẹ sau đó cấy vi khuẩn Vibrio, ủ ở nhiệt độ 28C trong 24 giờ. Khi không có sự xuất hiện của các vòng dung huyết (mất màu đỏ của môi trường) xung quanh khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn không có khả năng dung giải các tế bào máu tôm. 2.4. Xác định khả năng gây bệnh trong điều kiện in vivo và liều gây chết 50% tôm cảm nhiễm Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trong bể nhựa (80L) đã được khử trùng. Sau đó cấp nước mặn 20‰ vào khoảng 2/3 thể tích và sục khí liên tục. Tôm thí nghiệm: Tôm chân trắng có trọng lượng 2-2,5 g/con, kích cỡ đồng đều, màu sắc tươi sáng, và đã được kiểm dịch không mang mầm bệnh AHPND, bệnh đốm trắng (White spot disease- WSD), bệnh đầu vàng (Yellow head diseases- YHD) tại Trạm xá Thú y, Chi cục Chăn nuôi và Thú y Thừa Thiên Huế. Trước khi tiến hành thí nghiệm, 10 con tôm được chọn ngẫu nhiên để kiểm tra vi khuẩn bằng cách lấy mẫu gan tụy cấy trực tiếp trên môi trường TSA (có bổ sung 2% NaCl) và môi trường TCBS. Chuẩn bị vi khuẩn: chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus TTH010101001 được phân lập từ các ao nuôi ở huyện Phong Điền (chủng gây bệnh AHPND) và chủng vi khuẩn TTH020201001 (chủng không gây bệnh AHPND) phân lập từ ao nuôi tôm ở xã Phú Thuận được dùng để nghiên cứu khả năng gây Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Thị Xuân Hồng, Nguyễn Công Chung 205 bệnh và liều gây chết LD50. Vi khuẩn được nuôi tăng sinh 24 giờ ở 28C trong môi trường TSB (có bổ sung 2% NaCl), sau đó ly tâm và rửa 2 lần bằng dung dịch NaCl 0,85%. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ (bước sóng 600 nm) kết hợp với đếm số khuẩn lạc trên môi trường TSA+ 2% NaCl. Thí nghiệm xác định giá trị LD50 được bố trí trên 7 nghiệm thức bao gồm: 6 nghiệm thức thí nghiệm (tôm được ngâm với một trong sáu mật độ các chủng vi khuẩn trên từ 1 × 108 đến 1 × 103 cfu/mL trong 60 phút) và 1 nghiệm thức đối chứng (tôm được ngâm với nước muối sinh lý (0,85% NaCl) vô trùng trong 30 phút). Mật độ nuôi 20 con/bể. Tôm sau khi cảm nhiễm được nuôi với hệ thống nước chảy tốc độ 14 L/phút, nhiệt độ 28-30C. Cho ăn hằng ngày với khối lượng tương đương 2% trọng lượng thân bằng thức ăn CP (Việt Nam). Sục khí liên tục 24 giờ/ngày. Tỷ lệ chết được theo dõi trong 14 ngày. Giá trị LD50 được xác định theo phương pháp của Reed & Muench (1938). Dựa vào số lượng tôm chết ở các nghiệm thức để tính LD50 theo công thức sau: LD50 = 10 a-x Trong đó: a là số luỹ thừa mà tại đó vi khuẩn gây tôm chết thấp nhất (trên 50%) x được tính dựa vào công thức: x = (Pa – 50)/(Pa – Pu) Với: Pa là tỷ lệ chết cận trên và Pu là tỷ lệ chết cận dưới của liều gây chết 50%. 2.5. Xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Exel 2016 để tính giá trị trung bình và độ lẹch chuẩn. Phân tích ANOVA một nhân tố trong phân mềm SPSS 20.0 để so sách các giá trị trung bình ở mức p <0.05 bằng phép thử Duncan . 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nuôi cấy, phân lập vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm chân trắng Vibrio thường gây tác hại lớn cho tôm ở giai đoạn nuôi dưới 30 ngày tuổi, có trường hợp gây chết 100%, ở giai đoạn sau 30 ngày tuổi, Vibrio chỉ gây chết tôm khi các yếu tố môi trường trong ao nuôi không tốt hay biến động lớn do mưa hay sự biến động của tảo (Loc Tran & cs., 2013; Flegel, 2012), chính vì vậy, trong nghiên cứu này tập trung nghiên cứu độc lực của vi khuẩn V. parahaemolyticus trên tôm chân trắng giai đoạn 30-40 ngày tuổi. Ba mươi (30) mẫu tôm với dấu hiệu mềm vỏ, gan tôm nhạt màu được thu từ 5 ao thuộc xã Điền Hương và Phú Thuận với chiều dài và trọng lượng được thể hiện ở bảng 1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ 30 mẫu tôm bệnh trên môi trường TCBS cho 2 dạng khuẩn lạc với màu sắc khác nhau: khuẩn lạc vàng và khuẩn lạc xanh. Tuy nhiên, khi cấy 30 chủng này lên môi trường CHROMagar thì chỉ có 8/30 chủng cho khuẩn lạc có màu tím hoa cà và kết quả định danh bằng kit API 20E (BioMerieux) cho kết luận 8 chủng này là V. parahaemolyticus. Không thấy có sự xuất hiện các khuẩn lạc màu khác. Điều này cho thấy không phân lập được V. alginolyticus hay V. vulnificus/Vibrio cholera trong mẫu tôm bị bệnh gan tụy ở Thừa Thiên Huế. Bảng 1. Kích thước (chiều dài, và trọng lượng) của mẫu tôm ở các đợt thu mẫu Đợt thu mẫu Thời gian thu mẫu Địa điểm thu mẫu Giai đoạn (ngày tuổi) Số lượng Chiều dài (cm) (TB ± SD) Trọng lượng(g) (TB ± SD) 1 12/3/2019 Điền Hương Postarvae (30-35) 06 5,4 ± 0,8 2,2 ± 0,8 Phú Thuận 04 5,5 ± 0,7 2,6 ± 0,6 2 12/7/2019 Điền Hương Postarvae (30-35) 05 4,6 ± 0,6 2,1± 0,5 Phú Thuận 04 6,5 ± 0,7 3,3 ± 0,4 3 13/8/2019 Điền Hương Tôm thương phẩm (40) 06 9,6 ± 0,8 6,6 ± 0,4 Phú Thuận 05 10,2 ± 0,7 8,3 ± 0,3 Nghiên cứu độc lực của một số chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi tại Thừa Thiên Huế 206 3.2. Đặc điểm sinh hoá các chủng vi khuẩn V. parahamolyticus phân lập được Các chủng vi khuẩn V. parahamolyticus phân lập khá đồng nhất về đặc điểm sinh hoá (Bảng 2) và trùng với đặc điểm sinh hoá của chủng đối chứng STIR0012014. Các chủng vi khuẩn này đều có khả năng di động, cho phản ứng dương tính với Oxidase, Lysine Decarboxylase, Glucose, Indol, có khả năng khử Nitrate thành Nitrite và đều tạo khuẩn lạc có màu xanh trên môi trường TCBS và màu tím hoa cà trên môi trường CHROMagar. 3.3. Kết quả khảo sát các yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được trong điều kiện in vitro Kết quả sàng lọc các chủng V. parahamolyticus phân lập được có khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm bằng bộ test IQ Plus™ AHPND/EMS Plasmid Kit được thể hiện ở bảng 3 và hình 1. Trong 8 chủng V. parahaemolyticus phân lập được chỉ có 4 chủng TTH010101001, TTH010201003, TTH010202003, TTH010103002 là có khả năng gây bệnh AHPND (Hình 1). Hai chủng V. parahaemolyticus TTH020201001 và TTH020202001 không gây bệnh AHPND trên tôm nuôi. Một số yếu tố độc lực như khả năng sản sinh các loại enzyme (caseinase, phospholipase), khả năng di động, hoạt tính dung huyết trên các loại môi trường thạch máu của các chủng vi khuẩn được trình bày ở bảng 4. Kết quả khảo sát một số yếu tố độc lực của 8 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập được cho thấy 4 chủng vi khuẩn TTH010101001, TTH010201003, TTH010202003, TTH010103002 là những chủng mang gen độc lực trên plasmid có khả năng phá huỷ gan tụy tôm đều sản sinh caseinae (Hình 3A), phospholipase, di động (Hình 3B) và khả năng tan huyết (Hình 4A) cao hơn các chủng còn lại (P <0,05) (Bảng 5), chứng tỏ độc lực của các chủng này cao hơn các chủng còn lại. Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa của các chủng V. parahaemolyticus phân lập được từ mẫu tôm bệnh và chủng STIR0012014 (Đại học Stirling, Vương quốc Anh) được sử dụng làm kết quả so sánh STT Chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hoá V. parahaemolyticus STIR0012014 Tỷ lệ % chủng vi khuẩn phân lập Dương tính Âm tính 1 Gram - 100 0 2 Hình dạng Que ngắn Que ngắn 3 Phát triển trên TCBS Xanh 100 4 Phát triển CHROMagar Tím 100 0 5 Di động + 100 6 Oxidase + 100 7 Lysine Decarboxylase + 100 8 Glucose + 87,5 12,5 9 Nitrate thành Nitrite + 87,5 12,5 10 ONPG - 100 11 Sinh Urease - 100 12 Phenyl Alanine Deaminase - 100 13 Citrate - 100 14 Esculine - 100 15 H2S - 100 16 Indol + 100 0 17 Voges - Proskauer - 100 18 Sử dụng Malonate - 12,5 87,5 Ghi chú: (+): phản ứng dương tính; (-) phản ứng âm tính. Bảng 3. K Địa điểm thu m Điền Hương Phú Thuận Ghi chú: (*): Chủng đ Ghi chú: 3: chủng TTH010202003, Hình 1. K Bảng 4. M Chủng TTH010101001 TTH010201003 TTH010301001 TTH010202003 TTH010103002 TTH010203001 TTH020201001 TTH020202001 Ghi chú: Giá tr (P <0,05); (* ) ch ết quả sàng l ẫu Đợt thu m (+): kết quả ộc lực. (+): dương tính; ( ết quả xác đ AHPND/EMS Plasmid Kit tr ột số yếu t Caseinase * 22,0 a ± 1,0 * 22,0 a ± 0,6 18,0 b ± 0,5 * 23,0 a ± 1,0 * 22,0 a ± 0,6 17,0 b ± 0,4 17,0 b ± 1,0 18,0 b ± 0,4 ị trung bình trong ủng gây b ọc các ch ẫu Chủ 1 TTH010101001 TTH010201003 TTH010301001 2 TTH010202003 3 TTH010103002 TTH010203001 1 TTH020201001 2 TTH020202001 dương tính- -): âm tính; 1: ch 4: chủng TTH010103002, 5: đ ịnh gen ( ố độc lực c Đư Phospholipase 17,0 c ± 0,5 18,0 c ± 0,6 16,0 d ± 0,5 19,0 c ± 0,5 19,0 c ± 0,6 16,0 d ± 0,5 15,0 d ± 0,5 16,0 d ± 0,5 cùng m ệnh AHPND Nguy ủng vi khu trên bằng phương pháp PCR ng vi khuẩn * * * * gây bệnh AHPND; ( ủng PirA và PirB) ủa các ch trong thí nghi ờng kính vùng ho Di độ 37,0 e ± 0,5 37,0 e ± 0,5 31,0 f ± 0,3 37,0 e ± 0,5 37,0 e ± 0,5 31,0 f ± 0,3 30,0 f ± 0,5 32,0 f ± 0,3 ột cột vớ . 1 2 ễn Ngọc Phư ẩn V. parahaemolyticus Kết quả định danh trên môi trư V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus -): kế TTH010101001, 2: ch ối ch gây ho ên m ủng vi khu ệm ạt động (mm) ( ng Tan huy i các chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa v 3 4 ớc, Nguyễn Th t quả âm tính tính ủng TTH010201003, ứng âm. ại tử gan t áy PCR cầm tay Pockit ẩn V. parahaemolyticus in vitro giá trị trung bình ết trên thạch máu c 17,0 g ± 0,5 18,0 g ± 0,6 15,0 h ± 0,5 19,0 g ± 0,5 18,0 g ± 0,6 15,0 h ± 0,5 15,0 h ± 0,5 16,0 h ± 0,5 5 ị Xuân Hồ gây b ờng CHROMagar - không gây b ụy bằng b ± độ lệch chu ừu Tan máu tôm ng, Nguyễn Công Chung ệnh hoại t Gây bệnh AHPND ệnh AHPND ộ test IQ Plus phân l ẩn) trên Rose (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) ề m 207 ử cấp + + - + + - - - ; ™ ập được - Bengal ặt thống kê Nghiên cứu đ tôm chân trắ 208 Vi khu chuyển chuyên hoá cao nh tử nhỏ. Đ trường tự và giải phóng enzyme ra bên ngoài. hai loại enzyme ngo phân cắt các phân cho vi khu ngoại bào này có s Loại khác là nh độc lực và có liên quan đ nhưng bả gây bệnh đư loại khác chưa đư Enzyme đư gây bệnh tương tác v nhau của mô kí ch phần tạo ra đ phần vào quá trình gây b mô của ký ch dịch của ký ch Một s geletinase của nhiề Aeromonas điểm bệnh lý c này gây ra (Woo & cs., 2011). Trong khi đó, kh một thuộc tính lâu đ liên hệ (chemotaxis) gradient c ộc lực của m ng (Litopenaeus va và di động (B) c ẩn đã phát tri ể sử dụng các phân t nhiên của sinh v tử ẩn có thể ự ững enzyme ngo n thân chúng r ợc biết rõ v ợc sản sinh ra b ủ ộc lực. Các enzyme kh ủ hoặc vô hi ủ (Holder, 2018). ố enzyme là những y u vi khuẩ và liên quan tr ủa nhữ chặt chẽ - khả ủa một hoá ch ột số chủng vi khu nnamei) Hình 3. Kh ủa ch ển các h ằm hấ ử ật, vi khu ại bào. Một lo có trọng lư hấp thu đư chuyên bi ạ ến khả ất ít độ ới hyaluronidase, còn các ợc chứng minh đ ởi m ới các thành ph nhiễm bệ ệnh bằng cách phá hu ệu hoá các cơ ch ngoại bào như caseinase, ếu tố độc l n gây bệnh như ực ti ng bệnh do nhóm vi khu ả năng di đ ời của vi khu với hoá hư năng định hư ất nhấ ẩn Vibrio parahaemolyticus nuôi tại Thừa Thiên Hu ả năng s ủng vi khu ệ thống v p thu các phân lớn trong môi ẩn tổng h Vi khuẩ ại dùng cho ợng lớn để giúp ợc. Các enzyme ệt cơ chất l i bào có vai trò năng gây bệ c tính. Vai ầy đ ột số vi khu ần khác nh, vì vậy góp ác vẫn góp ế mi ực quan tr Vi ếp đến đ ộng được cho là ẩn. Nó có m ớng đ ớng theo t định. Sự ế ản sinh caseinase (A) ẩn V. parahaemolyticus ận ợp n có ớn. nh, trò ủ. ẩn ỷ ễn ọng bio, ặc ẩn ối ộng kết hợp khu Tiên mao đóng vai trò như công c khu trong giai đo (Josenhans & Suerbaum, 2002). Các ch khu đều có kh không gây b bệnh đóng vai trò quan tr đầu c của tôm nuôi. phospholipase c AHPND trong nghiên c chủ có th màng t công vào ký ch Phospholipase t dạng c năng thu của phospholipid v như ho béo. Ho đượ bệnh c vi khu hội ch mô trên di Tuy nhiên cho đ phospholipase trong đi đượ A gây bệ giữa di động và hoá hư ẩn phát hi ẩn tiếp cận và bám vào b ạ ẩn gây bệnh AHPND trong nghiên c ả năng di đ ệnh. S ủa quá trình gây nhi Bên cạnh đó, kh ng không gây b ể liên quan đ ế bào giúp các ch ủa các enzyme lipolytic có chung kh ỷ phân m ạt động thu ạt tính phospholipase c c chứng minh có liên quan ủa nhiều vi khu ẩn Gram (+) và Gram ( ứng bệnh ện r c làm rõ. Nhi nh hoại tử gan t TTH010101001 ện và tiếp c n đầu của quá trình kí sinh ộng m ự di độ ễ ủa các chủng vi khu ứu này cũng cao hơn các ệnh cho th ến quá trì ủ ủ (Istivan & Coloe ạo thành m ột hoặc nhi ới phosph ỷ phân acyl thành các a ẩn khác nhau bao g khác nhau như s ộng gây hi ến nay, cơ ch ều ki ều nghiên c B ụy cấp (AHPND) trên ớng động cho phép vi ận chất dinh dư ề mặt c ạnh hơn các ch ng của vi khu ọng trong giai đo m lên tế bào gan t ả năng s ẩn gây b ấy phospholipase nh phá hu ng vi khuẩ ột phân nhóm đa ều liên k odiesterase cũng ủa vi khu đến khả -), gây ra nh ự phá hu ện tượng ho ế hoạt đ ện in vivo ứu đã chứ ỡng. ụ giúp vi ủa kí chủ ủng vi ứu này ủng ẩn gây ạn ụy ản sinh ệnh ỷ lớp n này tấn , 2006). ả ết ester xit ẩn đã năng gây ồm cả ững ỷ biểu ại tử da. ộng của vẫn chưa ng minh, màng ngoài c phospholipase đư vì vậy nó ch thương mô trong quá trình gây nhi & Coloe, 2006). Mặc dù các ch gây tan huy chủng phân l máu tôm trên môi trư B) chứng t thống tuầ hợp với các nghiên c V. parahaelolyticus cs. (2013) b ra chỉ giới h điểm bệnh tích chia thành hai giai đo đoạn cấp tính đư Hình 4. Ch máu c Hình 5 ủa nhi ợc ti ịu trách nhi ủng vi khu ết trên th ập được đ ỏ các chủng này không gây b n hoàn. Kế ứ gây ra trên tôm. Theo Loc & ệnh lý do ạn trong gan t ợc th ủng V. parahaemolyticus ừu (A) nhưng không phá v . Tỷ lệ ch 0 20 40 60 80 100 1 Tỷ lệ chết cộng dồn ều loài vi khu ết ra nhằm gây đ ệm cho các t ẩn phân l ạch máu c ều không ờng Rose- t quả này hoàn toàn phù u trước đây v V. parahaemolyticus ụy của tôm v ể hiện bằ ết cộng d 2 3 (%) 10 8 cfu/mL 10 7 cfu/mL 10 6 cfu/mL 10 5 cfu/mL 10 4 cfu/mL 10 3 cfu/mL Nguy ẩn ho ộc tế ễm (Istivan ập đ ừu nhưng c làm vỡ tế Bengel (Hình 4 ệnh ở ề bệnh lý do ới các đ ạn. Giai ng sự thay đ TTH010201003 có kh ỡ ồn (%) của tôm chân tr 4 5 ễn Ngọc Phư ặc bào, ổn ều ả 8 bào hệ gây ặc ổi bất thư tụy, v thành tích đư tế bào máu trong và gi xuấ cừu cho th này có th gây b Lightner & cs. (2012) cho th parahaemolyticus miệ hóa tôm, t loạn ch của tôm nhưng không gây r tuầ máu tôm trên môi trư 6 7 A ớc, Nguyễn Th ờng của các t ới sự bong tróc c ống lượn. ợc thể hi t hiện của các Khả năng làm tan huy ấy các ch ể gây b ệnh cho ng ng, sau đó chúng xâm nh ạo ra ức năng c n hoàn. ả năng làm tan huy ắng cảm nhi 8 9 ị Xuân Hồ ế bào bi ấp tính các Ở giai đoạ ện với sự xu ữa các ổ vi khuẩ ủng ệnh trên đ ười (FAO, 2016) tuy nhiên được lây truy độc tố gây phá h ủa gan tụ ờng Rose ễm với 10 11 B ng, Nguyễn Công Chung ểu mô ống lư t n cuối của b ất hiện các ống lư n trong gan t ết trên th V. parahaemolyticus ộng vật nhưng không ấy vi khu ền qua đư ập qua đư ủy mô, làm r y và cơ quan tiêu hóa ối loạn h ết trên th -bengal (B) TTH010101001 Ngày 209 ợn gan ế bào cấu ệnh, bệnh ổ viêm tụ ợn, có sự ụy. ạch máu ẩn V. ờng ờng tiêu ối ệ thống ạch Nghiên cứu độc lực của một số chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi tại Thừa Thiên Huế 210 3.4. Khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được trong điều kiện in vivo Sau 14 ngày cảm nhiễm, chủng vi khuẩn TTH020201001 (không mang gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp) không gây ra tỷ lệ chết ở bất kỳ nghiệm thức nào. Tôm không có dấu hiệu bệnh lý, sau khi kết thúc thí nghiệm không tái phân lập được vi khuẩn V. parahaemolyticus từ khối gan tụy của tôm ở các nghiệm thức thí nghiệm hay đối chứng. Trong khi đó, tỷ lệ chết ở các nghiệm thức ngâm chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus TTH010101001 (mang gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp) phụ thuộc vào nồng độ vi khuẩn đưa vào ban đầu và được thể hiện ở hình 5. Gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp ngâm không gây căng thẳng cho tôm như phương pháp tiêm và giống với điều kiện thực tế, tuy nhiên diễn biến bệnh lý sẽ chậm hơn (Ngoc Phuoc & cs., 2020). Trong nghiên cứu này, tôm thể hiện bệnh lý sau 3 ngày cảm nhiễm và tỷ lệ chết chấm dứt sau 9 ngày cảm nhiễm. Tôm bị bệnh có dấu hiệu bệnh lý điển hình của bệnh hoại tử gan tụy cấp như tôm bị mềm vỏ, khối gan tụy teo và nhạt màu, ruột không có thức ăn. Vi khuẩn tái phân lập từ mẫu gan tụy được định danh là V. parahaemolyticus bằng kit API 20E. Như vậy, kết quả thử nghiệm khả năng gây bệnh trên tôm của chủng TTH010101001 thoã mản định đề Kock về xác định tác nhân gây bệnh (Ngoc Phuoc & cs., 2020). Từ kết quả số lượng tôm chết ở các thí nghiệm, liều gây chết 50% (LD50) của chủng TTH010101001 là 105 cfu/mL. 4. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã phân lập được 8 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên mẫu tôm chân trắng bị bệnh tại Thừa Thiên Huế. Các chủng vi khuẩn phân lập được khá đồng nhất về mặt sinh hoá. Có 4/8 chủng V. parahaemolyticus mang gen gây bệnh hội chứng gan tụy cấp, các chủng này có khả năng di động, hoạt động thuỷ phân của các enzyme như caseinase, phospholipase, haemolysin mạnh hơn các chủng không mang gen gây bệnh. Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho thấy chủng không mang gen độc lực không gây bệnh trên tôm. Trong khi đó, chủng mang gen độc lực gây bệnh trên tôm sau 3 ngày cảm nhiễm với dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của bệnh hoại tử gan tụy cấp ngoài tự nhiên. Giá trị LD50 của chủng V. parahaemolyticus mang gen độc lực là 105 cfu/mL. TÀI LIỆU THAM KHẢO Austin X.H. & Zhang B. (2006). Vibrio harveyi: a significant pathogen of marine vertebrates and inverterbrates. Letter in Application Microbiology. 43:119–124. Barrow G.I. & Feltham R.K.A. (1993). Cowan and Steel‘s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn. Cambridge Univesity Press, Cambridge. p. 262. Chang C.F., Chen H.Y., Su M.S. & Liao I.C. (2000). Immunomodulation by dietary beta-1, 3-glucan in the brooders of the black tiger shrimp Penaeus monodon. Fish Shellfish Immunol. 10(6):505-14. Corteel M. (2016). A holistic management approach to EMS. Retrieved from gaalliance. org/a-holistic- management-approach-to-ems, February 24, 2020. Cục Thú y (2014). Báo cáo hàng năm về dịch bệnh trên động vật thuỷ sinh năm 2014. Cục Thú y (2015). Báo cáo hàng năm về dịch bệnh trên động vật thuỷ sinh năm 2015. Cục Thú y (2016). Báo cáo hàng năm về dịch bệnh trên động vật thuỷ sinh năm 2016 và kế hoạch năm 2017. De Schryver P., Defoirdt T. & Sorgeloos P. (2014). Early mortality syndrome outbreaks: a microbial management issue in shrimp farming. PLoS pathogens. 10(4): e10033919. FAO (2013). Report of the FAO/MARD Technical workshop on early mortality syndrome (EMS) or acute hepatopancreatic necrosis syndrome (AHPNS) of cultured shrimp (under TCP/VIE/3304). FAO fisheries and aquaculture report No. 1053, Ha Noi, Vietnam, 54 pp. ISSN 2070-6987. FAO (2016). FAO second international technical seminar/workshop on acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). There is a way forward. FAO technical cooperation programme; TCP/INT/3501 and TCP/INT/3502. Sukosol Hotel, Bangkok, Thailand, 23-25 June 2016. Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Thị Xuân Hồng, Nguyễn Công Chung 211 Flegel T.W. (2012). Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia. Journal of Invertebrate Pathology. 110: 166-173. Hara-Kudo Y., Nishina T., Nakagawa H., Konuma H., Hasegawa J. & Kumagai S. (2001). Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Applycation and Environmental Microbiology. 67: 5819-5823. Holder I.A. (2018). Bacterial enzymes and vỉulence. CRC Press. Taylor & Francis Group. Istivan T.S. & Coloe P.J. (2006). Phospholipase A in Gram-negative bacteria and its role in pathogenesis. Microbiology. 152(5): 1263-1274. Josenhans C. & Suerbaum S. (2002). The role of motility as a virulence factor in bacteria. International Journal of Medical Microbiology. 291(8): 605-614. Kondo H., Tinwongger S., Proespraiwong P., Mavichak R., Unajak S.M., Nozaki R. & Hirono I. (2014). Draft genome sequence of six strains of Vibrio parahaemolyticus isolated from early mortality syndrome/acute hepatopancreatic necrosis disease shrimp in Thailand. Gnome Announc. 2: e00221. Kondo H., Van P.T., Dang T.L. & Hirono I. (2015). Draft genome sequence of non-Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease strain KC13.17.5, isolated form diseased shrimp in Vietnam. Genome announc. 3(5): e00978-15. Lee C.T., Chen I.T., Yang Y.T., Lien I.H. & Lo C.F. (2014). Involvement of Pir toxin of Vibrio parahaemolyticus in inducing acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp. Paper presented at the 9th symposium on disease in Asian aquaculture (DAA9), Ho Chi Minh city, Vietnam, 24-28 November, 2014. Lightner D.V., Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.L. & Loc T. (2012). Early mortality syndrome affects shrimp in Asia. Global aquaculture advocate January/February. p. 40. Lightner D.V. (2014). Documentation of a unique strain of Vibrio parahaemolyticus as the agent of early mortality syndrome (EMS) or acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) affecting Penaeid shrimp with note on the putative toxins. Paper presented at the 9th symposium on disease in Asian aquaculture (DAA9), Ho Chi Minh city, Vietnam, 24-28 November. Lo C.F., Lee C.T., Chen I.T., Yang Y.T. & Wang H.C. (2014). Recent advances in the newly emergent acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). Paper presented at the 9th symposium on disease in Asian aquaculture (DAA9), Ho Chi Minh city, Vietnam, 24-28 November. Loc T., Linda N., Rita M.R., Leone L.M., Carlos R.P., Kevin F. & Lightner D.V. (2013). Determination of the infectous nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms. 105(1): 45-55 Nakashima Y., Oho M., Kusaba K., Nagasawa Z., Komatsu O., Manome I., Araki K., Oishi H. & Nakashima M. (2007). A chromogenic substrate culture plate for early identification of Vibrio vulnificus and isolation of other marine Vibrios. Annals of Clinical and Laboratory Science. 37(4): 330-4. Natrah F.M., Ruwandeepika H.A., Pawar S., Karunasagar I., Sorgeloos P., Bossier P. & Defoirdt T. (2011). Regulation of virulence factors by quorum sensing in Vibrio harveyi. Veterinary Microbiol. 154: 124-9. Ngoc Phuoc N., Richards R. & Crumlish M. (2020). Establishing bacterial infectivity models in striped Catfish Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage) with Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 43: 371-378. Thompson F.L., Iida T. & Swings J. (2004). Biodiversity of Vibrios. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 68: 403-431. Tinwongger S., Proespraiwong P., Thawosuwan J., Sriwanayos P., Kongkunmerd J., Chaweepack T., mavichak R., Unajak S., Nozaki R., Kondo H. & Hirono I. (2014). Development of PCR diagnosis for shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) strain of Vibrio parahaemolyticus. Fish Pathol. 49: 159-164. Tổng cục thuỷ sản (2012). Báo cáo tóm tắt Quy hoạch tổng thể phát triển ngành thủy sản đến năm 2020, tầm nhìn 2030. tr. 74-82. Woo P.T., Leatherland J.F. & Bruno D.W. (2011). Fish diseases and disorders, Volume 3: Viral, bacterial and fungal infections. Retrieved from https://www.cabi.org/bookshop/book/978 1845935 542, on February 2, 2020. Yang Y.T., Chen I.T., Lee C.T & Chen C.Y. (2014). Draft genome sequence of four strains of Vibrio parahaemolyticus, three of which cause early mortality syndrome/acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp in China and Thailand. Gonome Announc. 2: e00816. Zorriehzahra M.J. & Banaederakhshan R. (2015). Early mortality syndrome (EMS) as new emerging threat in shrimp industry. Adv. Amin. Vet. Sci. 3(2s): 64-72.