Nghiên cứu độc tính và tác dụng an thần của cao bình vôi – lạc tiên – lá sen – lá vông nem trên chuột nhắt trắng

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 130 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG AN THẦN CỦA CAO BÌNH VÔI – LẠC TIÊN – LÁ SEN – LÁ VÔNG NEM TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyễn Văn Đàn*, Phan Quan Chí Hiếu* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Công thức thuốc có nguồn gốc từ bài thuốc điều trị mất ngủ do GS. Bùi Chí Hiếu đề xướng, gồm 4 vị Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem. Công thức trên cần phải được khẳng định tính an toàn cũng như các tác dụng dược lý bằng các mô hình dược lý thực nghiệm. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát độc tính và tác dụng an thần của cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem. Phương pháp nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, các tác dụng an thần và độc tính của cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem được đánh giá với các mô hình thử nghiệm trên thú vật. Tác động an thần được đánh giá bằng cách đo lường việc kéo dài thời gian ngủ mê của chuột gây ra bởi thiopental và tác dụng giải lo âu đánh giá bằng mô hình hai ngăn sáng tối. Kết quả: Cao chiết liều 1,97 g/kg không có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của thiopental sau 30 phút sử dụng, chỉ thể hiện sau 60 phút sử dụng. Trong khi liều 3,94 g/kg khẳng định tác dụng sau 30 và 60 phút sử dụng. Sau 60 phút, cao chiết liều 3,94 g/kg hiệu quả gây ngủ tăng hơn gấp 1,9 lần so với Sen vông-R liều 40 mg/kg. Cả hai liều không thể hiện tác dụng giải lo âu tại thời điểm 30 và 60 phút sử dụng. Chưa xác định được LD50 và độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng theo đường uống. Kết luận: Cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem có tác dụng hợp đồng gây ngủ với thiopental. Từ khóa: Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem, an thần, giải lo âu, mất ngủ. ABSTRACT RESEARCH ON THE TOXICITY AND SEDATIVE-HYPNOTIC EFFECTS OF TUBER STEPHANIAE - HERBA PASSIFLORAE FOETIDAE - FOLIUM ERYTHRINAE - FOLIUM NELUMBINIS EXTRACT ON MICE Nguyen Van Dan, Phan Quan Chi Hieu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 130 - 135 Background: Formulation proposed by Ph.D. Hieu Bui Chi, including Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis for the treatment of insomnia. It is necessary to evaluate pharmacological activities and toxicity of this formula in animal models. Aims of study: Evaluate the hypnotic-anxiolytic effects and toxcity of Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis extract on mice. Materials and Method: In this present study, the anxiolytic-hypnotic effects of extract were evaluated in animal models when administered oral route. The light-dark test were used to evaluate the anxiolytic effect. The hypnotic effect was evaluated by measuring potentiation of thiopental sleeping time in mice. * Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Ths.BS Nguyễn Văn Đàn ĐT: 0983731326 Email:vandan2685@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 131 Results: Extract given orally at the dose of 1.97 g/kg prolonged the thiopental induced sleep time after 60 minutes and the dose of 3.94 g/kg prolonged the thiopental induced sleep time after 30 minutes and 60 minutes, both of them did not shown to have anxiolytic activities. After 60 minutes, extracts at dose of 3.94 g/kg of hypnotic effect more than 1.9 times the Sen vong-R at the dose of 40 mg/kg. LD50 and chronic toxicity has not been determined by orally. Conclusion: Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis extract were found to have the hypnotic activity. Keywords: Tuber Stephaniae, Herba Passiflorae foetidae, Folium Erythrinae, Folium Nelumbinis, anxiolytic effect, hypnotic effect, insomnia. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, chứng mất ngủ ngày càng phổ biến với nhiều yếu tố nguy cơ và nguyên nhân. Tác động tích lũy lâu dài của mất ngủ liên quan với nhiều hậu quả sức khỏe nguy hiểm và tác động kinh tế quan trọng. Tuy có nhiều phương pháp điều trị khác nhau như: vệ sinh giấc ngủ, dùng thuốc, nhưng đơn trị liệu thường kém hiệu quả, thời gian điều trị và theo dõi dài, tỉ lệ tái phát cao. Việc điều trị với các nhóm thuốc an thần, chủ yếu là nhóm bezodiazepin gây nhiều tác dụng phụ. Do vậy, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả, ít hoặc không gây tác dụng phụ, giảm chi phí y tế là rất cần thiết. Từ bài thuốc điều trị mất ngủ do GS. Bùi Chí Hiếu đề xướng, gồm Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem(1), là những vị thuốc có tác dụng an thần theo kinh nghiệm dân gian, tuy nhiên công thức trên chưa đánh giá bằng các nghiên cứu, vì vậy mục tiêu nghiên cứu này nhằm khảo sát tính an toàn và hiệu quả an thần của công thức trên thực nghiệm, đó sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo. PHƯƠNG TIỆN- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Cao chiết nước hỗn hợp Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem (1,5-1-1-1), ký hiệu CAT. Hiệu suất chiết 11,59 %, độ ẩm 16,72 % ± 0,02, độ tro toàn phần 1,3 % ± 0,15, độ tro không tan trong acid hydrochloric 0, 14% ± 0,01, định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho các vết có màu sắc và Rf tương tự với mẫu đối chiếu Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem. Hóa chất – Thuốc thử nghiệm - Dụng cụ Diazepam (Valium) liều 5mg/Kg (PO) là thuốc đối chiếu trong mô hình hai ngăn sáng tối. Thiopental liều 40mg/Kg (IV) là thuốc dùng trong mô hình kéo dài thời gian ngủ. Sen vông-R (cao lá Sen, lá Vông nem, Rotundin), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm trung ương 2, là thuốc so sánh trong mô hình hai ngăn sáng tối và mô hình kéo dài thời gian ngủ. Xét nghiệm công thức máu: Máy huyết học hoàn toàn Sysmex KX-21, Nhật. Xét nghiệm Glucose, Urea, Creatinin, AST, ALT máu: Máy sinh hóa Eos Bravo W (Hospitex diagonosis – Italy). Giải phẫu mô học gan, thận được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh -Bệnh viện Chợ Rẫy – Thành phố Hồ Chí Minh. Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino, khỏe mạnh, 6 - 8 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 25 - 32g, cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Chuột được nuôi trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng và đảm bảo chu kỳ 12/12 giờ sáng tối. Chuột được làm quen với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 24 giờ. Kích thích âm thanh, mùi ở phòng thí nghiệm được hạn chế ở mức thấp nhất. Tất cả các thử nghiệm được tiến hành từ 9:00 đến 16:00, ở điều kiện ổn định về nhiệt độ và độ ẩm. Phương pháp khảo sát độc tính cấp (4) Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 132 Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều 6 chuột): Khởi đầu từ liều cao nhất có thể bơm được qua kim đầu tù cho uống. Xác định liều LD0 (liều tối đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100%). Giai đoạn xác định: chuột được chia lô và cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0 và LD100 chia theo cấp số nhân. Theo dõi các biểu hiện về hành vi và vận động của chuột trong vòng 72 giờ sau khi dùng thuốc. Ghi nhận số chuột chết trong từng lô. Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Karber-Behrens. Phương pháp khảo sát độc tính bán trường diễn (2) Chuột thử nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 2 lô: - Lô chứng (n=10): Được cho uống nước cất hàng ngày trong 60 ngày. - Lô thử (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/kg người) trong 60 ngày. Thể tích cho chuột uống là 0,2ml/10g thể trọng. Cuối thử nghiệm, ghi nhận và so sánh các chỉ số: số lượng hồng cầu (triệu/mm3), số lượng bạch cầu (ngàn/mm3), tiểu cầu (ngàn/mm3), hemoglobin (g/L), hematocrit (%), AST(U/L), ALT(U/L), creatinin (mg/dL), glucose máu (mg/dL), vi thể gan và thận. Thử nghiệm tác dụng gây ngủ (5, 7) Sau 30 hoặc 60 phút dùng thuốc thử hay chất chứng, tiêm tĩnh mạch thiopental 30 mg/kg chuột. Thời gian chuột ngủ mê được tính từ lúc chuột mất phản xạ thăng bằng cho đến khi chuột có lại phản xạ thăng bằng. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 7 lô như sau: - Lô 1 (n=10): Lô chứng uống nước cất. - Lô 2 (n=10): Uống Sen vông-R liều 40 mg/kg (tính theo cao khô lá sen) (dựa theo nhóm tác giả Nguyễn Lan Thùy Ty, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Hữu Đức (2008)). - Lô 3 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g cao khô/kg chuột (tương đương 8,21 g cao khô/ người 50 kg). - Lô 4 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/ người 50 kg). - Lô 5 (n=10): Uống thuốc Sen vông-R liều 40 mg/kg (tính theo cao khô lá sen). - Lô 6 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g cao khô/kg chuột (tương đương 8,21 g cao khô/ người 50 kg). - Lô 7 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/ người 50 kg). Chuột được cho uống 30 phút trước thử nghiệm đối với lô 1, 2, 3, 4. Đối với lô 5,6, 7 chuột được cho uống 60 phút trước thử nghiệm. Thể tích uống là 0,2 ml/10 g chuột. Sau đó tiêm thiopental đường tĩnh mạch đuôi chuột. Thử nghiệm giải lo âu với mô hình hai ngăn sáng tối (5, 7) Thiết bị thử nghiệm Panlab Black and White box–Tây Ban Nha gồm hộp nhựa Perspex được chia thành hai ngăn: sáng (250 x 250 x 240 mm, lắp bóng đèn trắng 100W) và ngăn tối (160 x 250 x 240 mm, lắp bóng đèn đỏ 40W). Hai bóng đèn cách sàn 370 mm. Hai ngăn thông nhau bởi một cửa có kích thước 70 x 70 mm ở bên dưới, chính giữa hộp. Thời gian và số lần chuột di chuyển vào các ngăn được máy tính ghi nhận thông qua phần mềm chuyên dụng (PPC Win v2.0.03). Chuột được chia ngẫu nhiên thành 4 lô thử nghiệm như sau: - Lô 1 (n=10): Lô chứng, uống nước cất. - Lô 2 (n=10): Lô đối chiếu, uống Diazepam liều 5 mg/kg chuột. - Lô 3 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g cao khô/kg chuột (tương đương 8,21.g cao khô/kg người). - Lô 4 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/kg người). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 133 Chuột được cho uống 30 phút trước thử nghiệm. Thể tích uống là 0,2 ml/10 g chuột. Chuột được đặt ở cửa ngăn cách vùng sáng và tối, hướng ra ngăn sáng. Sau đó chuột được tự do khám phá trong 5 phút. Ghi nhận lại số lần ra vùng sáng của chuột và thời gian ở vùng sáng. Chuột được tính là ra vùng sáng khi cả 4 chân vượt qua lằn phân cách giữa 2 vùng. Ghi nhận tại các thời điểm 30 phút và 60 phút sau khi uống thuốc đối với các lô 3, 4. Còn lô 1 và 2 chỉ ghi nhận tại thời điểm 30 phút sau khi uống. Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm Các dữ liệu được trình bày dưới dạng Mean ± SEM, xử lý bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 với phép kiểm Student cho 2 dãy số liệu độc lập. So sánh sự khác nhau giữa các nhóm có tác dụng gây ngủ bằng phép kiểm ANOVA một chiều, một yếu tố. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p < 0,05. Đồ thị được vẽ theo giá trị Mean ± SEM bằng phần mềm MS. EXCEL 2007. KẾT QUẢ Độc tính cấp D max là 19,7 g cao khô/kg chuột (khoảng 169,95 g dược liệu khô) gấp 257 lần liều thường sử dụng trong ngày (khoảng 24 - 42 g/ngày), không có chuột chết trong vòng 72 giờ. Liều thử nghiệm dò liều tác dụng dược lý trong trường hợp chưa xác định được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đườn g uống gồm liều 1/20, 1/10 và 1/5 D max.(4) Liều có hiệu quả tác dụng dược lý sẽ được lấy làm liều thử độc tính bán trường diễn. Sau khi dò liều có hai liều 1/10 D max (1,97 g cao khô/kg chuột) và 1/5 D max (3,94 g cao khô/kg chuột) thể hiện tác dụng dược lý. Độc tính bán trường diễn Bảng 1: Trị số huyết học, sinh hóa của chuột nhắt sau uống thuốc liều 3,94 g cao khô/kg trong 60 ngày Trị số Lô chứng (n=10) Lô thuốc (n=10) Trước Sau 60 ngày Trước Sau 60 ngày Bạch cầu (ngàn/mm3) 4,49 ± 0,44 5,32 ± 1,01 4,34 ± 0,46 5,8±0,51 Hồng cầu (triệu/mm3) 6,12 ± 0,3 6,23 ± 0,97 5,8 ± 0,21 6,34 ± 0,40 Hemoglobin (g/dL) 10,3 ± 0,36 10,23 ± 0,80 9,53 ± 0,42 10,29 ± 0,82 Hematocrit (%) 36,61 ± 0,12 31,98 ± 0,45 35,78 ± 0,12 32,38 ± 0,24 Tiểu cầu (ngàn/mm3) 363,71 ± 67,79 385,17 ±40,86 398,71 ± 52,18 412,83 ± 48,9 ALT (U/L) 50,51 ± 8,68 43,2 ± 6,94 50,26 ± 2,87 43,4 ± 5,69 AST (U/L) 90,37 ± 8,27 78,1 ± 5,69 89,89 ± 5,25 79,51 ± 4,61 Creatinin (mg/dL) 0,64 ± 0,83 0,67 ± 0, 91 0,65 ± 0,7 0,69 ± 0,88 Trị số huyết học và sinh hóa của chuột nhắt uống cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột, sau 60 ngày đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng uống nước cất (p> 0,05). Hình ảnh giải phẫu mô học gan, thận của chuột uống cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột sau 60 ngày không có sự khác biệt so với lô chứng uống nước cất. Cao CAT không có tác dụng hiệp lực gây ngủ với thiopental ở liều 1,97 g/kg ở thời điểm 30 phút nhưng có tác dụng ở thời điểm 60 phút sau khi sử dụng. Cao CAT có tác dụng hiệp lực gây ngủ với thiopental ở liều 3,94 g/kg ở cả hai thời điểm 30 phút và 60 phút sau khi sử dụng (p<0,01). Lô dùng cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột tại thời điểm 60 phút khác biệt có ý nghĩa thống kê với 3 lô dùng Sen vông-R liều 40 mg/kg chuột tại thời điểm 60 phút, lô dùng cao an thần liều 1,97 g cao khô/kg chuột tại thời điểm 60 phút và lô dùng cao an thần liều 3,94 g cao khô/kg chuột tại thời điểm 30 phút (p < 0,01). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 134 Tác dụng kéo dài thời gian ngủ gây bởi thiopental Hình 1. Ảnh hưởng hiệp lực với thiopental trên thời gian ngủ mê ở các lô uống cao CAT và Sen-Vông-R sau 30 phút và 60 phút sử dụng thuốc, **p <0,01 so với lô chứng. DW: Nước cất. SV1: Sen vông 40mg/kg, sau 30 phút. SV2: Sen vông 40mg/kg, sau 60 phút.CAT1: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 30 phút. CAT2: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 60 phút.CAT3: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 30 phút.CAT4: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 60 phút. Hình 2. Ảnh hưởng hiệp lực với thiopental trên thời gian ngủ mê ở các lô có hiệu lực. Tác dụng giải lo âu trên mô hình hai ngăn sáng tối Hình 3. Số lần ra ngăn sáng của các lô trong thử nghiệm ngăn sáng - tối, (** p < 0,01 so với lô chứng). DW: Nước cất. DZP: Diazepam 5 mg/kg. CAT1: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 30 phút. CAT2: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 60 phút. CAT3: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 30 phút. CAT4: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 60 phút. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 135 So với lô chứng uống nước cất, chỉ có diazepam liều 5 mg/kg (p.o) có tác dụng làm tăng số lần ra ngăn sáng của chuột thử nghiệm. Hình 4. Thời gian chuột ở ngăn sáng của các lô (s) trong thử nghiệm ngăn sáng-tối, * p < 0,05 so với lô chứng. So với lô chứng uống nước cất, chỉ có diazepam liều 5 mg/kg (p.o) có tác dụng làm tăng thời gian ở ngăn sáng của chuột thử nghiệm của chuột thử nghiệm. BÀN LUẬN Cao thuốc nghiên cứu thể hiện tác dụng như một thuốc an thần, gây ngủ, không thể hiện tác dụng như một thuốc giải lo âu. Điểm khác của công thức là có thêm Lạc tiên, đã được nghiên cứu có tác dụng ức chế kênh Na+/Ca++, thụ thể GABA và NMDA ở não (8), điều này có thể góp phần giải thích hiệu quả tăng tác dụng gây ngủ của công thức thuốc thông qua tác dụng hiệp đồng với các dược liệu khác. Đồng thời, qua định tính có sự hiện diện của L- tetrahydropalmatin có trong cao chiết, qua y văn cho thấy L-tetrahydropalmatin có tác dụng gây ngủ do tác động lên các tế bào thần kinh thể vân ở não như là một chất đối kháng dopaminergic và có thể ức chế dẫn truyền (block) cả hai thụ thể tiền và hậu synap của thụ thể dopaminergic (6). Theo Y học cổ truyền, công thức thuốc có vị đắng, tính bình và mát, qui kinh Can, Tâm, Tỳ, Vị(3). Về mặt lý thuyết, tác dụng phối ngũ của bài thuốc giúp thanh nhiệt, tả hỏa, an thần thỏa pháp trị của bệnh danh Can khí uất nhiệt, tuy nhiên cần nghiên cứu thêm ở các mô hình khác nhau. KẾT LUẬN Cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem có tác dụng hợp đồng gây ngủ với thiopental. Về độc tính, chưa xác định được LD50 và độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng theo đường uống. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Chí Hiếu (1994). Dược lý trị liệu thuốc nam. Nhà xuất bản Đồng Tháp, tr. 22 - 35. 2. Bộ Y tế (1996). Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc cổ truyền. (Ban hành kèm theo quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 của Bộ trưởng Bộ Y tế). Tạp chí Dược học số 241, tr. 3 – 9. 3. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. Nhà xuất bản Y Học, tr. 696 - 697, 810 - 811, 882 - 883, 930 - 931, PL. 182 - 183, PL. 236 - 237. 4. Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 50 - 57. 5. Gerhard Vogel (ed.) (2002). Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays, 2nd ed, pp. 394 – 398, 430 – 431. 495 - 496. 6. Marcenac F, Jin GZ, Gonon F (1986).“Effect of L- tetrahydropalmatine on dopamine release and metabolism in the rat striatum”. Psychopharmacology (Berl)., Vol.89 (1), pp. 89- 93. 7. Nguyễn Lan Thùy Ty, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Hữu Đức (2008). Đánh giá tác dụng an thần-gây ngủ của 2 chế phẩm có nguồn gốc dược liệu. Y Học TP. HCM, tập 12( 2), tr. 106 - 111. 8. Pavan Kumar Reddy K., Bhagavan Raju M., Sreedevi P., Pranali Pandit,Veena Rani I., Veena G. (2009). Phytochemical screening antiepileptic& analgesic activity of leaf extract of passiflora foetida. Pharmacologyonline 3, pp. 576 - 580. Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/10/2013, 04/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014