Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh tswv (tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật elisa và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật rt - Pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. TS. Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này. KS. Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện. Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập mẫu. Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi. Thành kính ghi ơn Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích. Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đình Trường iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG RT – PCR”. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN Đề tài đƣợc tiến hành tại các xã trong huyện Củ Chi, Trảng Bàng, Châu Thành  Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện  Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA và RT – PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện:  Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngoài đồng bằng sự đánh giá về hình thái.  Lấy mẫu, tiến hành chẩn đoán bằng phƣơng pháp ELISA và RT - PCR, từ đó rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt. Kết quả đạt đƣợc:  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra - Nhuận Đức: 12,1% - Phƣớc Thạnh: 12,5% - Lộc Hƣng: 0%  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng - Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5% - Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57% - Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53% v - Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25%  Tỷ lệ nhiễm trên trái - Trái nhiễm: 33% - Không nhiễm: 67% vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction Genome L: Genome long Genome M: Genome medium Genome S: Genome short N: Nucleocapside cRNA: Complementary RNA vRNA: Virion RNA Tm: Melting temperature Ta: Annealing temperature GSP: Gen Special Primer cDNA: Complementary DNA p-NPP: p-Nitrophenyl phosphate RNAbc: RNA binding column PVP: Polyvinylpyrolydol vii MỤC LỤC Trang Trang tựa .......................................................................................................................... ii Cảm tạ ............................................................................................................................ iii Tóm tắt ............................................................................................................................ iv Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. vi Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các bảng ........................................................................................................ xi Danh sách các đồ thị ....................................................................................................... xi Danh sách các hình ........................................................................................................ xii Danh sách các sơ đồ ...................................................................................................... xii Phần I. Mở Đầu .............................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2 Mục Đích - Yêu cầu .................................................................................................. 1 1.2.1 Mục đích nghiên cứu ........................................................................................... 1 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................................ 1 Phần II. Tổng Quan Tài Liệu ....................................................................................... 2 2.1 Giới thiệu về cây ớt ................................................................................................... 2 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt ................................................................................................. 2 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt ........................................................................ 2 2.1.3.1 Thân ............................................................................................................... 2 2.1.3.2 Rễ ................................................................................................................... 2 2.1.3.3 Lá ................................................................................................................... 2 2.1.3.4 Hoa ................................................................................................................. 3 2.1.3.5 Quả ................................................................................................................. 3 2.1.3.6 Hạt .................................................................................................................. 3 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt .................................................................................. 3 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt ..................................................................................... 4 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác .................................................... 4 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt .................................................................. 9 viii 2.3.1 Nhiệt độ................................................................................................................ 9 2.3.2 Ánh sáng .............................................................................................................. 9 2.3.3 Ẩm độ .................................................................................................................. 9 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng ............................................................................................... 9 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) ............................................... 10 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV ................................................................................. 10 2.4.2 Cấu trúc TSWV ................................................................................................. 10 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh .............................................................................. 13 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV ................................... 14 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt ................................................................................. 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học ......................................................................... 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển ................................................................................. 16 2.10 Khống chế bệnh TSWV ......................................................................................... 16 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV ......................................................................................... 18 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị .................................................................................. 18 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận .................................................................................... 18 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống ................................................................................... 18 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.......................................... 19 2.12 ELISA .................................................................................................................... 19 2.12.1 Khái niệm về ELISA ....................................................................................... 19 2.12.2 Phân loại ELISA .............................................................................................. 20 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) ................................................................ 20 2.12.2.2 ELISA gián tiếp ......................................................................................... 21 2.12.2.3 Sandwich ELISA ....................................................................................... 21 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh ...................................................................... 22 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA ............................... 23 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA ...................................................... 23 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR .................................................................................... 23 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR .......................................................................... 23 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR .................................................. 25 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR .................................................................. 30 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết ................. 31 ix 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn .................. 31 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn ................... 32 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào........................................................ 32 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu ...................................................................................... 33 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau ....................................................... 33 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR ........................................................................................... 33 2.14.1 Phân loại RT – PCR ......................................................................................... 33 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc .................................................................. 33 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc .................................................................... 34 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................ 34 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV .... 35 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam ...................................................................... 35 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới ....................................................................... 35 Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu .................................................... 36 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 36 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu ............................................................................ 36 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................................. 36 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV ....................................................................... 37 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA ....................................................................... 37 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA ................. 37 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện ...................................................................................... 37 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR ................................................................... 39 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad ................................... 39 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di .............................................. 40 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR .......................................................... 40 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR ......................................................................... 41 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di ............................................................ 43 Phần IV. Kết quả Thảo luận ....................................................................................... 45 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA ... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra ................................................. 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng ........................................................ 47 x 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi ............................................................... 50 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR ................................................................................... 51 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA ....................................................................................... 51 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer ..................................................................................... 52 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR.............................................................................. 53 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR ........................................... 54 Phần V. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 60 5.1 Kết luận.................................................................................................................... 60 5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 60 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 61 PHẦN VII. PHỤ LỤC ................................................................................................. 64 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh ............................................................ 4 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV ............................................... 13 Bảng 3.1: Các địa bàn đƣợc lấy mẫu ớt ......................................................................... 36 Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng .... 45 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng ............................................................. 49 DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Trang Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.45 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng ......................................................................... 49 Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt ................................................................... 50 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV .................................................................................... 11 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV ................................................... 12 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV ......................................................... 14 Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV ........................................................................................ 15 Hình 2.5: Các loài bọ trĩ ................................................................................................ 16 Hình 2.6: Nguyên tắc phản ứng PCR ............................................................................ 24 Hình 2.7: Tiến trình thực hiện RT – PCR một bƣớc ..................................................... 33 Hình 2.8: Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bƣớc ...................................... 34 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA ........................................................................ 39 Hình 4.1: Ớt Ba tri bị nhiễm TSWV.............................................................................. 46 Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari bị nhiễm TSWV ................................................................. 46 Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong .................................................. 47 Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn ............. 47 Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ .......................................... 48 Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ .................................... 48 Hình 4.7: Kết quả điện di RNA ..................................................................................... 51 Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng ..................................................................... 53 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp ........................................... 20 Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp ........................................... 21 Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp .......................................... 21 Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp .......................... 22 Sơ đồ 2.5: Tổng hợp cDNA ........................................................................................... 34 1 Phần I Mở Đầu 1.1 Đặt vấn đề Cây ớt (Capsicum annum L.) là cây trồng quan trọng thứ hai (sau cây cà chua) trong các loại cây vừa nhƣ một loại rau, vừa nhƣ một loại gia vị. Ngoài ra trong quả ớt chứa nhiều vitamin nhƣ: A, B, C, D, Caroten và một số chất khoáng khác. Trồng ớt mang lại hiệu quả kinh tế cao gấp 3-4 lần so với cây lúa nên những năm gần đây, ở nƣớc ta cây ớt đƣợc trồng với diện tích và sản lƣợng ngày càng tăng, đáp ứng nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu. Ớt là mặt hàng xuất khẩu đứng vị trí số 1 trong các loại gia vị. (Trích dẫn luận văn tốt nghiệp Nguyễn Hữu Trúc) Ngoại thành TP.Hồ Chí Minh có điều kiện tự nhiên và xã hội thuận lợi cho việc phát triển nhiều chủng loại rau, trong đó cây ớt luôn đƣợc chú trọng và đƣợc trồng với diện tích ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc phát triển ớt chuyên canh lại là điều kiện cho nhiều loại mầm bệnh gây hại phát triển mạnh, trong đó bệnh gây ra bởi virus mà gây hại mạnh nhất là virút gây bệnh đốm héo rũ trên cà chua (Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV) gây khó khăn cho những vùng chuyên sản xuất ớt hiện nay, ảnh hƣởng đến kinh tế rất lớn. Chính vì lý do đó mà đề tài “Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT - PCR” đƣợc thực hiện nhằm xác định sớm mầm bệnh, từ đó có biện pháp ngăn chặn kịp thời và giảm bớt mức thiệt hại do mầm bệnh này gây ra. 1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu Thực tập, ứng dụng và bƣớc đầu xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bệnh TSWV trên đối tƣợng cây ớt ở mức độ phân tử, từ đó có thể đánh giá đƣợc hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt tại các địa bàn điều tra. 1.2.2 Yêu cầu + Phải đi thực tế tại các địa bàn để điều tra, lấy mẫu ớt. + Nắm vững lý thuyết về hai phƣơng pháp dDAS-ELISA cũng nhƣ RT – PCR, rồi từ đó mới tiến hành các phƣơng pháp chẩn đoán. 2 Phần II Tổng Quan Tài Liệu 2.1 Giới thiệu về cây ớt 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt Cây ớt thuộc họ cà (Solanaceae), có khoảng 30 loài nhƣng chỉ có 5 loài đƣợc trồng là: C.pendulum, C. pubescens, C. annum, C. frutescens, và C. chinensis, trong đó hai loài C. pendulum và C. pubescens đƣợc trồng hạn chế ở Trung và Nam Mỹ, loài C. chinensis đƣợc trồng ở khu vực Amazon và Châu Phi, hai loài C. annum và C. frutescens đƣợc trồng khắp nơi trên thế giới. 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt Theo các nhà nghiên cứu phân loại thực vật học thì cây ớt có nguồn gốc từ Mehico và nguồn gốc thứ hai là ở Guatemala. Theo Vavilop, nguồn gốc thứ hai không phải ở Guatemala mà ở Evraz. Hiện nay ớt đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới và á nhiệt đới. 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2.1.3.1 Thân Ớt là cây bụi, hai lá mầm, thân thƣờng mọc thẳng, đôi khi có thể gặp các dạng có thân bò, nhiều cành, chiều cao trung bình từ 0,5-1,5m, có thể là cây hàng năm hoặc lâu năm nhƣng thƣờng đƣợc gieo trồng nhƣ cây hàng năm. 2.1.3.2 Rễ Ớt có rễ cọc phát triển mạnh với nhiều rễ phụ. Tuy nhiên do việc cấy chuyển, rễ cọc thƣờng bị đứt và cho một hệ rễ chùm phát triển, vì vậy nhiều ngƣời lầm tƣởng ớt có hệ rễ chùm. 2.1.3.3 Lá Thƣờng ớt có lá đơn mọc xoắn trên thân chính. Lá có nhiều dạng khác nhau, nhƣng thƣờng gặp nhất là loại lá mác, mép lá ít răng cƣa. Lông trên lá tùy thuộc vào các loại khác nhau, một số có mùi thơm, lá thƣờng mỏng có kích thƣớc trung bình 1,5- 12cm×0,5-7,5cm. 3 2.1.3.4 Hoa Các hoa hoàn thiện và quả thƣờng đƣợc sinh đơn độc trên từng nách lá. Hoa có thể mọc thẳng đứng hoặc buông thòng. Trên cuống hoa thƣờng không có li tầng, hoa thƣờng có màu trắng, một số giống có màu sữa, xanh lam, màu tím. Hoa có 5-7 cánh hoa, cuống dài khoảng 1,5cm, đài ngắn có dạng chuông, nhụy có màu trắng hoặc tím, đầu nhụy có dạng hình đầu, hoa có 5-7 nhị đực với ống phấn màu xanh da trời hoặc tía. 2.1.3.5 Quả Thuộc loại quả mọng có nhiều hạt và chia làm nhiều ngăn. Các giống khác nhau có kích thƣớc quả, hình dạng, màu sắc, độ cay và độ mềm của thịt quả rất khác nhau. Quả chƣa chín có thể có màu xanh hoặc tím, quả chín có màu đỏ, da cam, vàng, màu kem hoặc hơi tím. 2.1.3.6 Hạt Hạt ớt nhỏ dẹp có dạng thận, màu vàng rơm, hạt có chiều dài khoảng 3-5mm, 1gram ớt cay khoảng 220 hạt. (Lƣơng Nguyễn Thu Tâm, 1996-2001) 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt Ớt đƣợc trồng khắp nơi để làm gia vị và làm thuốc, ớt có loại ngọt và loại cay. Ở Việt Nam, phổ biến nhất là loại ớt cay. Quả ớt có vị cay, tính nóng, có tác dụng tiêu đờm, ổn trung, tán hàn, giải biểu, kiện vị, tiêu thực gây sung huyết, kích thích chung, thông kinh lạc, giảm đau, sát trùng. Rễ ớt có tác dụng làm hoạt huyết, tán thũng. Lá ớt có vị đắng, tính mát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu. Công dụng: ớt ngọt đƣợc dùng làm rau ăn, ớt cay làm gia vị và là vị thuốc. Quả ớt trị tỳ vị hƣ lạnh, tiêu chảy, hắc loạn, nôn mửa, dạ dày ruột đầy trƣớng, mất trƣơng lực, tích trệ, ăn không tiêu, đau nhức nửa đầu, đau lƣng, đau khớp, thống phong, đau dây thần kinh, viêm thanh quản, viêm họng. (Theo SK&ĐS, 2005) 4 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong ớt xanh (trong 100g phần ăn đƣợc) Thành phần chủ yếu của vỏ quả là chất cay, không màu, kết tinh, có tên gọi là Capsaicin (C18H27NO3), hàm lƣợng của nó phụ thuộc vào giống. Quả còn chứa một loại dầu có màu đỏ, không cay, năng suất chiết xuất 20-25% dịch chiết alkaloid. Quả ớt xanh chứa nhiều rutin là một chất đƣợc dùng rộng rãi trong chế biến thuốc- y học. (Nguyễn Hữu Trúc, 1995-2000) 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác Bệnh virus gây khảm cỏ linh lăng (Alfalfa) a. Mầm bệnh Bệnh do virus hình trụ gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b. Triệu chứng Trên tàn lá, bệnh thể hiện một dạng khảm đặc biệt có màu vàng trắng cho đến trắng, đôi khi mất màu ở vùng mô giữa các gân lá. Các triệu chứng này thƣờng đƣợc xem nhƣ là bệnh khảm calico. Các dạng sọc vàng và chết hoại gân cũng có thể xảy ra. Thành phần Hàm lƣợng Thành phần Hàm lƣợng Ẩm độ 85,7g P 80mg Protein 2,9g Fe 1,2mg Chất béo 0,6g Na 6,5mg Chất khoáng 1,0g K 2,7mg Cacbuahydrat 3,0g S 34mg Chất sơ 6,8g Cu 1,55mg Ca 30mg Thiamin 0,19mg Mn 24mg Vitamin A 292mg Riboflavia 0.39mg Vitamin C 111mg Acid oxalic 67mg 5 Thông thƣờng, lá không bị biến dạng. Cây nhiễm bệnh có thể hơi lùn và đôi khi trái bị biến dạng. Bệnh virus đốm gân lá ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b. Triệu chứng Triệu chứng đặc trƣng nhất của bệnh là lốm đốm trên lá và gân lá có màu xanh lục đậm. Ở một số giống ớt lá bị nhỏ lại và méo mó, trên một vài giống khác có thể thấy các đốm vòng chết hoại. Sự nhiễm bệnh sớm làm cây lùn lại. Trái trên cây nhiễm bệnh nhỏ đi và đôi khi biểu hiện lốm đốm và hơi biến dạng. Bệnh virus gây khảm dƣa leo a. Mầm bệnh Bệnh do Cucumovirus gây ra, bệnh này đƣợc lan truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Triệu chứng bệnh rất rõ ràng. Một trong số những biểu hiện phổ biến nhất là cây lùn hẳn lại, không phát triển và có tàn lá màu xanh nhạt, đục có vẻ giống nhƣ da nhƣng không có những dấu vết rõ rệt trên tàn lá. Đôi khi triệu chứng trên tàn lá rất rõ rệt và có thể bao gồm: lá thu hẹp lại, khảm, hóa vàng, có đốm vòng vàng nhạt hoặc chết hoại, biến dạng lá sồi. Trong một số trƣờng hợp, chồi ngọn bị chết hoại. Trên trái có thể xuất hiện những vòng vàng nhạt hoặc chết hoại. Bệnh virus đốm trên ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Các giống mẫn cảm phát triển triệu chứng lốm đốm trầm trọng trên lá và thƣờng đi kèm theo triệu chứng gân xanh và biến dạng lá. Nhiều chủng virus gây biến dạng mạnh trên trái. Bệnh virus gây khảm nặng trên ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp 6 b. Triệu chứng Các vạch và đốm chết hoại hình thành trên thân, lá và trái sau đó lá rụng. Các lá mới mọc bị khảm rất nặng. Năng suất bị giảm nghiêm trọng. Bệnh virus đốm gân lá ớt a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp b. Triệu chứng Lá biến vàng dọc theo các gân chính, sau đó phần giữa các gân cũng biến vàng, lá thƣờng bị nhỏ lại và bị biến dạng mạnh. Các lá này thƣờng rụng sớm làm cho cây bị trụi lá một phần. Cây bị bệnh cho ít trái và trái nhỏ hơn. Bệnh virus Y khoai tây a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Những triệu chứng điển hình nhất là khảm và gân xanh đậm. Cũng thƣờng thấy triệu chứng lá nhăn nheo, biến dạng và cây bị lùn. Lá cây ớt giống “Tabasco” hình thành những vạt màu vàng. Một số chủng gây chết hoại mô bào gân lá và đỉnh các nhánh gần ngọn. Trên cây bị bệnh có ít trái và trái nhỏ, đôi khi trái biểu hiện khảm và/hoặc bị biến dạng Bệnh virus gây vết hằn thuốc lá a. Mầm bệnh Bệnh do Potyvirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rệp. b. Triệu chứng Lá thƣờng thể hiện triệu chứng khảm và những vệt xanh đậm rộng dọc theo gân lá. Lá biến dạng, trái biến dạng và cây bị lùn cũng là triệu chứng thƣờng gặp ở những cây bị nhiễm bệnh virus này. Ở hầu hết các giống, năng suất và chất lƣợng trái bị suy giảm nghiêm trọng. Trong một số thời vụ giống ớt này bị thất thu hoàn toàn. Bệnh virus gây cong ngọn củ cải a. Mầm bệnh Bệnh do Geminivirus gây ra, virus này đƣợc lan truyền bởi rầy lá. 7 b. Triệu chứng Triệu chứng điển hình gồm có sự cong mép các lá già lên trên và mép lá non hơn cong lên rất mạnh. Cuống lá cong nhiều về phía dƣới. Cây bị nhiễm bệnh vào những giai đoạn đầu bị vàng và lùn rõ rệt. Sau khi nhiễm bệnh cây cho rất ít trái, những trái có sẵn nhỏ lại, méo mó và chín ép. Cây bị nhiễm bệnh sớm trong vụ trồng thƣờng không sống đƣợc. Bệnh virus đốm lá ớt ngọt a. Mầm bệnh Bệnh do Tobamovirus gây ra và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học b. Triệu chứng Triệu chứng trên lá gồm có: trong gân lá, khảm, lốm đốm và hoá vàng. Cây bị nhiễm bệnh trong thời kỳ đầu có thể bị lùn lại. Khó phân biệt đƣợc triệu chứng do virus này gây ra với triệu chứng do các tobamovirus. Bệnh virus gây đốm nhẹ trên cây ớt (Bệnh khảm ớt hay bệnh khảm ẩn thuốc lá Samsun) a. Mầm bệnh Bệnh do Tobamovirus gây ra và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học b. Triệu chứng Triệu chứng khảm nhẹ phát triển khắp trên mặt lá và đôi khi lá bị nhăn nheo. Trái thƣờng bị thiệt hại nặng với các triệu chứng nhƣ vòng, vệt thẳng, đốm chết hoại và méo mó. Cây bị lùn khi bị nhiễm bệnh sớm vào thời kỳ đầu giai đoạn sinh trƣởng. Bệnh virus khảm thuốc lá - Bệnh virus khảm cà chua a. Mầm bệnh Các loại Tobamovirus và đƣợc lan truyền bằng con đƣờng cơ học. b. Triệu chứng Triệu chứng tƣơng tự đối với cả hai loại bệnh. Các triệu chứng thay đổi tùy theo giống nhƣng đều có biểu hiện lùn, khảm, toàn cây biến vàng và đôi khi có sự chết hoại toàn bộ kèm theo rụng lá. Bệnh virus gây héo đốm lá cà chua a. Mầm bệnh Do Tospovirus gây ra và đƣợc lan truyền bởi bọ trĩ. 8 b. Triệu chứng Triệu chứng rất thay đổi. Lá có thể bị khảm, lốm đốm vàng, đốm vòng vàng và chết hoại, biến dạng. Ở một số giống, xảy ra chết hoại chồi ngọn và lá rụng, sau đó các lá mới mọc bị khảm toàn bộ và biến dạng mạnh mẽ. Các triệu chứng trên trái bao gồm đốm vàng và chết hoại, khảm, các hình vòng và méo mó. Cây nhiễm bệnh ở thời kỳ đầu bị lùn hẳn và không thể hồi phục, mặc dù một số giống có khả năng phục hồi lại sự sinh trƣởng bình thƣờng. Bệnh virus cong lá ớt a. Mầm bệnh Do Geminivirus đƣợc lan truyền bởi bọ phấn. b. Triệu chứng Triệu chứng điển hình là cây bị lùn thấp và lá bị vàng, cong lên. Cây bị nhiễm bệnh có các lóng ngắn và lá bị nhỏ hẳn, mép lá cuốn cong lên tạo thành dáng chiếc xuồng. Bìa lá biến thành màu xanh nhạt hoặc vàng sáng lan vào đến các vùng thịt lá giữa các gân. Bệnh Tigre’ a. Mầm bệnh Phức hợp Geminivirus gây ra và đƣợc truyền bởi bọ phấn. b. Triệu chứng Đặc điểm của bệnh Tigre’ là lá bị cong và hoá vàng rõ rệt mép lá và vùng thịt lá giữa các gân. Lá bệnh nhỏ hẳn, nhăn nheo, mép lá cuốn ngƣợc lên trên. Cây nhiễm bệnh trong những thời kỳ đầu bị lùn hẳn lại. Bệnh virus gây khảm vàng Serrano a. Mầm bệnh Do Geminivirus, đƣợc lan truyền bởi bọ phấn b. Triệu chứng Sự xâm nhiễm của virus gây ra khảm vàng tàn lá ớt. Bệnh geminivirus trên ớt Texas a. Mầm bệnh Geminivirus, virus này đƣợc lan truyền bởi bọ phấn 9 b. Triệu chứng Cây bệnh biểu hiện triệu chứng cong lá và biến dạng. Mép lá có xu hƣớng cuốn lên trên và xuất hiện các đốm vàng sáng, đôi khi các viền vàng lan vào trong các vùng mô giữa gân lá. (Bùi Cách Tuyến) 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 2.3.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, số hoa, tỷ lệ đậu quả. Nhiệt độ ngày/đêm khoảng 25/18 là thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng, phát triển của ớt nói chung, tăng năng suất, tăng số quả thƣơng phẩm. Nhiệt độ ban đêm thấp (8-15oC) thƣờng làm giảm tỷ lệ đậu quả và sinh quả không hạt, nhiệt độ ban đêm thích hợp nhất là 20oC trong giai đoạn nở hoa. Ngoài ra nhiệt độ thấp còn làm giảm kích thƣớc dạng quả. Nói chung ớt thích hợp nhiệt độ cao hơn và dao động trong khoảng 20-30oC. 2.3.2 Ánh sáng Ớt là cây không mẫn cảm lắm với ánh sáng nhƣng là cây ƣa ánh sáng ngày ngắn. Nếu chiếu sáng 9-10 giờ sẽ kích thích sinh trƣởng, tăng sản phẩm khoảng 21-24% và tăng chất lƣợng quả. Trời âm u sẽ làm hạn chế khả năng đậu quả, làm giảm năng suất của cây ớt. 2.3.3 Ẩm độ Ớt rất thích với điều kiện đất ẩm, đất ẩm nhƣng trong điều kiện không khí khô hạn sẽ kích thích quá trình chín của quả. Ớt là cây chịu hạn, nếu ẩm độ đất khoảng 10% tỷ lệ rụng quả tăng đến trên 71%, trong khi ẩm độ từ 55-58% tỷ lệ rụng quả chỉ còn 20-30%. Nếu ẩm độ thấp hơn 70% trong giai đoạn ra hoa, hình thành quả thì quả sẽ bị sần sùi, giảm giá trị thƣơng phẩm. Tốt nhất duy trì độ ẩm đồng ruộng khoảng 70- 80%. Nếu ẩm độ quá cao rễ sinh trƣởng kém, cây còi cọc. 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng Ớt là cây trồng tƣơng đối dễ tính. Đất phù hợp nhất là đất thịt nhẹ, giàu vôi, ớt có thể sinh trƣởng, cho năng suất trên đất cát nhƣng phải bảo đảm đƣợc chế độ nƣớc và dinh dƣỡng đầy đủ. Đất chua và kiềm đều không thích hợp cho ớt sinh trƣởng và phát triển. Ớt có thể sinh trƣởng ở đất chua và màu mỡ nhƣng tỷ lệ nảy mầm và tính chín sớm bị ảnh hƣởng. Ớt là cây chịu mặn, ngƣời ta đã nghiên cứu và thấy rằng ớt có thể nảy mầm ngay cả ở nồng độ muối 4000ppm và pH=7,6. 10 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới. TSWV đƣợc báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi nó gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đó đƣợc mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus. Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu mà nhạy cảm với TSWV thì còn có họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác. Tỉ lệ nhiễm khoảng 59- 90% điều này đƣa đến hậu quả là nó ảnh hƣởng lên các loại hoa màu có giá trị thƣơng mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hƣởng đến các loại hoa màu nhiều nhất. (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.4.2 Cấu trúc TSWV TSWV là thành viên của giống Tospovirus, thuộc họ Bunya viridae là một nhóm lớn virus chứa vật liệu di truyền là các sợi đơn RNA. TSWV là những tiểu phần nhỏ, đƣờng kính 80-120nm. Genome của TSWV gồm một sợi RNA âm tính và hai sợi RNA ambisense. Mỗi RNA của genome thì đƣợc bao bọc bởi nhiều bản copy của Nucleocapside (N) để hình thành nên ribonucleoprotein cũng đƣợc biết nhƣ là nucleocapside. Các nucleocapside đƣợc bao bọc bên trong lớp màng đôi đƣợc tạo ra từ ký chủ và đi kèm với protein L phụ thuộc vào chuỗi RNA. Chúng để lộ các glycoprotein ra ngoài bề mặt 5-10nm mà sau khi đã gắn vào lớp màng đôi lipid dày khoảng 5nm. Tính trên thành phần tổng số thì RNA chiếm 2%; protein chiếm 58%; lipid chiếm 33% và carbohydrate chiếm 7%. Chúng chỉ xuất hiện trong tế bào chất mà không ở bất kỳ tổ chức nào. Theo một nhà khoa học thì có ba thuyết chính giải thích về hình thể tròn của virus. Thứ nhất là nồng độ của khối khuếch tán bình thƣờng là rất cao và đôi khi vỏ nucleoprotein của virus lại xoắn lại. Thứ hai là sự bao bọc các nucleoprotein trần này bằng các màng để tạo nên virus trƣởng thành. Thuyết thứ ba là sự cách ly với các phần của virus trong các buồng bên trong các lỗ trong màng hoặc trong hệ thống lƣới nội chất là một phản ứng của cây ký chủ (cô lập chúng bằng cách bao chúng lại). Tất cả các virus thuộc họ này đều có ba đoạn genome RNA, đƣợc đặt tên là L (long), M (medium), và S (short). Có thể số lƣợng thì không tƣơng đồng trong mỗi loại virion bởi vì sự giống hay khác nhau về số lƣợng của các đoạn này là không có ý nghĩa. 11 Đoạn genome L tạo ra một loại protein, đây là một polymerase. Các đoạn M tạo ra các glycoprotein đƣợc đặt tên là G1 và G2. Đoạn genome S tạo ra các nucleoprotein. Tiến trình tái bản của genome L nền tảng cho TSWV (genome L tạo ra polymerase, đây là một enzyme cần thiết cho sự tái bản để nhân lên của virus trong cơ thể ký chủ). Chính các bản sao của RNA của virus thành cRNA, cRNA sau đó sẽ tạo ra nhiều vRNA, hai tiến trình này thƣờng xuyên tạo ra lẫn nhau. vRNA sau đó thực hiện sao mã và dịch mã thành chuỗi protein. Đây là cách để tái bản genome tốt nhất. Tiến trình này khác với cả các đoạn genome S và M. Đồng thời chính các sao của vRNA cũng chuyển thành cRNA. Tuy nhiên, cRNA sau đó cũng trải qua quá trình sao mã và dịch mã một cách trực tiếp mà không cần sự có mặt của vRNA, song song với cRNA thì vRNA cũng trải qua quá trình sao mã và dịch mã. Khả năng này xảy ra thì đƣợc gọi là “ambisense”. Điều này có nghĩa là các đoạn S và M có cả các chiến lƣợc tái bản mang ý nghĩa “positive” và “negative”. Kết quả là tạo ra protein phi cấu trúc đƣợc gọi là NSs hoặc NSm và nó phụ thuộc vào genome mà ta đang quan sát. Đoạn S cũng tạo ra protein N và đoạn M tạo ra cả hai loại G1 và G2 bằng việc phân cắt protein trong quá trình dịch mã. Cho đến nay thì chức năng của protein NS vẫn chƣa đƣợc biết rõ. Bên cạnh đó một điều đáng quan tâm là giữa các đoạn S, L, M có trình tự kết thúc nhƣ nhau khi ta quan sát trình tự nucleotide của chúng. Vùng đầu tiên của các sợi đều nhƣ nhau, còn vùng cuối cùng thì có sự phân biệt. Có lẽ chính điều này mà không thể tìm thấy sự tƣơng đồng trong các virion. (Lindsey Irons and Emily Sims) Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV 12 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV (Peter Schreier, Prof. Dr. Martin Hülskamp, 2002) 13 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV (Biowave vol.6 No.23, 2004) 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh Con đƣờng xâm nhập và tái bản virus đƣợc thể hiện nhƣ hình vẽ, các đoạn RNA tái bản từ đầu đến cuối. Đầu tiên là tấn công của hạt virion. Thứ hai là xâm nhập vào và cởi bỏ lớp áo virus bằng sự ẩm thực bào của hạt virus và sự hợp nhất giữa màng virus và màng nhân. Thứ ba là sự sao mã sơ cấp xảy ra. Thứ tƣ là sự dịch mã của các đoạn mRNA L và S bởi các ribosome tự do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M bởi các ribosome gắn trên màng và xảy ra sự glycozyl hoá đầu tiên các protein vỏ mới đƣợc tạo ra. Giai đoạn thứ năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu bằng đoạn nucleotide để thích hợp nhƣ là những khuôn mẫu đối với RNA genome hoặc trong một số trƣờng hợp là những mRNA. Tiếp đến là sự tái bản genome theo sau là sự sao mã thứ cấp, tức là tổng hợp các loại mRNA và xuất hiện sự sao mã ambisense. Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong tiểu thể golgi. Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa khối tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trƣởng thành. 14 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV Triệu chứng là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, héo tạo đốm trên cây, thay đổi màu của thân cành, cây cằn cỗi, đốm lấm chấm nhƣ màu rám nắng. Điều này làm cho cây bị biến đổi rất mạnh mẽ cả về hình thái và sức sống. Sự gây hại này phụ thuộc vào việc trồng trọt, cách ly với virus, giai đoạn phát triển của cây khi bị tấn công và điều kiện môi trƣờng. Nếu cây trồng bị nhiễm lúc giai đoạn đang phát triển thì nó sẽ gây hại nghiêm trọng và đôi khi không cho ra quả, nếu cây trồng bị nhiễm sau khi cây đã ra quả thì sẽ làm giảm khả năng quang hợp, xuất hiện các đốm hoại tử hoặc các vòng hoại tử trên cành, thân, lá. Hiện tƣợng rụng hoa và lá cũng xuất hiện trong một số trƣờng hợp. Sự tăng màu diệp lục tố, xuất hiện các đốm hoại tử, các vòng nhẫn hoặc thể khảm có thể tăng trên quả khi cây bị nhiễm. Những triệu chứng này làm mất giá trị cảm quan khi cây trƣởng thành.( Theo Ken Pernezny và ctv, 2003). 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt Triệu chứng bệnh TSWV trên cây ớt rất thay đổi. Lá có thể bị khảm, lốm đốm vàng, đốm vòng vàng và chết hoại, biến dạng. ở một số giống, xảy ra chết hoại toàn bộ chồi ngọn và lá rụng, sau đó các lá mới mọc bị khảm toàn bộ và biến dạng mạnh mẽ. Các triệu chứng trên trái bao gồm đốm vàng và chết hoại, khảm, các hình vòng và méo 15 mó. Cây bị nhiễm ở thời kỳ đầu bị lùn hẳn và không thể hồi phục, mặc dù một số giống có khả năng phục hồi lại sự sinh trƣởng bình thƣờng. Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV (Ray Cerkauskas, 2004) 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học Về mặt huyết thanh học thì TSWV thuộc Serogroup I, TSWV có thể đƣợc vận chuyển bằng cơ học vào phòng thí nghiệm, nhƣng trên đồng ruộng thì nó đƣợc truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loại bọ trĩ khác nhau (Thysanoptera, thuộc họ Thripidae). Các loài bọ trĩ trên hoa Western (Frankliniella occidentalis), bọ trĩ trên thuốc lá (F. fusca) là các vectơ chính truyền bệnh. Ngoài ra F. schultzei, F. intonsa, F. bispinosa, Thrips tabaci và Thrips setosus cũng có thể mang virus này. Thông thƣờng thì bọ trĩ ở giai đoạn ấu trùng thƣờng mang TSWV nhƣ một nhu cầu cần thiết, còn bọ trĩ ở giai đoạn trƣởng thành thì lại mang TSWV không thƣờng xuyên lắm. TSWV sinh sản trong bọ trĩ càng tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó. Virus và các 16 vectơ của nó thì càng lan rộng nhanh hơn khi lƣu chuyển cây cảnh và rau quả đi từ vùng này sang vùng khác, các cánh đồng thuốc lá, đậu phụng và cỏ dại là những nguồn thƣờng xuyên và phổ biến nhất cho các loại virus và vectơ truyền bệnh này. Hình 2.5: Các loài bọ trĩ (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển Các loài bọ trĩ đƣợc xem là trung gian truyền virút TSWV chính trên cây ớt. Chúng thì nhỏ, sinh sản nhanh chóng, sống ký sinh trên một phổ rộng các loại thực vật và vào các cánh đồng một cách thƣờng xuyên. Các loài bọ trĩ chỉ ăn phần thịt của lá, thân, quả và các bộ phận của hoa. Khi chúng ăn các phần trên sẽ làm phá hủy về hình dạng. Bọ trĩ chƣa trƣởng thành, chƣa có cánh thì đòi hỏi phải có virus ký sinh và chúng di chuyển nhiều hơn các con trƣởng thành và từ đó truyền mầm bệnh giữa các cây với nhau, từ đó dẫn đến mức độ lây lan rất nhanh. Vòng đời của bọ trĩ thƣờng từ 7-10 ngày ở nhiệt độ dao động từ 20 – 37oC. Thông thƣờng có khoảng ba thế hệ trong suốt mùa phát triển. TSWV cứ nhiễm dai dẳng từ năm này sang năm khác trong các cây bị nhiễm từ những loài bọ trĩ ký sinh trong các mùa vụ kế cận nhau. (Ray Cerkauskas, 2004) 2.10 Khống chế bệnh TSWV TSWV ngày càng mở rộng mạnh mẽ phổ ký chủ và vectơ truyền bệnh, điều này làm cho việc khống chế chúng trở rất nên khó khăn. Thêm vào đó là sự khan hiếm các gen kháng ở cây ký chủ, đồng thời cỏ dại và cây cảnh là những kho dự trữ để lƣu lại virus và truyền bệnh cho vụ mùa sau. Do đó khi bệnh xuất hiện trong một mùa vụ, các cây trồng nên đƣợc loại và tiêu huỷ nhanh chóng cả những cây đang mang mầm bệnh tiềm ẩn và những cây có triệu chứng bệnh biểu hiện ở mức độ nghiêm trọng. Các bột 17 sáp bên ngoài những cây có triệu chứng bệnh thì không phải luôn luôn gây ảnh hƣởng, mà nó là các đối chứng cho việc nhiễm sau này vì TSWV thƣờng mở rộng mức độ lây lan trƣớc khi phát triển triệu chứng bệnh. Sau đây là một số biện pháp phòng bệnh TSWV:  Loại bỏ các loài cỏ dại và những cây mọc tự nhiên, duy trì các khoảng đệm cách ly không chứa cây cối khoảng 10 mét.  Giảm mật độ trồng để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những nguồn bị nhiễm bệnh.  Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3-4 tuần, nhằm cho phép các loại bọ trĩ có thể nổi lên lại từ những phần của hoa màu và từ đó có thể loại bỏ chúng khỏi cánh đồng hoa màu. Nếu tiết kiệm, đất có thể đƣợc xông với methamsodium (Vapam) hoặc 1,3-dichloropropene (Telone) để loại trừ bọ trĩ đang tồn tại trong các phần của hoa màu trong đất.  Nên lựa chọn trồng những cây không dễ dàng mắc bệnh, vì tỉ lệ quần thể TSWV và bọ trĩ ở khắp mọi nơi là rất cao.  Loại bỏ tất cả những nguồn bọ trĩ vào cuối mỗi mùa vụ để tránh chứa chấp một quần thể nhỏ sẵn sàng tấn công vào vụ sau.  Sử dụng những cây trồng sạch bệnh virus.  Dùng các màn lƣới để ngăn chặng hoặc làm trì hoãn sự tấn công của bọ trĩ vào nhà kính.  Khi sử dụng thuốc trừ sâu thì nên dùng vào ngày thứ năm trong giai đoạn ngƣng nghỉ để giảm bớt tỉ lệ nhiễm một cách có ý nghĩa.  Việc sử dụng nhiều loại thuốc là cần thiết để tiêu diệt đƣợc càng nhiều loại bọ trĩ càng tốt.  Khi phun thuốc cũng nên lựa chọn những thiết bị tạo ra những tiểu phần thuốc nhỏ và hiệu quả nhất khi toàn bộ cánh đồng đều đƣợc phun.  Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để trì hoãn sự kháng thuốc. Hứa hẹn trong tƣơng lai là sẽ phân lập các gen kháng để chuyển vào cây ớt cho phép tạo ra tính kháng với TSWV. (Ray Cerkauskas, 2004), (Ken Pernezny và ctv, 2003) 18 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh chóng. Chẩn đoán bằng cây chỉ thị là phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu virus thực vật. Cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: các cây nhiễm bệnh cục bộ và các cây nhiễm bệnh hệ thống. Cây nhiễm bệnh cục bộ thƣờng tạo ra các vết chết trên lá, thân,…còn cây nhiễm hệ thống thƣờng tạo ra triệu chứng toàn thân nhƣ: khảm lá, biến vàng, lùn cây, và một số triệu chứng khác. Để thu đƣợc cây chỉ thị thì chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:  Các điều kiện chuẩn bị để làm thí nghiệm lây bệnh trên cây chỉ thị: đất thí nghiệm, phân bón.  Phƣơng pháp trồng trọt cây chỉ thị  Phƣơng pháp tiến hành lây bệnh nhân tạo (Vũ Triệu Mân, 2003) 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận Nhƣ cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa) virus X gây vết chết hình nhẫn vòng viền đỏ. Cây rau muối (Chenopodium quinoa) virus S gây các đốm vàng trên lá. 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum var xanthi virus Y gây khảm lá và gân sáng. Cây tầm bóp Mỹ: Physalis floridana gây hiện tƣợng vàng lùn cây sau khi truyền bằng rệp. Các cây chỉ thị đƣợc sử dụng trƣớc tiên với mục đích để chẩn đoán bệnh hại: ngƣời ta thƣờng dùng những cây có triệu chứng nhiễm bộ phận để thực hiện thí nghiệm này. Các cây nhiễm hệ thống thƣờng đƣợc dùng để giữ nguồn virus phục vụ các thí nghiệm trong phòng. Cây chỉ thị là cách chẩn đoán quan trọng trong các phòng thí nghiệm virus thực vật vì chúng là cơ sở ban đầu để chẩn đoán. Nhƣợc điểm cơ bản của phƣơng pháp này cần có thời gian lây bệnh và phải chờ cây phát bệnh sau một thời kỳ ủ bệnh. 19 Yêu cầu chung đối với mẫu Toàn bộ hoặc một phần của lá đều có thể đƣợc dùng làm mẫu phân tích. Nguyên liệu đòi hỏi phải còn tƣơi, lá lớn và còn non, không sử dụng lá già. Chọn những lá có biểu hiện bệnh để thực hiện thí nghiệm chẩn đoán bệnh TSWV. Trƣờng hợp cây có sự phân bố không đều mầm bệnh thì phải thu thập những phần mà có biểu hiện bệnh mạnh nhất. (Theo Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999). 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử  Virus thực vật có những đặc điểm sinh vật sống, chúng tự nhân lên trong cây trồng và di truyền tính gây bệnh, chúng tự phân chia thành các phân tử nhỏ nhƣng cũng có thể tạo thành những tinh thể giống nhau chứa đựng những phân tử protein  Chúng ta không thể thấy virus dƣới kính hiển vi quang học, nhƣng chúng ta có thể quan sát đƣợc chúng trên kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 500.000 lần.  Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thông qua làm tinh khiết cố định bằng hoá chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất.  Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định đƣợc hai virus khác nhau trong cùng một mẫu.  Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. (Phạm Đức Toàn, 1996 – 2001) (Nguyễn Văn Tuất, 2002) 2.12 ELISA 2.12.1 Khái niệm về ELISA  Nguyên tắc: dựa vào phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Cụ thể ở virút TSWV thì kháng nguyên là cấu trúc vỏ protein Nucleocapsid (N); glycoprotein (GP) G1. 20 (Trích từ Chemicon International) 2.12.2 Phân loại ELISA 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp Cho kháng nguyên vào đĩa ELISA Đem ủ các đĩa chứa kháng nguyên Rửa Thêm kháng thể có gắn enzyme Rửa Ủ ở 37oC Thêm cơ chất Ủ ở 37oC Đọc kết quả 21 2.12.2.2 ELISA gián tiếp Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp 2.12.2.3 Sandwich ELISA Sandwich ELISA có thể đƣợc chia làm hai hệ thống:  Sandwich ELISA trực tiếp Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp Cho kháng nguyên vào đĩa Đem ủ, rửa Thêm kháng thể Ủ, rửa Bổ sung kháng kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào Ủ, rửa Bổ sung kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả 22  Sandwich ELISA gián tiếp Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 2.12.2.4 Phản ứng ức ch