Nghiên cứu hoạt tính amylaza của hai chủng bacillus sp h5-1 và h5-4 dùng trong sản xuất phân bón hữu cơ

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH AMYLAZA CỦA HAI CHỦNG Bacillus sp H5-1 VÀ H5-4 DÙNG TRONG SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠNguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim QuyTrung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội I. MỞ ĐẦU     Trong nhiều loại nguyên liệu để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh có chứa tinh bột (bột sắn, thân rễ cây, củ vv..), do vậy trong bộ vi sinh vật dùng trong sản xuất loại phân bón này, ngoài các vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloz, cố định nitơ, phân giải protein, chuyển hoá các hợp chất photpho khó tan thành dễ tan, sinh chất kích thích sinh trưởng và chất kháng sinh, người ta còn bổ sung các vi sinh vật phân giải tinh bột.     Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải tinh bột để bổ sung cho bộ vi sinh vật tạo chế phẩm dùng trong sản xuất phân bón hữu cơ.II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUa. Vi sinh vật.Các chủng vi sinh vật được phân lập từ đất các tỉnh miền Bắc Việt Nam. Các chủng được giữ và bảo quản tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội.b. Môi trường MT2 dùng trong nghiên cứu (g/l): Tinh bột tan-10, CaCl2- 0,2, MgSO4-0,2; NaHCO3-0,2; K2HPO4-5,0; NaCl-0,2. Khử trùng 121oC trong 15 phút. pH = 6,8c. Xác định hoạt tính amylaza theo phương pháp của Srivastava [5].d. Xác định amylaza bằng sắc ký bản mỏng theo phương pháp của Badal saha [2].e. Xác định amylaza bằng điện di trên gel polyacrylamit [3].III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Kết quả nhận biết amylaza bằng sắc ký bản mỏngChúng tôi tiến hành xác định hoạt tinh amylaza của 2 chủng bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.
Hình 1. Kết quả sắc ký bản mỏng của 2 chủng Bacillus i H5-1 và H5-4. Chú thích: Chấm 1: (-amylaza chuẩn Chấm 2: Bacillus sp H5-1Chấm 4: Bacillus i H5-4     Kết quả cho thấy cả 2 chủng đều sản sinh glucoza và mantoza nhưng chủ yếu là glucoza. Điều đó chứng tỏ hoạt tính amylaza của hai chủng bao gồm cả ( - amylaza, ( - amylaza và glucoamylaza. 3. 2. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đối với sinh tổng hợp amylazaAmylaza thuộc nhóm enzym cảm ứng với các nguồn dinh dưỡng là glucoxit. Bởi vậy việc sinh tổng hợp enzym phụ thuộc đáng kể vào sự có mặt và nồng độ của các chất cảm ứng này. Theo nhiều nhà nghiên cứu thì chất cảm ứng thích hợp cho sinh tổng hợp amylaza của vi khuẩn Bacillus là maltoza hoặc sản phẩm thuỷ phân của tinh bột [4]. Một số khác lại cho rằng chất cảm ứng là isomaltoza và penoza. Đó là những loại đường chứa mối nối (-1,6 mà (-amylaza không có khả năng phá huỷ [2].Để khảo sát ảnh hưởng của các nguồn gluxit chúng tôi đã sử dụng cơ chất với tỷ lệ 3% vì nếu thấp hơn sẽ không đủ nhu cầu cung cấp năng lượng cho vi khuẩn, còn nếu trên 3% thì những mẫu có tinh bột sẽ rất đặc, ảnh hưởng tới quá trình thông khí. Kết quả được trình bày ở hình 2
Hình 2. Ảnh hưởng của các nguồn cabon đến sinh tổng hợp amylaza ở hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4. Kết quả thử nghiệm cho thấy cả 2 chủng đều có khả năng đồng hóa các nguồn cơ chất khác nhau: bột gạo, bột mì, cám gạo, dextrin, bột ngô. Lượng đường khử sinh ra là cao nhất khi cho enzym tác dụng lên cơ chất là bột ngô. Phải chăng ở đây ngoài việc thoả mãn nhu cầu về năng lượng cho vi khuẩn còn có vai trò của sinh tổng hợp cảm ứng amylaza mà vai trò này liên quan mật thiết bởi vì có một số tác giả cho rằng tinh bột có trọng lượng phân tử lớn không thể lọt qua màng tế bào để enzym có thể tác dụng trực tiếp tới bộ máy điều hoà sinh tổng hợp cảm ứng enzym được [1]. Vậy ngoài nhu cầu về năng lượng, cơ chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và sinh amylaza của vi khuẩn. 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ lên hoạt tính amylaza của 2 chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4.Hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 được nuôi trong môi trường MT2 trên máy lắc ổn nhiệt ở nhiệt độ 50oC, tốc độ 220 vòng/phút. Sau 56 giờ ly tâm thu dịch enzym thô. Eznym có bổ sung CaCl2 với các nồng độ 2; 4mM và được xử lý ở nước sôi 100oC trong 15 và 30 phút. Kết quả được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Ảnh hưởng của Ca2+ lên độ bền nhiệt của amylaza cuả 2 chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4
Kết quả thực nghiệm cho thấy độ bền nhiệt của amylaza tăng lên khi bổ sung Ca2+ vào dịch enzym thô. Khi không có Ca2+ hoạt tính amylaza giảm đi rất nhanh, hoạt tính bị mất nhanh sau 15, 30 phút xử lý nhiệt. Nhiều nghiên cứu cho rằng khi tách Ca2+ ra khỏi enzym 2 nhóm –SH lộ ra ngoài và do đó làm mất hoạt tính phân huỷ amylaza của enzym [5]. Khi Ca2+ liên kết với apo-( - amylaza, toàn bộ hoạt tính của enzym được thể hiện và 2 nhóm –SH được nối với nhau. Kết quả này phù hợp với nhận định của Machius cho rằng Ca2+ làm ổn định hoá cấu trúc bậc III của enzym amylaza khi ở nhiệt độ cao [3]. Nồng độ Ca2+ thích hợp là 2mM trong thời gian xử lý nhiệt là 15 phút. 3.5. Kiểm tra amylaza bằng điện di trên gel polyacrylamit     Để kiểm tra enzym, cần xác định băng hoạt tính của ( - amylaza. Do vậy trong dung dịch không biến tính với SDS, tuy nhiên trong gel 7,5% chạy vẫn cho SDS. Điện di chạy ở 1mA ở 4oC trong 3 giờ. Lượng enzym được đưa vào với thể tích 20(l. Sau khi kết thúc điện di, gel được tẩy SDS bằng Triton - X nồng độ 2,5% trong 30 phút. Sau đó, ủ trong đệm axetat có pH = 6,8 ở 50oC trong 1 giờ. Cuối cùng gel được nhuộm với dung dịch Lugol (0.15% I2, 1,5% KI) trong 20 phút để xác định băng hoạt tính amylaza.Kết quả được thể hiện ở hình 3.
Hình 3. Điện di đồ enzym trên gel polyacrylamit của hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4     Băng 1 : Biểu hiện hoạt tính amylaza của chủng Bacillus sp H5-1.     Băng 2 : ( - amylaza chuẩn     Băng 3 : Biểu hiện hoạt tính amylaza của chủng Bacillus sp H5-4Kết quả cho thấy cả hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 đều biểu hiện băng hoạt tính amylaza bằng với băng ( - amylaza chuẩn có trọng lượng phân tử là 9 800 kDa. IV. KẾT LUẬN1.     Bằng sắc ký bản mỏng dịch thuỷ phân amylaza của 2 chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 cho thấy có chứa cả (-amylaza, (-amylaza và glucoamylaza.2.     Amylaza của hai chủng vi khuẩn đã được lựa chọn đều có khả năng đồng hoá các nguồn cacbon khác nhau (bột sắn, bột mỳ, dextrin, cám gạo, bột ngô). Lượng đường sinh ra là cao nhất khi cho enzym tác động lên bột ngô.3.     Tính bền nhiệt của amylaza ở hai chủng đã được tuyển chọn phụ thuộc vào sự có mặt của Ca2+ khi thuỷ phân tinh bột. Nồng độ 2mM của ion Ca2+ cho kết quả thích hợp hơn là 4mM.4.      Khi sử dụng phương pháp điện di trên gel polyacrylamit cho thấy enzym của hai chủng Bacillus sp H5-1 và H5-4 khá thuần khiết là (-amylaza. SUMMARYSTUDY ON (-AMYLASE ACTIVITY OF TWO STRAINS Bacillus sp H5-1 và H5-4 USED IN MICROBIAL FERTILIZER PRODUCTION.Nguyễn Thị Hoài Hà et alIn conclusion, hydrolysis liquid conducting by TLC (Thin layer chromatography) method showed that ( - amylase found in both strains Bacillus sp H5-1 và H5-4. Amylase activity was able to assimilate in carbon sources (starch, wheat flour, dextrin, and bran, maize). Amount of sugar was highly produced when there was an action of enzyme on maize. Amylase approved to be thermophilic in the occurrence of Ca2+ at concentration 2mM. Enzyme of two strains were found in ( - amylase when using gel electrothesis SDS-PAGE method.TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Dobreva, E., A. Tonkova, V. Ivanova, M. Stefanova, L. Kabaivanova, D. Spassova. 1998. Immobilization of Bacillus licheniformis cells, producers of thermostable alpha amylase on polymer membranes.J. Ind. Microbiol., 20, 166 - 170.2. Dobreva, E., V. Ivanova, A. Tonkova, E. Radulova. 1996. Influence of the immobilization conditions on the effeciency of alpha-amylase production by Bacillus licheniformis. Process Biochem.,31,3,229-234.3. Emanuilova, E., M. Kambourova. 1994. Extremophilic microorganisms, new sources for biotechnologicaly relevant biocatalysts. in: Eight Cong. Microbiol. Bul. Proc. Eds. S. Neychev, Ts.Angelova,S.Dimov,165-169, Sofia.4. Ivanova, V., E. Dobreva, E. Emanuilova.1993. Purification and characterization of thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis. J. Biotechnol., 28, 277-289.5. Srevastava. R. A. K. 1981. production of extracellular high heats able amylase by a thermophilic Bacillus sp. Indian J., Microbiol.,.123 - 237.