Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (pvx, pvy, plrv) tại đà lạt bằng kỹ thuật elisa, rt-Pcr và giải trình tự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Thành phố Hồ Chí Minh tháng 9 / 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, các em và dòng họ luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích - Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài này. TS. Bùi Minh Trí, ThS. Trần Nhật Phƣơng cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trƣờng đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức bổ ích. Em xin chân thành cảm ơn anh Toàn, chị Huệ, chị Phƣơng, chị Hƣng, chị Hà đã hết lòng giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Cảm ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005 Vƣơng Hồ Vũ iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN VƢƠNG HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 / 2005. “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT- PCR và giải trình tự” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS. TS Bùi Cách Tuyến Đề tài thực hiện các nội dung sau: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV tại 5 phƣờng (5, 8, 9, 11 và 12) trên thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. 2. Khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc 336 bp mã hóa protein vỏ của virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Giải trình tự đoạn gene 336 bp của virus PLRV và so sánh với ngân hàng gene (NCBI) để đánh giá mức độ tƣơng đồng của đoạn gen này. Kết quả đạt đƣợc 1. Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng nhƣ sau: - Phƣờng 5: PVX: 56,25%, PVY: 90,91%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 8: PVX: 17,39%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 9: PVX: 21,21%, PVY: 96,97%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 11: PVX: 41,18%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 12: PVX: 72,73%, PVY:100 %, PLRV: 100% 2. Phát hiện đƣợc virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. 3. Đã giải đƣợc trình tự đoạn gen 336 bp và cho kết quả tƣơng đồng 100% sau khi so sánh với trình tự gen của virus PLRV trên ngân hàng gen. v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... vii Danh sách các bảng ............................................................................................. viii Danh sách các hình và biểu đồ .............................................................................. ix 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2 Mục đích ............................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu ............................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 3 2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây ....................................................... 3 2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây ..................... 4 2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) ...................................................... 4 2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y) ...................................................... 5 2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus) ........................................... 6 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây ............................................................... 8 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài ............................................................ 8 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học ................................................................................ 8 2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ ............................................................................. 8 2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây ................................................. 8 2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép .................................................................... 9 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử .................................... 9 2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ............. 9 2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich ............................... 10 2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) ............................ 10 vi 2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR ............................................................................. 10 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen .................................................................. 11 2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về PVX, PVY và PLRV trên khoai tây ....... 12 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV ............................ 12 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV ............................... 13 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 14 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 14 3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện PVX, PVY và PLRV .. 14 3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV ................... 15 3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA ................................................. 15 3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR ........................................ 15 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 16 3.3.1 Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 16 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu .......................................................... 16 3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV ....................................... 17 3.3.3.1 Phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA ......... 17 3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR .................... 20 3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV .......................... 25 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 27 4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt ...................................... 27 4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA ............ 27 4.2.1 Kết quả kiểm tra ELISA tại các phƣờng ............................................... 27 4.2.2 Kết quả ELISA theo từng giống ............................................................ 29 4.2.3 Kết quả ELISA theo từng thế hệ ........................................................... 30 4.2.4 Kết quả ELISA theo tháng tuổi ............................................................. 30 4.3 Kết quả RT-PCR ............................................................................................ 31 4.4 Kết quả giải trình tự ....................................................................................... 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 37 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 40 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT - cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid - ctv: Cộng tác viên -ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate - DEPC: Diethyl pyrocarbonate -dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate - M-MLV: Moloney murine leukemia virus - PBS-T: Phosphate – buffered saline with tween 20 - PLRV: Potato leafroll virus - p-NPP: p - nitrophenol phosphate - PVP: Polyvinylpyrrolidone - RNA: Ribonucleic acid - RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction - PVX: Potato virus X - PVY: Potato virus Y - VPg: Protein linked genome viii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc TP.Đà Lạt ....................................... 17 Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể ....................................................................... 18 Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme ................................................... 19 Bảng 3.4 Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu .............................................................. 20 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA ....................... 23 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA ................. 24 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phƣờng ...................................... 28 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm kép các virus PVX ,PVY, PLRV ........................................ 29 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống ......................................... 29 .... Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ ................................ 30 Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi ......................... 30 .... Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA ........... 31 Bảng 4.7 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA ..... 32 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Hình thái của virus PVX ............................................................................... 5 Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX...................................................................... 5 Hình 2.3 Hình thái virus PVY ................................................................................................ 6 Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY...................................................................... 6 Hình 2.5 Hình thái virus PLRV .............................................................................................. 7 Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá ............................................................................ 7 Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR .................................................................. 11 Hình 4.1 Kết quả điện di ............................................................................................ 33 Hình 4.2 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Sense primer ............................................... 34 Hình 4.3 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Antisense primer ........................................ 34 Hình 4.4 So sánh kết quả giải trình tự từ 2 primer ............................................................... 35 Hình 4.5 Trình tự sợi Sense của đoạn cDNA mã hóa cho protein vỏ của PLRV ..... 36 Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự sản phẩm RT-PCR của PLRV trên ngân hàng gen .... 36 Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phƣờng ................ 28 Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07 ................................ 29 Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ ............................................. 29 Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi .................................................... 31 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan trọng nhất của con ngƣời (xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới sau lúa mì, gạo, bắp và đại mạch ). Tuy nhiên trở ngại lớn nhất trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại trong đó bệnh do virus là vô cùng nghiêm trọng. Khoai tây có thể bị nhiễm hơn 30 loại virus khác nhau, phổ biến nhất và nguy hại nhất là các loại virus PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) và PLRV (Potato leafroll virus) với các triệu chứng khảm, cuốn, đốm, nhăn nheo và hoại tử trên lá. Sản lƣợng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng khi bị tạp nhiễm cùng lúc nhiều loại virus. Năng suất khoai tây có thể giảm tới 80% khi bị nhiễm tổ hợp PVX, PVS và PLRV (Salazar 1982). Ở nƣớc ta, khoai tây đƣợc trồng chủ yếu vào vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng, các tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây của Việt Nam) và trồng quanh năm ở Đà Lạt (chiếm 15% sản lƣợng) với các loại giống chủ yếu nhƣ 06 và 07. Mặc dù vậy, nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus và thiệt hại do bệnh virus trên khoai tây còn rất hạn chế. Do đó việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa ra những biện pháp phòng trừ thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh gây ra là hết sức cần thiết. Do đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi nhiều dụng cụ và trang thiết bị hiện đại mới thực hiện đƣợc. Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng và hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử với các kỹ thuật chẩn đoán nhƣ ELISA, RT-PCR, Sequencing, đã tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán cũng nhƣ phòng trừ bệnh virus trên khoai tây. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR và giải trình tự” 2 1.2 Mục đích - Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA. - Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. - Giải trình tự đoạn gen có đƣợc sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định nguồn gốc của đoạn gen này. 1.3 Yêu cầu - Thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra các mẫu thu thập từ năm phƣờng trên địa bàn thành phố Đà Lạt. - Thực hiện phản ứng RT-PCR với mẫu có kết quả dƣơng tính với virus PLRV. - Lấy sản phẩm RT-PCR của virus PLRV đi giải trình tự và so sánh với ngân hàng gen. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây Khoai tây vừa là lƣơng thực vừa là thực phẩm có giá trị. Ở nhiều nƣớc Âu, Mỹ, khoai tây đƣợc sử dụng nhƣ là một lƣơng thực chính sau lúa mì: 23 - 30% sản lƣợng khoai tây đƣợc dùng để ăn; còn ở những nƣớc khác nhƣ châu Á thì khoai tây đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thực phẩm hoặc là lƣơng thực phụ. Khoai tây có nguồn gốc ở Nam Mỹ thuộc các nƣớc Chi Lê, Pêru, Braxin, Bôlivia, trên các miền núi có khí hậu mát và ẩm. Hiện nay, ở những nƣớc này vẫn còn tìm thấy những loài khoai tây hoang dại. Tuy nhiên khoai tây đƣợc trồng đầu tiên ở các nƣớc thuộc Châu Âu. Năm 1561, khoai tây đƣợc trồng sớm nhất tại Tây Ban Nha, giống lấy từ Pêru. Ở Việt Nam, khoai tây đƣợc trồng khoảng 100 năm nay (cùng với bắp cải, cà chua, cải bông). Những nơi trồng khoai tây sớm nhất là Thƣờng Tín (Hà Đông), Từ Sơn (Hà Bắc), Tú Sơn (Hải Phòng), ngoại thành Hà Nội với sản lƣợng chiếm 85% sản lƣợng khoai tây của Việt Nam. Ở Đà Lạt khoai tây đƣợc trồng quanh năm và chiếm 15% sản lƣợng. Vấn đề quan trọng cần lƣu ý trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại, đặc biệt là những bệnh do virus gây ra. Khoai tây có thể bị đơn nhiễm hoặc tạp nhiễm khoảng 30 loại virus, chủ yếu là Luteoviruses (PLRV), Potyviruses (PVY, PVA, PVV), Potexviruses (PVX) và Carlaviruses (PVM, PVS). Khoảng 50% số virus này sống kí sinh bắt buộc trên khoai tây, số còn lại thì có thể sống trên các loại cây khác. Các virus này có tính thích nghi cao và lây nhiễm dễ dàng thông qua củ bị nhiễm cũng nhƣ các yếu tố lan truyền khác. Virus và bệnh virus là một trong những nguyên nhân ức chế sự phát triển của khoai tây dẫn đến sự giảm sút về năng suất và chất lƣợng. Những bệnh do virus thƣờng khó phát hiện hơn các bệnh do vi khuẩn và nấm. Khi cây bị bệnh sẽ có các triệu chứng khác nhau nhƣ dạng khảm, đốm, xoắn lá, lá nhăn nheo và hoại tử. Bệnh thƣờng gây thiệt hại nặng khi bị nhiễm nhiều loại virus cùng lúc (ví dụ năng suất có thể giảm 80% khi nhiễm cùng lúc virus PVX và PLRV (Salaza, 1982) và chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng canh tác. Một nghiên cứu tại Nigeria cho biết có khoảng 50% số mẫu nghiên cứu bị nhiễm cùng lúc PVX, PVY, PLRV và PVS. 4 Khi nhiễm nhiều virus thì bên cạnh việc các virus tác động tổng hợp còn ảnh hƣởng đến khả năng đề kháng với mầm bệnh khác. Ví dụ: Khi đã bị nhiễm PVX và PVY trƣớc đó thì tính kháng với PLRV giảm (Jayasinghe và ctv, 1989), tăng tính mẫn cảm với bệnh thối (Karla và ctv, 1989). Các kết quả nghiên cứu cho thấy có khoảng trên 20 loài rệp và côn trùng có thể là vectơ truyền bệnh virus trên khoai tây, trong đó chủ yếu là loại rệp Myzus persicae (Watson, 1956). 2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây 2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) - Virus PVX thuộc họ Flexiviridae, giống Potexvirus, là loại virus không có vỏ bọc, có cấu trúc xoắn đối xứng, sợi virus ngoằn ngoèo, dài 515 nm, đƣờng kính 13 nm (Brandes, 1964). Virus này có acid nucleic là một phân tử RNA (+ssRNA: +single strand RNA) trọng lƣợng phân tử là 2,1*106, chiếm 6% trọng lƣợng virus (Huisman và ctv, 1988), chứa khoảng 6435 base, có đuôi 3’ là poly A (Huisman và ctv, 1988), phần trăm về số mole tƣơng ứng giữa các nucleotide G, A, C và U là 22%, 32%, 24% và 22% (Knight, 1963). - PVX có vỏ protein có trọng lƣợng 30.000 dalton, chiếm gần 94% trọng lƣợng virus (Shaw và Larson, 1962). Trọng lƣợng phân tử của virus là 35*106 Da (Reichmann, 1959), thể tích của hạt virus là 0,73 cm3/g, hệ số lắng 117,7 S, điểm đẳng điện PI = 4,4, thời gian sống: 40 - 60 ngày, nhiệt độ bất hoạt trong khoảng 68 - 76oC tùy từng dòng virus. PVX duy trì hoạt lực ở 20oC trong vài tuần và trong glycerol hơn một năm, bị tiêu diệt khi xử lý bằng protease, phenol hay thuốc tẩy, hiệu giá virus: 10-5 - 10 -6 . - Với những đặc điểm trên, virus PVX có ký chủ giới hạn trong những cây thuộc họ cà (Solanaceae) và một số loại cây có quan hệ thân thuộc nhƣ Amaranthaceae và Chenopodiaceae. - Khi bị nhiễm virus PVX thì thƣờng biểu hiện triệu chứng nhẹ, ngầm, không thấy biểu hiện trên lá hoặc không tác động rõ ràng trên cây khỏe, tạo ra những đƣờng vằn hoặc là vết hoại tử nhăn nheo ở giữa các gân lá, có thể làm thiệt hại năng suất từ 10 – 20% tùy theo giống và phƣơng thức lây nhiễm (chỉ nhiễm PVX hoặc tạp nhiễm các loại virus khác). Bệnh chủ yếu lây nhiễm qua tiếp xúc với cây bệnh hoặc qua củ giống chứ không do rệp. Đây là điểm khác biệt giữa virus PVX với PVY và PLRV. 5 - Các biện pháp phòng trừ nhƣ dùng củ giống sạch bệnh, đốt cây bị nhiễm, giới hạn di chuyển trong phạm vi ruộng bị nhiễm thƣờng đƣợc sử dụng để hạn chế sự lây nhiễm của virus PVX. 2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y) - Virus PVY thuộc họ Potyviridae, giống Potyvirus, gồm có ba dòng chính là PVY O (phổ biến nhất), PVYN (gây hoại tử gân lá thuốc lá) và PVYC (gồm cả potato virus C, gây vết sần sùi trên lá), là nhóm virus hại thực vật lớn nhất, dạng sợi, xoắn ngoằn ngoèo, không có vỏ bọc, dài 730 nm, rộng 11 nm, đƣờng kính 3,3 nm (Varma và ctv. 1968). - Cấu trúc acid nucleic của virus PVY là sợi đơn RNA (+ssRNA : + single strand RNA) có trọng lƣợng phân tử là 3,1*106 chiếm 5,4 - 6,4% trọng lƣợng virus (Stace- Smith và Tremaine, 1970), có đuôi 3’ là poly A, đầu 5’ có một VPg (protein liên kết với genome). Kích thƣớc genome là 10,4 kb (Makkouk và Gumpf, 1974). - Vỏ protein của virus PVY có trọng lƣợng 34.000 dalton chiếm 93,6 - 94% trọng lƣợng virus, hệ số lắng của virus là 145 S (Huttinga, 1975), nhiệt độ bất hoạt: 50 - 62 oC, thời gian tồn tại trong ống nghiệm là 7 - 50 ngày ở nhiệt độ 18 - 22oC, hiệu giá virus từ 10-2 - 10-6. - Với các đặc điểm trên PVY có thể gây nhiễm khoảng 120 loài. Trong đó có thuốc lá, cà độc dƣợc (Datura stramonium) và Tinantia erecta với các triệu chứng từ nhẹ đến hoại tử lá nặng. Thông thƣờng PVYO, PVYC gây bệnh nặng hơn PVYN - Dòng PVYN phân bố chủ yếu ở Châu Âu, Châu Phi, và Nam Mỹ. gây ra các triệu chứng chủ yếu nhƣ hoại tử dạng điểm hay lan rộng ở mức độ nhẹ có thể không phát hiện đƣợc, thƣờng xuất hiện ở giai đoạn muộn của giai đoạn phát triển (ở vụ đầu). Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX Hình 2.1 Hình thái của virus PVX 6 Những triệu chứng thứ cấp có thể xuất hiện ở vụ sau khi đó triệu chứng chấm lốm đốm có thể quan sát đƣợc và thƣờng xuất hiện sớm trong mùa. - Dòng PVYO phân bố rộng khắp trên thế giới. Tùy từng loại khoai tây có thể gây ra hoại tử, chấm lốm đốm hoặc làm vàng lá non, rụng lá và chết trƣớc khi trƣởng thành. Khởi đầu, hoại tử là điểm hoặc lan tỏa trên lá non, có thể làm cong lá hoặc rụng lá. Triệu chứng thứ phát là cây lùn, giòn, lá nhăn nheo, nhàu nát. Đôi khi hoại tử xuất hiện ở tán lá hoặc đỉnh.Virus PVYO kết hợp với PVX gây ra hiện tƣợng khảm và nhăn. - Dòng PVYC gây triệu chứng sơ cấp nhƣ hoại tử, lốm đốm, nhăn nheo (hoại tử thƣờng ở cuống lá, lá, đỉnh), biểu hiện thứ cấp thƣờng xuất hiện vệt chấm, nhăn nheo hoặc lốm đốm. Hoại tử có thể xảy ra ở củ. - Để hạn chế sự thiệt hại do virus PVY gây ra, ngƣời ta đƣa ra các biện pháp quản lý nhƣ sử dụng giống sạch bệnh, sử dụng giống kháng, trồng sớm và loại bỏ cây bệnh. 2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus) - Virus PLRV thuộc họ Luteoviridae, giống luteovirus, có dạng cầu, đƣờng kính 24 nm, phân tử protein vỏ có trọng lƣợng 26 kDa (Smith và Harris, 1990). PLRV là virus RNA có mang một sợi RNA dƣơng (+) (+ssRNA: + single strand RNA), trọng lƣợng 6 kDa (Rowhani và Stace Smith, 1979), có mang 1 VPg (protein liên kết với genome), không có đuôi poly A và chứa sáu khung đọc mở (ORF – Open Reading Frame) (Van Der Wilk và ctv, 1997). Những khung đọc nằm ở đầu 5’ thì mã hóa cho các protein trực tiếp từ RNA genome (Matthews, 1991). Protein VPg và một protein 70 kDa (Van Der Wilk và ctv, 1997) đƣợc mã hóa bởi khung đọc đầu tiên (ORF1) (Gorbalenya và ctv, 1989). Khung đọc thứ hai (ORF0) mã hóa cho một protein 28 kDa chƣa rõ chức năng nhƣng khung đọc thứ ba (ORF1/2) đƣợc cho là mã hóa cho protein 108 kDa liên quan đến sự sao chép của virus (Koonin, 1991; Mayo và Ziegler – Graff, Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY Hình 2.3 Hình thái virus PVY 7 1996). Ba trong số sáu khung đọc này nằm ở đuôi 3’ và mã hóa cho phân tử protein vỏ (CP: coat protein) 23 kDa (ORF3), protein di chuyển 17 kDa (MP (P4) - Movement protein) (ORF4 nằm trong gen mã hóa protein vỏ nhƣng có khung đọc khác) (Sokolova và ctv, 1997) và một protein 56 kDa liên quan đến sự tƣơng tác giữa virus và vectơ rệp (ORF5) (Chay và ctv, 1996). Còn hai khung đọc khác ở đuôi 3’ là ORF6 và ORF7 đã đƣợc phát hiện nhƣng chƣa hiểu đƣợc chức năng của chúng (Ashoub và ctv, 1998). - Virus PLRV bị bất hoạt ở 70oC trong 10 phút, hiệu giá virus: 10-4, thời gian tồn tại trong nhựa cây khoảng 4 ngày ở 2oC và trong dịch trích từ rệp là 12 đến 24 giờ ở 25 oC (Murayama), là loại virus chỉ giới hạn ở mô libe của cây (Peter và ctv, 1981; Bagnall, 1988; Lobenstein và ctv, 1997; Singh và Sing, 1997). Virus PLRV có phổ ký chủ hẹp, không lây nhiễm qua nhựa cây nhƣng có thể lây nhiễm thông qua khoảng 10 loài rệp nhờ phƣơng thức liên kết bền vững giữa virus và rệp, tồn tại trong nhựa cây khoảng 4 ngày ở 2oC, trong rệp 12 - 24 giờ ở 25oC. - Virus PLRV là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất của khoai tây, có ở hầu hết các nƣớc trên thế giới làm giảm năng suất tới 90%. Những biểu hiện triệu chứng sơ cấp gây nên bởi sự lây nhiễm ở vụ đầu trên lá nhƣ lá bị cuốn lại ở đỉnh lá đặc biệt những lá ở gốc có xu hƣớng ở thế thẳng đứng và chuyển màu vàng nhạt, với các giống khác lá có màu hồng, đỏ hoặc tía. Sự lây nhiễm muộn có thể không rõ triệu chứng, những giống có độ nhạy cao củ bị thối ở hệ thống mạch. Triệu chứng thứ cấp ở cây trồng từ củ bị nhiễm bệnh làm lá gốc cuốn tròn, thẳng đứng, cây không phát triển và lá cuốn tròn trở nên cứng. Ngoài ra các biểu hiện nhƣ xoắn lá, còi cọc, hoại tử mạch libe và ảnh hƣởng đến sự tích lũy carbonhydrate trong lá cũng hiện diện trên khoai tây bị nhiễm virus PLRV. Virus PLRV có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng thực phẩm (khẩu vị), đây là một trƣờng hợp ngoại lệ vì rất ít virus ảnh hƣởng đến chất lƣợng thức ăn. - Để hạn chế những thiệt hại do nhiễm virus PLRV cần chọn cây khỏe, giống không bị nhiễm virus PLRV, nhổ bỏ cây nhiễm bệnh, phun thuốc trừ rệp, dùng giống kháng với virus PLRV. Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá Hình 2.5 Hình thái virus PLRV 8 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây Với đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn và đòi hỏi những dụng cụ máy móc hiện đại mới thực hiện đƣợc. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus hiện nay thƣờng dùng là: 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài * Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh chóng nhƣng không phải lúc nào cũng chính xác, vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết bệnh không phát ra ngoài, hoặc thời kỳ tiềm phục của bệnh quá dài nên khó phát hiện ngay đƣợc. Một số trƣờng hợp vết bệnh không rõ ràng. *Ngoài ra cũng có thể xem tế bào bị bệnh dƣới kính hiển vi để chẩn đoán một số bệnh virus nhƣ hoa lá thuốc lá có thể nhìn dƣới kính hiển vi thấy trong tế bào lông tơ lá có những tinh thể virus kết tinh hình lục giác. 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học * Gieo hạt để chờ khi cây mọc có phát bệnh hay không. Phƣơng pháp này thƣờng dùng trong kiểm dịch thực vật và để kiểm tra bệnh ở hạt giống. Là một phƣơng pháp tuy đơn giản, dễ làm nhƣng mất thời gian. * Dùng cây chỉ thị và lây bệnh nhân tạo Những cây chỉ thị là những cây cùng loại hay khác loại với cây ký chủ nhƣng rất nhạy cảm đối với bệnh virus và khi lây bệnh nhân tạo virus, trên cây chỉ thị tạo ra vết bệnh điển hình nhất. Có thể lây bệnh nhân tạo bằng dịch cây muốn chẩn đoán lên cây chỉ thị, hoặc ghép cành, ghép mắt cây chỉ thị lên cây bệnh. Để chẩn đoán bệnh virus X và virus Y hại khoai tây ngƣời ta dùng cây chỉ thị Nicotiana glutinosa, Nicotiana tabacum, Datura tatula, Gomphrena globosa hoặc dùng cà độc dƣợc (Datura stramomium) làm cây chỉ thị để chẩn đoán bệnh virus hoa lá thuốc lá. 2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ Chủ yếu dựa vào đặc điểm của virus có khả năng hấp thụ tia cực tím do virus có chứa acid nucleic. 2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây So sánh độ đục của dịch cây bằng máy đo độ đục, hoặc so sánh độ nhớt của dịch cây bằng bình đo độ nhớt. Phƣơng pháp này chỉ chẩn đoán bệnh virus nói chung, và chẩn đoán tƣơng đối đúng khi nồng độ virus trong dịch cây khá cao. 9 2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép Dùng kính hiển vi phân quang khảo sát dịch cây đang chảy. Phƣơng pháp này chỉ dùng đối với các virus có hình gậy, còn virus hình cầu không dùng đƣợc. 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử Trong nghiên cứu virus, kính hiển vi điện tử tia xuyên đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng nhƣ mô thực vật bị nhiễm bệnh. Ngƣời ta dùng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 2 - 3 chục ngàn lần trở lên. Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay thông qua làm tinh khiết và cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất. Có thể dùng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định đƣợc hai virus khác nhau trong một mẫu. Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu đƣợc cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh. 2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (0,1 ng / ml). So với với các kỹ thuật miễn dịch khác thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác. ELISA đƣợc dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Hai kỹ thuật ELISA đƣợc dùng nhiều là kỹ thuật ELISA trực tiếp (direct Double Antibody Sandwich - ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA). Các enzyme thƣờng dùng là β-galactosidaze, glucosidaze, peroxidaze và phosphataze kiềm (Vũ Triệu Mân, 2003). 10 2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich Gồm các bƣớc sau Bƣớc 1: Cố định kháng thể đặc hiệu của virus vào đĩa ELISA. Bƣớc 2: Cố định dịch cây (có chứa virus cần xác định) vào đĩa ELISA. Bƣớc 3: Cố định kháng thể có gắn enzyme. Bƣớc 4: Cho cơ chất nền là cơ chất của enzyme vào đĩa ELISA Kết quả đƣợc đọc trên máy đọc ELISA (ELISA reader) ở bƣớc sóng 405 nm. Để cố định màu sắc của đĩa ELISA, bảo quản trong tủ lạnh 4oC và cần xem vào khi khác có thể dùng dung dịch NaOH 3M nhỏ vào mỗi giếng 25 – 30 µl. 2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) Kỹ thuật này thƣờng đƣợc dùng để định tính và định lƣợng kháng thể hiện diện trong mẫu cần xác định. Gồm các bƣớc: Bƣớc 1: Cố định kháng nguyên lên thành giếng. Bƣớc 2: Cho tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể cần kiểm tra) vào. Bƣớc 3: Thêm cộng hợp kháng kháng thể có gắn enzyme vào. Bƣớc 4: Thêm cơ chất của enzyme vào để đọc kết quả (Vũ Triệu Mân, 2003). 2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) RT-PCR là một ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng để khuếch đại các phân tử RNA. Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR). Trƣớc hết RNA đƣợc chuyển thành cDNA (Complement Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzyme phiên mã ngƣợc từ Mo-MLV (murine leukemia virus) hoặc AMV (avian myeloblastosis virus). Primer sử dụng trong giai đoạn này có thể là primer ngƣợc của PCR giai đoạn sau (Antisense primer), có thể là Oligonucleotic dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các phân tử RNA), mà cũng có thể là các hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại nhờ Taq polymerase. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng Tth DNA polymerase cho cả hai giai đoạn. Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng thấp, RNA của virus, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp khác nhƣ Northern blot. Một kỹ thuật mới phát triển - kỹ thuật in situ RT-PCR cho phép khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame. 11 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen Phƣơng pháp RT-PCR chỉ cho biết kích thƣớc của đoạn gene ta có đƣợc, cho phép xác định đoạn gene đó có tồn tại trong virus hay không nhƣng chƣa thể kết luận về bản chất của nó, cụ thể là đoạn gen đó tƣơng ứng với gene gì, có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào, cá thể mang gene này có phải là biến thể mới không . Thông tin này chỉ có thể rút ra từ việc xác định trình tự nucleotide của gen đó. Hai phƣơng pháp chính trong xác định trình tự là phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phƣơng pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977). - Nguyên tắc của phƣơng pháp hóa học dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thƣớc khác nhau. - Nguyên tắc enzyme học của Sanger dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thƣờng, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau. Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR 12 Ở cả hai trƣờng hợp, các phân đoạn DNA sẽ đƣợc phân tách thông qua điện di trên gel polyacrylamide hay polymer trong các mao quản có khả năng phân tách hai đoạn DNA chỉ chênh lệch nhau một nucleotide. Với việc sử dụng một loại nucleotide có đánh dấu, kết quả trình tự cần xác định đƣợc đọc từ bản điện di. (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002). 2.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây 2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV Những nghiên cứu về bệnh virus thực vật nói chung và trên khoai tây nói riêng ở Việt Nam ngày càng phong phú và đa dạng, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung vào việc chẩn đoán và xác định bệnh. - Năm1967 Nguyễn Hữu Thụy (Ban điều tra cơ bản côn trùng bệnh cây) đã xác định sự có mặt của virus X khoai tây. - Từ năm 1973 – 1985, Vũ Triệu Mân đã xác định 7 virus chính gây hại trên khoai tây ở Việt Nam là PVY, PVX, PVA, PVS, PVM, PAMV, PLRV bằng phƣơng pháp cây chỉ thị, phƣơng pháp ELISA, phƣơng pháp hiển vi điện tử. - Các tác giả Nguyễn Viết Tùng, Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Kim Oanh đã nghiên cứu các môi giới truyền bệnh ở vùng Gia Lâm (Hà Nội) – vùng Xuân Mai (Hòa Bình) truyền bệnh virus khoai tây. - Từ năm 1980 – 1985, đề tài cấp nhà nƣớc chống bệnh virus, đã tổ chức phòng trừ bằng chọn lọc vệ sinh cho nhiều vùng sản xuất khoai tây ở miền bắc (Hà Nam, Nam Định, Hà Bắc, Hải Dƣơng, Hƣng Yên). - 1985 – 1992, Trƣờng Đại học Nông Nghiệp 1 đã đề xuất việc sản xuất khoai tây giống trên vùng cách li địa hình ngay ở đồng bằng sông Hồng chống bệnh virus có hiệu quả ở vùng Hà Tây. - Các virus PVX, PVY, PMV và một số virus khác đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất thử kháng huyết thanh tại trƣờng Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội. Kỹ thuật ELISA đƣợc sử dụng từ năm 1990, kỹ thuật PCR bắt đầu áp dụng từ năm 1995 để chẩn đóan bệnh. - Tại Trung tâm Nghiên cứu khoai tây Đà Lạt chỉ mới dừng lại ở kiểm tra ELISA trên các giống do Trung tâm sản xuất. 13 - Các kỹ thuật RT-PCR, giải trình tự chƣa đƣợc áp dụng phổ biến trong công tác chẩn đoán virus PLRV. 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV - Nie và Singh (2002) đã dùng kỹ thuật RT-PCR trong việc xác định trình tự nucleotide của PVY ở Châu Âu và Bắc Mỹ (PVYNTN gây đốm hoại tử ở củ ). Thông qua nghiên cứu này, họ muốn xác định khoảng cách di truyền và phƣơng pháp phân biệt các chủng PVY, đồng thời cũng giúp xác định những trình tự mới xuất hiện ở những vùng địa lí khác nhau do biến chủng từ PVYNTN. Nghiên cứu này dựa trên sự khác biệt ở đoạn gen P1 và 5’ - UTR. - Nie, Xianzhou, Singh và Rudra (2003) đã dùng kỹ thuật multiplex RT-PCR để phân biệt các chủng PVYN, PVYO và PVYNTN. - Nie và Singh (2000) đã sử dụng các primer ngẫu nhiên cho multiplex RT-PCR nhằm mục đích xác định sự hiện diện của virus và viroid trong rệp, lá và củ - Singh, Kurz, Boiteau và Moore (1997) đã dùng kỹ thuật PT-PCR để xác định sự hiện diện của PLRV trong rệp bắt từ ruộng khoai tây. Trong nghiên cứu này 3 loại rệp là Myzus persicae: green peach aphid; buckthorn aphid và potatoaphid Macrosiphum euphorbiae đƣợc lấy từ ruộng cây khoai tây thƣơng mại New Brunswick (1988-1994) đều cho kết quả dƣơng tính với PLRV. - Singh, Nie, Sing, Coffin và Duplessis (2002) cho rằng phản ứng RT-PCR bị ức chế bởi hợp chất phenolic từ mô cây. Nghiên cứu này xác định việc bổ sung Na2SO3 trong bƣớc cho dung dịch đệm li trích RNA có thể nâng cao hiệu quả của RT-PCR. Bởi vì Na2SO3 (Sodium sulphite) có khả năng ức chế hợp chất phenolic hiện diện trong quá trình ly trích RNA. - Công ty Monsanto Canada Inc đã thành công trong việc tạo ra giống khoai tây “Newleaf-plusTM Russet Burbank” với các dòng RBMT 21-129, RBMT21-350 và RBMT22-082 có khả năng kháng lại PLRV. Bằng cách chuyển gen CryIIIA từ Bacillus thuringensis và hai trình tự ORF1, ORF2 từ PLRV , quá trình chuyển gen đƣợc thực hiện nhờ Agrobacterium. 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 21 tháng 03 đến ngày 15 tháng 07 năm 2005 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA để phát hiện PVX, PVY và PLRV a. Nguồn mẫu thí nghiệm Tất cả các mẫu thí nghiệm đƣợc lấy từ năm phƣờng (5, 8, 9, 11 và 12) tại Đà Lạt, đƣợc bảo quản trong điều kiện -20oC. b. Hóa chất: Các loại hóa chất cần cho quá trình chẩn đoán đƣợc cung cấp đầy đủ trong các bộ kit Potato virus X - PVX test kit 480 test, potato virus Y - PVY test kit 480 test và potato leafroll virus - PLRV test kit 480 test (do Bio – Rad cung cấp) gồm có: - Dịch trích mẫu (Tampon De Broyage Extraction buffer 1X) - Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer) - Kháng thể + Đối với PVX và PVY dùng kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody) + Đối với PLRV dùng kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody) - Dịch rửa (PBS - Tween) - Đối chứng dƣơng (Positive control) - Đối chứng âm (Negative control) - Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (Conjugate buffer) - Kháng thể gắn enzyme alkaline-phosphatase (Conjugate antibodies) - Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu - Chất chỉ thị màu p-NPP Ngoài ra cần phải chuẩn bị - Cồn 70o - Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng 15 3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV 3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA RNA đƣợc ly trích theo quy trình của kit ly trích (The Aurum total RNA mini kit ) do Bio-Rad sản xuất Những loại hóa chất có sẵn trong kit: - Dịch trích mẫu (Lysis solution) 50 ml - Dịch rửa nhẹ 5X (Low stringency wash solution) 20 ml - Dịch rửa mạnh (High stringency wash solution) 40 ml - DNase I dạng bột 1 hủ - Dịch pha loãng DNase I 10 ml - Dịch hòa tan RNA (Elution solution) 10 ml Bên cạnh đó ta phải chuẩn bị một số hóa chất sau : - Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP) 2% - Tris-base - β-mercaptoethanol 14,2 M - Ethanol 95 - 100% - NaOH 0,1 M - EDTA 1M 3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR *Giai đoạn tổng hợp cDNA Dùng kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit) do Bio - Rad cung cấp với thành phần nhƣ sau: - Hỗn hợp phản ứng đã pha sẵn (5X iScript Reaction Mix)100 µl. Hỗn hợp này đã đƣợc trộn với primer poly T (oligo dT) và các hexamer ngẫu nhiên, chúng có khả năng bắt cặp với những RNA mục tiêu khác nhau. Hỗn hợp này sẽ cho kết quả tối ƣu với những sản phẩm < 1 kb. - Nƣớc không nhiễm enzyme thủy phân nucleotide (Nuclease free water) 1,5 ml. - Enzyme phiên mã ngƣợc (iScript Reverse Transcriptase) 25 µl, là enzyme MMLV với hoạt tính RNAse H+ có độ nhạy cao hơn những enzyme có hoạt tính RNAse H-. Enzyme này đƣợc bổ sung thêm chất ức chế enzyme phân hủy RNA (RNAse). Ta chỉ cần bổ sung thêm RNA và chạy theo chu trình nhiệt của kit. + Giai đoạn thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các phân tử cDNA 16 - cDNA đƣợc lấy từ quá trình tổng hợp ở trên. - Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease free water) - Dung dịch đệm PCR (10X PCR buffer) - MgCl2 50 mM - Hỗn hợp dNTP 10 mM - iTaq polymerase 5 U / µl - Primer với trình tự nhƣ sau : Sense primer: 5’CGC GCT AAC AGA GTT CAG CC 3’ Antisense primer: 5’GCA ATG GGG GTC CAA CTC AT 3’ Bên cạnh đó cần phải chuẩn bị một số hóa chất khác nhƣ: - Agarose (Promega - Mỹ) - Loading dye 6X - Thang chuẩn (ladder) 100bp (Bio – Rad) - TAE 0,5X 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Nội dung nghiên cứu - Điều tra tình hình nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt thông qua việc thực hiện phản ứng ELISA trên các mẫu thu thập tại các phƣờng. - Kiểm tra các mẫu có phản ứng ELISA dƣơng tính với virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR. - Giải trình tự đoạn DNA có đƣợc từ sản phẩm RT-PCR để khẳng định nguồn gốc của đoạn gen đó, đánh giá mức độ tƣơng đồng với gen của virus PLRV có trên ngân hàng gen. 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu Công tác điều tra tình hình bệnh virus trên khoai tây ở thành phố Đà Lạt đƣợc tiến hành nhƣ sau - Liên hệ Phòng Nông nghiệp, Chi cục Bảo vệ Thực vật và Trạm Khuyến nông thành phố để điều tra tình hình phân bố diện tích, chủng loại giống, vùng tập trung và các yếu tố liên quan đến bệnh virus trên khoai tây từ đó xác định địa bàn tiêu biểu cần điều tra. 17 - Điều tra tại các hộ nông dân có trồng khoai tây theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu nhƣ: Đặc điểm vƣờn trồng, chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh. Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Tùy theo diện tích có thể lấy từ 5 - 10 mẫu /vƣờn theo đƣờng chéo. Mẫu là toàn bộ thân cây, đƣợc cho vào bao nylon có ghi nhãn cẩn thận về thời gian, địa điểm, chủ vƣờn, loại cây, tuổi cây, triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu đƣợc cho vào thùng xốp và đƣợc giữ lạnh cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu. - Mẫu đƣợc đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện đƣợc giữ lạnh và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc tp.Đà Lạt STT Địa điểm Lấy mẫu Tổng số mẫu Giống Tuổi cây Thế hệ 06 07 1T 1.5T 2T 2.5T 3T F1 F2 F3 1 2 3 4 5 Phƣờng 5 Phƣờng 8 Phƣờng 9 Phƣờng 11 Phƣờng 12 32 24 54 18 23 22 0 0 0 0 10 24 54 18 23 5 0 15 0 0 6 0 10 8 0 6 0 12 0 13 10 0 0 0 0 5 24 17 10 10 16 11 32 0 11 0 13 22 10 12 16 0 0 8 0 Tổng cộng 150 22 128 20 24 31 10 66 70 57 24 T: tháng 3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV 3.3.3.1 Phát hiện PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA Sử dụng phƣơng pháp dDAS-ELISA (direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) theo sự hƣớng dẫn thực hiện của bộ kit và đƣợc tiến hành qua 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: Thực hiện 1 lần ly trích virus để kiểm tra cả virus PVX, PVY và PLRV. Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA. Giai đoạn 1: Ly trích mẫu Trƣớc tiên ta phải dùng nƣớc cất vô trùng (chuẩn bị trƣớc) để pha dịch ly trích mẫu từ 20X xuống còn 1X. Dịch trích đƣợc pha loãng để dùng ly trích cả PVX, PVY và PLRV. Tổng số mẫu cần nghiền là 135 mẫu Các mẫu đƣợc lấy ra từ tủ lạnh -20oC, cắt lấy phần thân, chồi non hoặc gân chính của lá (có cả phiến lá) và cân khoảng 0,5 gam cho vào cối. 18 Hút 2,5 ml dung dịch trích mẫu, dùng chày nghiền mẫu cho đến khi các thành phần đều nát vụn. Đổ dịch mẫu vừa nghiền xong vào eppendoff 1,5 ml. Sau đó ta đem li tâm với tốc độ 5000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC. Đem mẫu cất vào tủ mát (2 - 8oC) để dùng sau. Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA Bƣớc 1 Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu. Theo chỉ dẫn của kit, ta bỏ hàng A và H; bỏ cột 12. Do đó đĩa ELISA 96 giếng chỉ kiểm tra đƣợc 27 mẫu, mỗi mẫu đƣợc cho vào 2 giếng. Mỗi đĩa đều đƣợc ghi số thứ tự từ 1 đến 5 và tên của virus đang thực hiện chẩn đoán. Sơ đồ bố trí trên đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H BF: Buffer 1; 2…; 27: Số thứ tự của mẫu PC (Positive control) : Đối chứng dƣơng NC (Negative control): Đối chứng âm Substrate: Cơ chất Bƣớc 2 Pha loãng kháng thể (kháng thể 1) bằng dung dịch đệm (tỷ lệ pha theo bảng dƣới đây). Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm Kháng thể 10ml 100µl 10ml 100µl 10ml 20µl 19 Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất vào cột số 1. Cũng với pipet trên ta hút kháng thể cho vào các giếng từ cột số 2 đến số 11 (100 µl / giếng). Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Sau đó rửa 3 lần với PBS-Tween bằng máy rửa đĩa ELISA. Bƣớc 3 - Trƣớc tiên ta phải hòa tan đối chứng dƣơng và đối chứng âm với cùng một thể tích nƣớc là 1ml - Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (substrate). - Cho 100 µl đối chứng dƣơng vào 2 ô PC (Positive control). - Cho 100 µl đối chứng âm vào 2 ô NC (Negative control). - Cho dịch trích mẫu vào (100 µl / giếng). Tổng cộng 135 mẫu sẽ đƣợc cho vào 5 đĩa, mỗi đĩa 27 mẫu, mỗi mẫu 2 giếng theo bố trí ở bảng 3.1. - Dùng keo trong dán kín mặt đĩa, đem ủ qua đêm trong tủ mát 2 - 8oC. Sau đó đem rửa 3 lần với PBS - Tween. Trong bƣớc này cần chú ý các điểm sau đây. - Cần ghi lại chính xác kí hiệu của mẫu tƣơng ứng với số thứ tự của mẫu trên đĩa. - Thao tác cẩn thận tránh hiện tƣợng nhiễm chéo. Bƣớc 4 - Pha loãng kháng thể gắn enzyme (Conjugate antibodies) (kháng thể 2) trong dung dịch đệm theo tỉ lệ cho trong bảng dƣới đây. Kháng thể này đƣợc pha trong đĩa petri. Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm 1X Kháng thể gắn enzyme 10ml 100µl 10ml 100µl 10ml 20µl - Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (Substrate). - Dùng pipet 8 đầu hút kháng thể đã pha loãng vào mỗi giếng từ cột số 2 đến số 11 (100 µl / giếng). Dùng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ 37oC trong 2 giờ. Sau đó rữa 3 lần với PBS - Tween. 20 Bƣớc 5 Chuẩn bị cơ chất tạo màu: p-NPP (p - nitrophenyl phosphate) có trong kit ở dạng viên rắn. Ta phải xác định lƣợng cơ chất cần thiết cho sự hiển thị màu. Sau đó đem những viên này đi nghiền nát ra và cho vào dung dịch đệm với tỷ lệ cho dƣới đây. Dùng một hủ nhựa nhỏ để hòa tan chất tạo màu và sau đó đổ ra đĩa petri. Dùng pipet 8 đầu, hút 100 µl p-NPP vào mỗi giếng từ cột số 1 đến số 11. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ 37oC và đọc kết quả. Bảng 3.4. Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu Hóa chất PVX PVY PLRV Dung dịch đệm 1X p - NPP (2 viên 5 mg) 10 ml 5 mg 10 ml 5 mg 10 ml 5 mg Bƣớc 6 Đọc kết quả bằng máy đọc của hãng Bio - Rad với bƣớc sóng 405 nm tại các thời điểm 30 phút, 1giờ sau khi ủ với chất tạo màu. OD mẫu = OD đọc (thô) – OD trung bình của các giếng có cơ chất (Substrate). OD mẫu so với ngƣỡng (ngƣỡng = hai lần trung bình OD của đối chứng âm). POS: Kết quả dƣơng tính-nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt quá ngƣỡng. NEG: Kết quả âm tính – Không nhiễm bệnh khi OD của mẫu dƣới ngƣỡng. Bên cạnh đó kết quả cũng có thể đƣợc đánh giá bằng mắt thƣờng thông qua sự đổi màu của các giếng: - Nếu màu đậm tƣơng đƣơng hoặc cao hơn so với đối chứng dƣơng: Đánh giá nhiễm bệnh - Nếu giếng không màu tƣơng đƣơng hoặc thấp hơn so với đối chứng âm: Đánh giá không nhiễm bệnh. 3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR Các mẫu sau khi đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn ra để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Trong đề tài này chúng tôi chỉ thực hiện phản ứng RT- PCR trên đối tƣợng virus PLRV. Tiêu chuẩn chọn mẫu để thực hiện RT-PCR - Dƣơng tính. - Trị số dƣơng tính từ máy đọc phải cao. 21 - Triệu chứng đƣợc quan sát phải đặc trƣng và biểu hiện ra ngoài. - Mẫu đƣợc bảo quản tốt (còn tƣơi). Dựa trên những tiêu chí trên, ta chọn ra đƣợc 5 mẫu đại diện cho 5 phƣờng tại thành phố Đà Lạt - Phƣờng 5: Mẫu 148 - Phƣờng 8: Mẫu 97 - Phƣờng 9: Mẫu 45 - Phƣờng 11: Mẫu 92 - Phƣờng 12: Mẫu 10 Kỹ thuật RT-PCR đƣợc sử dụng là 2 bƣớc (two steps), tức là gồm giai đoạn tổng hợp cDNA (Reverse) và giai đoạn khuếch đại cDNA (PCR). Virus PLRV đƣợc phát hiện dựa trên một đoạn gen có kích thƣớc 336 bp, mã hóa cho phân tử protein vỏ. Quá trình thực hiện phải qua 2 giai đoạn: Ly trích RNA, tổng hợp và khuếch đại cDNA nhờ phản ứng RT-PCR. Giai đoạn 1: Ly trích RNA Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA (The Aurum total RNA kit). Tuy nhiên để thực hiện đúng yêu cầu ta phải chuẩn bị trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau: - Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử