Nghiên cứu nhân giống các dòng Bạch Đàn lại UE35 và UE56 giữa Eucalyptus Urophylla và E. Exserta bằng phương pháp nuôi cấy mô

ôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào. Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp chiếu đèn tử ngoại. Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác. 1.4 Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải đảm bảo các điều kiện: - Nhiệt độ: 25 - 300C - Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux. Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài. 1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống 1.5 Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các bước tiếp theo. Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để nuôi cấy. Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ 17 Bạch đàn E. urophylla có thể mọc lẫn với Bạch đàn E. alba (Martin and Cossalater, 1975 - 1976). Bạch đàn urô là cây thích hợp với các lập địa có đất sâu ẩm ở các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng trung tâm miền Bắc là Lewotobi và Egor Flores (Nguyễn Dương Tài, 1994; Lê Đình Khả, 1996). Egor Flores cũng là một trong những suất xứ có triển vọng nhất ở Mang Linh và Lang Hanh của vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 1996, Phạm Văn Tuấn và cs, 2001). 1.6.2 exserta) Bạch đàn liễu (E. exserta) là loài cây gỗ nhỡ đến gỗ lớn khi mọc trên những nơi đất tốt và lượng mưa cao có thể cao đến 25m, đường kính 60 cm - 1m ở những nơi khô cạn thì cao đến 10-15m và chiều dài đoạn thân dưới cành ngắn, dưới 1/2 chiều cao của đoạn thân (Bolandetal, 2006) trong khoảng 1500m dọc bờ biển Bạch đàn liễu có phân bố tự nhiên ở phía Đông bang Queenland đến phía Bắc của Newsouth Wale trong khoảng 1500km từ 140-260 vĩ độ Nam và 1400- 1550 kinh độ Đông dọc theo bờ biển. Đây là loài có khả năng thích ứng rộng với các điều kiện khí hậu và đất đai khác nhau, từ vùng đất thấp ven biển, đất xấu, đất dốc ngèo dinh dưỡng, vùng đất đồi, có thể sống trên đất cát nghèo dinh dưỡng, trên đất đồi trơ sỏi đá và trên đất thịt nặng. Song sinh trưởng tốt nhất trên đất bồi tụ, giàu dinh dưỡng. Bạch đàn liễu sinh trưởng ở độ cao gần mặt biển đến 900m trên mặt biển, từ nhiệt độ 2-160C của tháng lạnh nhất nhiệt độ tối cao trung bình của tháng nóng nhất 26-360C. Bạch đàn liễu có gỗ lõi màu đỏ nâu, có vân đẹp và có độ bền lớn có khối lượng riêng 905-1000kg/m3 (Boland et al, 2006). Giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn caman (Eucalyptus camaldulensis) với Bạch đàn đỏ (E. robusta) đã được Lê Đình Khả phát hiện 1970 tại các rừng trồng Bạch đàn caman (E. camaldulensis) tại các tỉnh Nghệ An, Quảng Ninh, Phú Thọ, Thái Nguyên, với tỷ lệ 2-3%. Giống lai có hình thái thân cây, vỏ cây, lá, hoa, quả và giải phẫu như chiều dày lá, số lượng và kích thước tế bào khí khổng, chiều dày vỏ 18 hạt, chiều dày lá mầm, khối lượng 1000 hạt, v.v… Thể hiện tính trung gian giữa hai loài bố mẹ, đồng thời có sinh trưởng nhanh hơn rõ rệt so với các loài cây bố mẹ. Ở giai đoạn 7 tuổi Bạch đàn lai có đường kính 9,9 - 14,4 cm, chiều cao 5,1 - 11,4 m, thì Bạch đàn đỏ có đường kính là 4,3 - 9,7 cm, chiều cao 3,4 - 6,9 m; còn Bạch đàn caman có các chỉ tiêu này tương ứng là 1,8 - 6,3 cm và 3,1 - 7,4 m (Lê Đình Khả, 1970), nghĩa là giống Bạch đàn lai tự nhiên này có thể tích thân cây gấp 4 - 5 lần các loài cây bố mẹ. Điều thú vị là ngay từ khi phát hiện ra đời F2 của Bạch đàn lai tự nhiên có hiện tượng phân ly theo kiểu nhị hạng thức bậc n dạng (a + b) n, theo 5 dạng khác nhau với tỷ lệ phân ly theo phần trăm là 1,7: 14,0: 58,4: 8,3: 1,0 mà cây lai F2 thiên về hệ mẹ là Bạch đàn caman (Lê Đình Khả, 1970). Đáng tiếc trong thời kỳ này do chưa có kỹ thuật giâm hom thích hợp nên Bạch đàn lai đã không được phát triển vào sản xuất ở Việt Nam. Một số nơi đã thử xây dựng vườn giống bằng cây ghép song cũng không thành công. Lai nhân tạo cho các loài Bạch đàn E. urophylla, E. exserta và E. camaldulensis ở Việt Nam đã được trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thực hiện từ năm 1997. Đến năm 2000 hơn 60 tổ hợp lai giữa 3 loài nói trên đã được tạo ra, trong đó một số dòng hoặc tổ hợp lai sinh trưởng gấp 1,5 - 2 lần bố mẹ. Một bộ giống gồm nhiều tổ hợp lai khác loài UC, UE, EU, UC, và UU đã được khảo nghiệm so sánh với các xuất xứ tốt nhất của các loài bố mẹ như UEgon, U27, U28, U29, E1, E2, E4. Khảo nghiệm được tiến hành tại Thụy Phương (Hà Nội), Cẩm Quỳ (Hà Tây) và một số vùng khác trong nước. Khảo nghiệm đã cho thấy lai thuận nghịch ở những điều kiện lập địa khác nhau, sinh trưởng của các tổ hợp lai cũng thay đổi theo từng điều kiện lập địa. Ví dụ, ở Thụy Phương tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất là giống Bạch đàn urô với Bạch đàn caman. Trong khi ở Ba Vì các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất lại là giữa Bạch đàn urô và Bạch đàn liễu (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2002). Sau khi đã tạo được tổ hợp lai và khảo nghiệm giống lai đã chọn lọc được một số cây trội trong các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất, vượt xuất xứ Egon 19 Flores của E. urophylla (xuất xứ tốt nhất) về thể tích lá 51,3 - 247,4% (có thể tích thân cây gấp 1,5 - 3,5 lần giống sản xuất tốt nhất). Năm 2001 Bộ NN&PTNT đã có quyết định số 4356 (ngày 19/9) công nhận 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai U29E1, U29E2, U29C3, U29C4, U29U4, U29U26, U15C4, U30E5 (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001). Các giống lai này đã được Nguyễn Việt Cường và cs (2007, 2008) tiếp tục khảo nghiệm ở một số nơi từ đó đã chọn được các dòng vô tính sinh trưởng nhanh đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống quốc gia hoặc giống tiến bộ kỹ thuật. Khảo nghiệm tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy các dòng Bạch đàn lai được chọn có một số dòng sinh trưởng vượt trội rõ rệt so với các dòng đối chứng như: U6, GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc biệt là các dòng U29E1.24, U29E2.5, U15E4.83. Những dòng này có chỉ số thể tích (Iv = D 2H) bằng 70,4 - 73,9, trong khi dòng Bạch đàn GU8 có chỉ số thể tích 50,3, còn các dòng khác như PN2, PN14 và U6 có chỉ số thể tích thân cây là 23,5 - 31,7 (Lê Đình Khả et al, 2003). Một số tổ hợp lai khác loài mới giữa các loài E. tereticornis (T), E. pellita (P), E. camandulensis (C) và E. urophylla (U) được tạo ra sau này và khảo nghiệm tại Minh Đức (tỉnh Bình Dương) cũng thấy rằng sau 2 năm các tổ hợp lai T1P17, C1P17, P18U29C3, v.v… có thể đạt thể tích thân cây 21,8 - 26,1 dm3/cây, trong lúc giống U29 có thể tích thân cây 9,7 dm3/cây, một số giống sinh trưởng kém nhất trong khảo nghiệm chỉ đạt 6,8 - 8,5 dm3/cây (Nguyễn Việt Cường, 2006). Theo quy trình trồng Bạch đàn urophylla của ta (04-TCN-26-2001) quy định mật độ trồng rừng là 1100 - 1660 cây/ha. Song kết quả nghiên cứu của Stape C.R., C.R. Silva (2007) cho nhiều công thức mật độ trồng Bạch đàn khác nhau tại Brazin đã thấy là mật độ 500-900 cây/ha chưa cho năng suất cao, mật độ 1500 cây/ha bắt đầu có năng suất cao, những mật độ khác năng suất tăng lên không đáng kể. Vì thế với Bạch đàn chúng tôi chỉ dùng một mật độ trồng 1660 cây/ha với các công thức bón phân khác nhau. 24 P. radiate ở viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. taera và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ. Darus H. Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô tế bào cây keo tai tượng (Accasia mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều cao >0,5cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (O. L. Gamborg, G. C. Phillips, 1997). Người ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cây mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang được áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng (Nguyên Quang Thạch, 2000). Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona grandis). Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo được 500 cây nuôi cấy mô từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ 1 cây non trong một năm. Kaosaard (1990) cho biết Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm (Ikemori, Y.K., 1987). Perhutani (Indonesia, 1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử. Nhân giống nuôi cấy mô tế bào đối với cây rừng đã thu được những thành công đáng kể, đây là một khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các loài Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea), Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus caribaea) và Thông lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Austraylia… (Dr. Phundan sigh, 2001). W.Nitiwattanachai (Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R., 1990) đã nuôi cấy thành công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân 25 nhanh chồi là MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ là White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA. Cũng với cây Keo tai tượng, V.J. Hartney và cs thuộc (Division of Forest Research) đã sản xuất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 40C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút (sharma, J.K., 1994). 1.7.2. N cây gỗ Bạch đàn là một trong các loài cây trồng rừng chính của Việt Nam, không chỉ đối với trồng rừng tập trung mà còn cả đối với trồng cây phân tán, trồng cây trong các hộ gia đình. Cho tới trước những năm 1970 đã có trên 50 loài Bạch đàn được khảo nghiệm ở Việt Nam và từ đó đến nay đã có hàng chục loài được khảo nghiệm trên diện rộng với khá nhiều xuất xứ làm cơ sở cho chọn loài và xuất xứ sinh trưởng nhanh phục vụ trồng rừng đại trà (Lê Đình Khả, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Hoàng Trương, 1993). Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh Phú Thọ, Công ty giống lâm nghiệp trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp… Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu. Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và keo lai có năng suất cao. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cây mô tế bào cho Keo lai, Bạch đàn và một số cây rừng khác (Lê Đình khả và cs, 2003). 28 CHƢƠNG 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Xác định môi trường (hoá học và vật lý) phù hợp để nhân giống 2 dòng UE35 và UE56 của bạch đàn lai giữa (E. urophylla x E. exserta) bằng phương pháp nuôi cấy mô. Tạo ra cây con hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho các dòng UE35 và dòng UE56. Huấn luyện và cấy cây con ra vườn ươm. 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu nhân giống cho 2 dòng UE35 và dòng UE56. Hai dòng này đã được tuyển chọn và trồng khảo nghiệm dòng vô tính tại trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. Dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 đã được tuyển chọn thông qua khảo nghiệm dòng vô tính và được cho là nhóm có sinh trưởng tương đối nhanh. Hai dòng Bạch đàn UE35 và UE56 là cây trội được chọn từ các tổ hợp lai U29E2 và U29E4, đây là những tổ hợp lai thuộc nhóm có sinh trưởng nhanh thích hợp cho trồng rừng trên đất nghèo dinh dưỡng đồi núi miền Bắc. Dòng UE35 được tạo ra từ đề tài lai giống Bạch đàn (Lê Đình Khả, 2001), đã qua khảo nghiệm giống. Cây lấy mẫu là cây 1,5 tuổi trồng tại Trung tâm giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và chồi gốc của cây 3 năm trồng thí nghiệm tại Cẩm Quỳ (Hà Nội) (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001) và (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, Ngô Minh Chí, 2007). 29 Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở chồi 15 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chồi được cắt bỏ phần ngọn non, một phần cuống lá mà toàn bộ phiến lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 - 3cm, đường kính từ 2 - 3mm mang từ 2-3 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 - 6. Đề tài tiến hành nghiên cứu ở phòng thí nghiệm và vườn ươm tại Trung tâm nghiên cứu giống cây lâm nghiệp thuộc Viện khoa học Việt Nam và khu nuôi cấy mô tế bào - Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 2.3. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục đích nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau đây: 1. Khử trùng mẫu vật nuôi ở các nồng độ khác nhau của HgCl2 và Ca (0Cl)2 trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra chất khử trùng mẫu thích hợp. 2. Nuôi cấy mẫu trong 5 loại môi trường và xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi. 3. Thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin B2 tới hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH) của quá trình nuôi cấy. 4. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng phối hợp của chúng đến HSNC và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH). 5. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng của chúng đến hiệu quả của giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn tạo rễ). 6. Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm. 30 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu UE35 và UE56 Dòng tuyển chọn Tạo cây hom Khử trùng mẫu (Bằng dung dịch HgCl2 hoặc Ca (ClO)2 hay các hoá chất có tính diệt khuẩn khác ở các nồng độ khác nhau) Tạo chồi ban đầu (Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp) Nhân chồi (Xác định môi trường nhân chồi thích hợp được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP và Kinetin ở các nồng độ khác nhau) Tạo rễ (Tạo rễ in-vitro: Xác định môi trường và phương pháp ra rễ hiệu quả) Vƣờn ƣơm * Cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt. Khử trùng mẫu bằng chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được tiến hành qua các bước: Rửa xà phòng loãng Rửa dưới vòi nước chảy Tráng nước cất Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5 - 15 phút Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất từ 3-5 lần Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng 35 Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi đã thu được môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA là tốt nhất cho HSNC và TLCHH của 2 dòng. Tuy nhiên, để tìm ra môi trường thích hợp hơn cho nhân nhanh chồi. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Kinetin với tổ hợp BAP và NAA. Kinetin được bổ sung vào môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA với hàm lượng thay đổi là: Bảng 2.6: Công thức thí nghiệm nhân chồi Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng Kinetin ĐC ĐC 0 CT 39 MS* + mg/l BAP + mg/l NAA + 0,5 mg/l CT 40 1,0 mg/l CT 41 1,5 mg/l CT 42 2,0 mg/l 2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ IBA được bổ sung vào môi trường 1/2 MS* + 15 mg/l đường + 5 g/l agar, pH = 6,5. IBA ở nồng độ thay đổi là: Bảng 2.7: Công thức thí nghiệm ra rễ Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng IBA ĐC ĐC 0 CT 44 1/2 MS* + 1,0 mg/l CT 45 2,0 mg/l CT 46 3,0 mg/l CT 47 4,0 mg/l 36 2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ Để xác định ảnh hưởng của nồng độ IBA và ABT1 đến quá trình hình thành rễ của hai dòng UE35 và UE56, đề tài bổ sung ABT1 vào môi trường 1/2MS*+ 30g/l đường + 5,0g/l agar + mg/l IBA + nồng độ ABT thay đổi như sau: Bảng 2. 8: Công thức thí nghiệm ra rễ Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng ABT1 ĐC ĐC 0 CT 44 1/2 MS* + mg/l IBA + 1,0 mg/l CT 45 2,0 mg/l CT 46 3,0 mg/l CT 47 4,0 mg/l 2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm Trước khi đưa cây con trong ống nghiệm ra trồng ở vườn ươm, đề tài chuyển các bình cây (cây hoàn chỉnh ở trong bình) ra môi trường bên ngoài, mục đích để cây con làm quen dần với điều kiện ngoài vườn ươm (gọi là giai đoạn huấn luyện). Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh sáng từ 5.000 - 10.000 lux, không cho ánh nắng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây. Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút ngắn hoặc kéo dài so với sản xuất. Chúng tôi thử nghiệm 5 khoảng thời gian huấn luyện cây con. Huấn luyện cây để ở ánh sáng và nhiệt độ trong điều kiện tự nhiên: - Không huấn luyện (0 ngày) - 4 ngày - 12 ngày - 16 ngày 37 Sau khi huấn luyện, cây con được trồng ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến hành đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trưởng của cây để đánh giá ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây trong giai đoạn vườn ươm. Quá trình lấy cây con ra khỏi bình, trồng cây vào bầu đất và chăm sóc cây ngoài vườn ươm được tiến hành theo các bước kỹ thuật được thực hiện tại Trung tâm giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và khu công nghệ tế bào Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 1. Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nhựa PE có đường kình 5,5 cm, cao 11 cm, có đục lỗ dưới đáy. Thành ruột bầu là đất tầng B 100% đập nhỏ, sàng bỏ rễ cây và các tạp chất khác. 2. Xử lý bầu: Trước khi cấy 1-2 ngày, bầu đất được xử lý khử trùng mầm bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hoà thuốc tìm vào nước và dùng ô doa tưới lên bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm). 3. Lấy cây ra khỏi bình và cấy vào bầu - Tạo hỗn hợp hồ rễ: Trộn đất tầng B với dung dịch thuốc tím 0,1% với tỷ lệ thể tích đất/dung dịch thuốc tím = 1/1 trước khi ra cây 12-24 giờ. - Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt từng cây ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch. Nhúng rễ cây vào hỗn hợp hồ rễ - Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất đã được xử lý và để bay hơi sau 1 ngày. 4. Chăm sóc cây sau khi cấy: Cây sau khi cấy được che bằng lưới đen (độ tàn che 50-60%) 10-15 ngày sau khi cấy. Sau 2 tuần tưới phân NPK tỷ lệ (5:10:3) nồng độ 0,3%, sau khi tưới rửa lại bằng nước sạch. Phun phòng nấm bệnh bằng dung dịch Bellate nồng độ 5g/10 lít nước, 1 tuần một lần. Thu thập tỷ lệ sống và đo chiều cao của cây sau khi cấy 4 tuần. 2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau: 38 - Ánh sáng: Mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ 1500 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ngày. - Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì từ 23-250C (±2) - Độ ẩm thường xuyên xấp xỉ 60% 2.4.5. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp (Andrew. I, 1991, số 71, 39 trang). Với thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng, thí nghiệm chọn loại môi trường, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu (ống nghiệm, đánh giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy qua HSNC). Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 6 mẫu. Môi trường chứa trong bình tam giác, đánh giá kết quả HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy. Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường tạo rễ, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 30 chồi. Môi trường được chứa trong bình trụ đường kính 6cm hoặc 10cm, chiều cao 15 - 20 cm, với nắp nilong quấn nịt cao su kép. Thu thập tỷ lệ ra rễ, số rễ tạo thành và chiều dài của rễ sau 2 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm, mỗi công thức theo dõi 30 bình và đo đếm 30 cây tại vườn ươm. 2.4.6 * Thu thập số liệu + Các chỉ tiêu đo đếm trong phòng thí nghiệm: 1. Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100 Tổng số mẫu ban đầu 2. Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống x 100 Tổng số mẫu ban đầu 3. Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = Tổng số mẫu nảy chồi x 100 Tổng số mẫu thí nghiệm 43 Ảnh 3.1. Khử trùng mẫu và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày 3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu Bảng 3.2: Bảng ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi Tháng Dòng UE35 Dòng UE56 Thời gian bật chồi Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) 1 - 3 53,84 3,24 45,22 2,15 32 ngày 4 - 6 52,56 12,53 41,35 13,10 28 ngày 7 - 9 42,91 15,76 46,22 16,05 27 ngày 10 - 12 65,24 4,25 50,05 5,63 36 ngày Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng UE35 tháng 4-6 kết quả khử trùng với chỉ số tỷ lệ mẫu nhiễm là 52,56%, tỷ lệ mẫu bật chồi là 12,53% trong 28 ngày và tháng 7-9 mẫu nhiễm là 42,9%, mẫu bật chồi là 15,76% ở thời gian này trong năm với thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất; dòng UE56 ở tháng 4-6 kết quả khử trùng với chỉ số tỷ lệ mẫu nhiễm là 41,35, tỷ lệ mẫu bật chồi là 13,10 trong 28 ngày và tháng 7-9 mẫu nhiễm là 46,22, mẫu bật chồi là 16,05 ở thời gian này trong năm với thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất. Cũng như một số giống cây rừng nói chung, thời gian khử trùng mẫu thích hợp nhất là từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm. Trong khoảng thời gian này, kết quả khử trùng đạt được là cao nhất (tỷ lệ nhiễm 44 thấp, tỷ lệ bật chồi cao và thời gian bật chồi cũng ngắn nhất) do đây là thời điểm sinh trưởng thích hợp của các đối tượng nghiên cứu. Tuy nhiên, để xác định chính xác thời gian thích hợp nhất cho các thí nghiệm khử trùng, đề tài tiếp tục các thí nghiệm lặp lại trong thời gian tới. Nhằm tối ưu hoá từng khâu trong quá trình nhân giống để xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nhân giống cho các đối tượng nghiên cứu. 3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi Để có sự thành công đối với nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thì giai đoạn quan trọng đó là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho đối tượng cần nhân giống. Với các công bố về môi trường nhân giống cây Bạch đàn còn hạn chế, thêm vào đó chưa có môi trường cụ thể nào và có độ tin cậy cao cho dòng Bạch đàn lai. Do vậy, đề tài thử nghiệm một số môi trường, sử dụng để nhân giống các loài cây thân gỗ. Từ đó chọn ra môi trường thích hợp cho nghiên cứu hai dòng Bạch đàn trên. Trong điều kiện nuôi cấy mô tế bào HSNC và TLCHH phụ thuộc vào thành phần môi trường, nồng độ chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Các nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi, giai đoạn có vai trò quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống. Kết quả được trình bày bảng dưới đây. Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 5 loại môi trƣờng đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trƣờng) Loại môi trường Dòng UE35 Dòng UE56 Số chồi thu được HSNC (lần) Số chồi thu được HSNC (lần) Litvay 200 1,11 192 1,07 WPM 184 1,02 170 0,94 MS * 213 1,18 211 1,17 MS 173 0,96 165 0,92 WV3 195 1.08 186 1,03 (MS *: là môi trường MS cải tiến có bổ sung thêm một số vitamin và khoáng chất) 48 ¶nh 3.4a. Chồi nuôi cấy trong môi trƣờng MS* có bổ sung 2.0 mg/l vitamin B2 Đồ thị 3.1b. ¶nh hƣởng của vitamin B2 đến TLCHH của UE35 và UE56 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ vitamin B2 (mg/l) TLCHH (%) Dòng UE35 Dòng UE56 Đồ thị 3.1a. ¶nh hƣởng của vitamin B2 đến HSNC của hai dòng UE35 và UE56 56 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ vitamin B2 (mg/l) HSNC (lần) Dòng 35 Dòng 56 (lần) 50 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng trong môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH Các đề tài ghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho thấy chất điều hoà sinh trưởng là rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả của giai đoạn trong nhân giống. Nó ảnh hưởng đến HSNC (đó là khả năng nhân nhanh chồi, TLCHH) và TLCHH (Đoàn Thị Ái Thuyên và cs, 2001). Với đề tài này, chất điều hoà sinh trưởng Cytokinin là BAP, Kinetin và nhóm Auxin đó là NAA, IBA, ABT1. 3.5 TLCHH BAP là chất kích thích tạo chồi tốt cho quá trình nhân nhanh, nó được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Với kết quả theo dõi ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và dòng UE56 và được trình bày tại bảng 3.4 và đồ thị 4a, 4b. Kết quả thấy rằng BAP có ảnh hưởng tích cực đến quá trình nhân chồi, sinh trưởng và chiều cao chồi nuôi cấy. Khi tăng nồng độ từ 0 - 2mg/l thì thấy khả năng nhân chồi là rất rõ. Còn ở công thức không có BAP (đối chứng) thì HSNC và TLCHH của dòng UE35 là 1,43 lần và 19%, dòng 56 là 1,37 lần và 17,5%. Ở môi trường nồng độ BAP là 2,0 mg/l có HSNC và TLCHH của UE35 là 2,16 lần và 24,2%, dòng UE56 là 2,02 lần và 22,3%. Nhưng khi tăng nồng độ từ 2,0 - 3,0 mg/l thì HSNC và TLCHH của cả 2 dòng đều giảm (dòng UE35 là 1,96 lần, TLCHH là 18,7%; dòng UE56 là 1,78 lần và 15,9%). Còn nồng độ 4,0 mg/l thì cả 2 dòng HSNC và TLCHH đều giảm mạnh (dòng UE35 là 1,91 lần và 12,5%; dòng UE56 là 1,63 lần và 12,9%). Ở môi trường có nồng độ BAP là 4,0mg/l xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh, chồi hình thành không rõ rệt thân, lá, ngọn những chồi này không có tác dụng cho những lần nhân chồi tiếp theo cũng như cấy chuyển sang môi trường tạo rễ do vậy không được đo đếm. Nhiều chồi cấy hình thành khối callus to ở gốc. Như vậy thấy rằng nồng độ BAP cao đã ức chế sinh trưởng và phát triển của chồi. Theo G. J de Klerk, 1999 nồng độ BAP cao sẽ kìm hãm sự phát triển của quần thể chồi, chồi sinh trưởng và phát triển không bình thường, mất sắc tố diệp lục. 51 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) Nồng độ BAP (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Chất lượng chồi Số chồi thu được Chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) Số chồi thu được Chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) 0,0 258 49 1,43 19,0 246 43 1,37 17,5 + 1,0 327 72 1,82 22,0 332 64 1,84 19,3 + + 2,0 388 94 2,16 24,2 363 81 2,02 22,3 + + + 3,0 353 66 1,96 18,7 320 51 1,78 15,9 + + 4,0 344 43 1,91 12,5 294 38 1,63 12,9 + Ghi chú: + : Chồi sinh trưởng kém ++ : Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình +++: Chồi sinh trưởng tốt, mập Biểu đồ 3.2a. ¶nh hƣởng của BAP đến HSNC của 2 dòng UE35 và UE56 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Nồng độ BAP (mg/l) Hệ số nhân chồi (lần) Dòng UE35 Dòng UE56 55 - HSNC và TLCHH ở các công thức nồng độ IAA có sự khác nhau với α = 0,05 vì bảng Anova cho thấy giá trị Sig của F < 0,05 ở cả 2 chỉ tiêu HSNC và TLCHH của 2 dòng. - Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thấy: HSNC của dòng UE35 và UE56 ở nồng độ 0,5 mg/l là tốt nhất. TLCHH của dòng UE35, UE56 ở nồng độ 0 và 0,5; 1,0 mg/l là những nồng độ tốt nhất trong nhóm. 3.5 * TLCHH Do các nồng độ của IAA ảnh hưởng không nhiều đến HSNC và TLCHH của 2 dòng nghiên cứu, bên cạnh đó NAA cũng là chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thường có tác dụng mạnh hơn IAA ở đa số loài thực vật (Trần Văn Minh, 1994); (Nguyễn Văn Uyển, 1993); (Vũ Văn Vụ, 1994). Do đó để tìm ra tổ hợp BAP và auxine thích hợp cho nhân nhanh chồi của 2 dòng Bạch đàn lai này, ngoài IAA đề tài còn nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ của NAA đến HSNC và TLCHH. Đề tài bổ sung NAA với các nồng độ đó là: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l vào môi trường MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 30 mg/l đường + 5 g/l agar, pH= 6,5 (môi trường tốt nhất ở mục 3.4.1). Kết quả được trình bày bảng 3.7 và đồ thị 6a, 6b. Hình 3.5. ¶nh của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH 0BAP 0,5 mg/l -NAA 1,0 mg/l -NAA 1,5 mg/l -NAA 56 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức) Nồng độ NAA (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Chất lượng chồi Chồi thu được Số chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) Chồi thu được Số chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) 0 396 97 2,20 24,5 369 84 2,05 22,8 ++ 0,5 438 117 2,43 26,7 416 106 2,31 25,5 ++ 1,0 470 133 2,61 28,3 437 119 2,43 27,2 +++ 1,5 392 73 2,18 18,6 382 66 2,12 17,3 + 2,0 363 44 1,02 12,1 354 40 1,97 11,3 + Qua bảng số liệu trên ta thấy, tổ hợp BAP + NAA có tác động tích cự rõ hơn tổ hợp BAP + IAA đến HSNC và TLCHH, chỉ tiêu theo dõi tăng ở nồng độ 0,5 - 1,0 mg/l (dòng UE35 là 2,43 lần, 2,67%; dòng UE56 là 2,31 lần, 25,5% và dòng UE35 là 2,61 lần, 28,3 %; dòng UE56 là 2,43 lần, 27,2%). Môi trường có bổ sung với nồng độ NAA là 1,5 - 2,0 mg/l thì HSNC và TLCHH đều giảm rõ rệt so với nồng độ 1,0 mg/l, điều này chứng tỏ với nồng độ NAA cao sẽ tác động hạn chế đến tỷ lệ nhân chồi của 2 dòng Bạch đàn lai nói trên. Ở nồng độ 0,5 và 1 mg/l chồi mập, sinh trưởng và phát triển tốt, lá xanh, cây khoẻ, thân lá rõ ràng hơn khi bổ sung IAA. Môi trường bổ sung nồng độ NAA lên 2,0 mg/l thì chiều cao của chồi thấp, hình thái chồi cằn cỗi, hình thành nhiều rễ ở thân chồi (phụ lục 11). Biểu đồ 3.4a. ¶nh hƣởng sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC của dòng UE35 và UE56 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ NAA (mg/l) HSNC (lần) Dòng UE35 Dòng UE56 57 Phân tích phương sai về ảnh hưởng của NAA đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 cho thấy (phụ lục 11): Giá trị Sig trong bảng kiểm tra phương sai tổng thể của 2 chỉ tiêu HSNC = 0,171 > 0,05, TLCHH = 0,510 > 0,05. Như vậy, các biến ngẫu nhiên của 2 chỉ tiêu trên có phương sai bằng nhau. - Giá trị Sig trong bảng phân tích phương sai thì HSNC và TLCHH đều bằng 0,00 < 0,05, vậy các công thức có bổ sung nồng độ NAA thấy khác nhau rõ rệt với 2 chỉ tiêu được đánh giá có mức độ tin cậy 95%. - Bảng phân nhóm Duncan cho thấy HSNC cao nhất ở nồng độ 1,0 mg/l, TLCHH ở 2 nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l là một nhóm cao nhất, với độ tin cây 95%. Tương tự với dòng UE56 ta thấy: phương sai của biến ngẫu nhiên bằng nhau, phân tích phương sai thu được kết quả HSNC và TLCHH ở các công thức là khác nhau rất rõ. Nồng độ 1,0 mg/l với HSNC và TLCHH lần lượt là: 2,43 lần và 27,2% với độ tin cậy 95%. Với kết quả phân tích từ bảng biểu trên, môi trường MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, pH = 6,5 là tốt nhất cho nhân chồi 2 dòng UE35 và UE56. Môi trường này được thí nghiệm tiếp cho nhân nhanh chồi tiếp theo. Việc thử nghiệm tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng này (BAP + NAA) phù hợp với một số nghiên cứu trong và ngoài nước (Mai Đình Hồng, 1999); (Đoàn Thị Nga, 2003); (Daurus H. Alunad, 1994); (Semsuntud N. and Nitiwattanachai. W., 1992), tuy nhiên với mỗi loài cây thì nồng độ sử dụng cũng khác nhau. Đặc biệt các công bố của Đoàn Thị Mai và cs, 2000, 2005, 2008; Đoàn Thanh Nga, 2003 đều sử dụng tổ hợp BAP + NAA để nhân giống nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn một số dòng và một số cây rừng khác, ở nồng độ khác nhau. 61 thấp hơn so với BAP + NAA. Vậy nên đề tài nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng của sự phối hợp Kinetin với tổ hợp BAP + NAA. Kinetin được bổ sung vào môi trường thí nghiệm 3.4.3 là: MS* + 2,0 mg/l + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA + 30 g/l đường + 5 g/l agar, pH = 6,5, với nồng độ Kinetin là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9 và đồ thị 8a, 8b. Ở môi trường không bổ sung Kinetin thì HSNC và TLCHH của dòng UE35 là 2,67 lần và 27,9%; dòng UE56 là 2,42 lần, 27,3%. Hai chỉ tiêu này được tăng lên khi bổ sung ở nồng độ 0,5 mg/l thì dòng UE35 là 3,01 lần, 30,5%; dòng UE56 là 2,59 lần, 27,5%. Còn ở nồng độ 1,0 mg/l thì 2 chỉ tiêu này giảm so với nồng độ 0,5mg/l là (dòng UE35 là 2,83 lần, 29,8%; dòng UE56 là 2,71 lần, 28,3%). Nồng độ 1,5 và 2,0 mg/l thì 2 chỉ tiêu này đều giảm. Theo dõi quá trình phát triển của chồi cho thấy khi bổ sung Kinetin nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l chồi sinh trưởng tốt, lá có mầu xanh non. Nhưng khi tăng nồng độ lên 1,5 mg/l, 2,0 mg/l xuất hiện nhiều cụm chồi nhỏ, mảnh, mướt các đốt của đoạn chồi dài không rõ thân lá và ngọn. Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/ công thức) Nồng độ Kinetin (mg/l) Dòng UE35 Dòng UE56 Chất lượng chồi Số chồi thu được Số chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) Số chồi thu được Số chồi hữu hiệu HSNC (lần) TLCHH (%) 0 480 134 2,67 27,9 436 119 2,42 27,3 ++ 0.5 541 165 3,01 30,5 466 128 2,59 27,5 +++ 1,0 510 152 2,83 29,8 488 138 2,71 28,3 +++ 1,5 478 87 2,66 18,2 435 78 2,42 17,9 + 2,0 447 70 2,48 15,7 381 48 2,12 12,6 + 62 Dòng UE35 Dòng UE56 ¶nh 3.7. Chồi nuôi cấy có bổ sung 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP + 1.0 mg/l NAA + 0.5 mg/l Kinetin Biểu đồ 3.6b. ¶nh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến TLCHH 2 d òng UE35 và UE56 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ Kinetin (mg/l) TLCHH (%) Dòng UE35 Dòng UE56 đến HSNC của 2 dòng UE35 và UE56 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ Kinetin (mg/l) HSNC (lần) Dòng UE35 Dòng UE56 Biểu đồ 3.6a. ¶nh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin 67 Nồng độ ABT1 cho hiệu quả tốt nhất là 1,0 mg/l với dòng UE35 tỷ lệ chồi ra rễ đạt 82,1%, số rễ trung bình là 2,85 rễ/cây, chiều dài trung bình của rễ là 1,29 cm. Còn dòng UE56 các chỉ số là 81,7%, 2,59 rễ/cây, chiều dài trung bình 1,16 cm. Ở những nồng độ cao hơn tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ đều giảm mạnh ở cả 2 dòng, quan sát thấy khi tăng nồng độ lên 1,5 và 2,0 mg/l xuất hiện nhiều rễ bị đen, chiều dài rễ ngắn hơn so với nồng dộ 1,0 mg/. - Phân tích phương sai về ảnh hưởng của nồng độ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của dòng UE35 thấy (phụ lục 15): - Chỉ tiêu tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig = 0,457 > 0,05 trong bảng kiểm tra phương sai tổng thể nên đề tài sử dụng so sánh phương sai để đánh giá sự sai khác. Chỉ tiêu Biểu đồ 3.8b. của 2 dòng UE35 và UE56 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ IBA + ABT1 (mg/l) Số rễ trung bình (rễ/cây) Dòng UE35 Dòng UE56 Biểu đồ 3.8a. ¶nh hƣởng của nồng độ IBA + ABT1 tới tỷ lệ ra rễ của 2 dòng UE35 và UE56 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Nồng độ IBA + ABT1 (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Dòng UE35 Dòng UE56 ¶nh hƣởng của nồng độ IPA + ABT1 tới số rễ trung bình 68 số rễ trung bình/cây có Sig = 0,03 < 0,05 nên đề tài sử dụng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 để so sánh. - Kết quả phân tích phương sai trong bảng Anova thấy tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig của F= 0,00 < 0,05 vậy tỷ lệ ra rễ ở các công thức có sự sai khác rõ rệt. Chiều dài trung bình của rễ cũng thay đổi rõ rệt, bảng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 cho thấy số rễ trung bình/cây ở các công thức nồng độ có sự sai khác rõ rệt. Sai khác có độ tin cậy với α = 0,05. - Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thu được công thức có nồng độ ABT1 bằng 0,5 mg/l là tốt cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ với độ tin cậy 95%. - Phân tích tương tự như trên, ở dòng UE56 được tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dai trung bình của rễ ở các công thức có nồng độ khác nhau rõ rệt với α=0,05. Công thức với nồng độ 0,5 mg/l ABT1 là tốt nhất cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình rễ với độ tin cậy 95%. Ảnh 3. 8. Chồi nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung ABT1 sau 15 ngày nuôi cấy 3.5. Đưa cây con ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nó có ý nghĩa đến ứng dụng quá trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất. Đề tài thử nghiệm ảnh hưởng của 5 khoảng thời gian huấn luyện cây con như sau: Không huấn luyện; huấn luyện 4, 8, 12, 16 ngày để nghiên cứu tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con ở vườn ươm. Kết quả thu được sau 4 tuần ngoài vườn ươm là: 69 Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại vƣờn ƣơm sau 1 tháng (90 cây mạ/công thức) Thời gian huấn luyện (ngày) Dòng UE35 Dòng UE56 Tỷ lệ sống (%) Chiều cao trung bình (cm) Tỷ lệ sống (%) Chiều cao trung bình (cm) 0 45,6 6,26 44,4 6,20 4 75,7 6,30 72,2 6,27 8 93,3 6,43 92,2 6,40 12 92,2 6,40 92,2 6,37 16 86,7 6,17 87,8 6,20 (Thời gian huấn luyện 28/8/2007 - 28/9/2008) Từ kết quả bảng trên, thời gian huấn luyện có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ sống của cây con tại vườn ươm. Cây con không được huấn luyện đạt tỷ lệ sống rất thấp (dòng UE35 là 45,6%, dòng UE56 là 44,4%). Tỷ lệ sống tăng lên với thời gian huấn luyện 4 ngày, 75,6% dòng UE35 và 72,2% ở dòng UE56. Thời gian huấn luyện 8 ngày đạt tỷ lệ sống giảm không đáng kể, tỷ lệ sống giảm ít ở thời gian huấn luyện 16 ngày. Qua quan sát thấy với công thức 16 ngày rễ của cây con trong bình thường bị đen, xuất hiện nhiều rễ chết, có thể đã chết sau khi cấy ra vườn ươm. Ngược lại với tỷ lệ sống, chiều cao trung bình ở cả 2 dòng thay đổi không đáng kể ở các công thức. So sánh phương sai về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của 2 dòng thu được kết quả (phụ lục 16): với dòng UE35 có giá trị Sig trong bảng phương sai tổng thể của chỉ tiêu tỷ lệ sống bằng 0,250, của chỉ tiêu chiều cao trung bình bằng 0,556. Dòng UE56 có giá trị Sig của chỉ tiêu tỷ lệ sống là 1,71, chỉ tiêu chiều cao trung bình 1,71. Như vậy phương sai của biến ngẫu nhiên bằng nhau. Bảng phân tích phương sai thu được kết quả Sig trong bảng Anova, chỉ tiêu tỷ lệ sống ở 2 dòng đều bằng 0,00. Vì thế, tỷ lệ sống của 2 dòng ở các công thức có 74 Cây cung cấp vật liệu đưa mẫu vào Chồi cấy; mẫu cấy sau 20 ngày nuôi cấy; chồi cấy dùng nhân nhanh Mẫu được cấy trong môi trường nhân nhanh Chồi cấy sang môi trường ra rễ; cây huấn luyện và cấy ra ngoài bầu đất Cấy ra ngoài bầu đất sau 1 tháng 77 24. Nguyễn Thị Tâm (2003), Những tinh dầu lưu hành trên thị trường, NXB khoa học và kỹ thuật, tr. 51-55 25. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2000), Bài giảng môn học công nghệ sinh học. 26. Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1995), “Nhân giống Keo lai bằng nuôi cấy mô phân sinh”, Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ giai đoạn 1990- 1995, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 27. Nguyễn Luyện, “Tìm hiểu về cây bạch đàn E. urophylla”, Tạp chí lâm nghiệp (số 10, tháng 10/1991). 28. Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phân viện Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 58-97. 29. Vũ Văn Vụ (1994), Sinh lý học thực vật, Nhà xuất bản Khoa học - Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 182 - 237. 30. Vũ Ngọc Phượng và cộng sự, (2002), “Nhân giống in vitro cây Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) và Tre mạnh tông (Dendrocalamus asper)”, Tạp chí sinh học (số 6), tr. 59-64. Tài liệu tiếng Anh 31. Bhat K. M. and Hwanok Ma (2004), Teak growers unite, in ITTO tropical forest update, pp. 3-4. 32. Boland D. J., M. I. H. Brooker, G. M. Chippendale, N. Hall, B. P. M. Hyland, R. D. Jonhson, D. A. Kleing, M. W. Mcdonald and J. D. Turnor (2006), Forest Tree of Australia (Sixth edition)- CSIRO, ERSIS, Mellbourne, pp. 330 - 331, 736 p. 33. Darus H. Ahmad (1994), “Multiplication of Acacia mangium by stem cutting and tissue culture techniques”, Advances in tropical acacia research, pp. 32-34. 34. Gamborg. O. L, G. C. Phillips (1997), “Plant Cell, Tissue and Organ culture-bG Fundamental Methods cell spinger”, Lab Manual. 78 35. Ikemori Y. K. (1987), “Epicormic shoots from branches of Eucalpytus grandis as an explant source for in vitro culture”, Commw. For. Rev. (66), pp. 351-356. 36. Litvay J. D et al (2002), Plant cell and tissue culture media, Duchefa Biochemie, Hofmanweg 71 2031 BH Haarlem, The Netherlands, p. 44. 37. Lloyd G and McCown B (1980), Commercially - feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot - tip culture, Int. Plant. Proc. 30, pp. 410 - 421. 38. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A resied medium for rapid growth and bioassays wirh tobacco tissue cultures”, Physiol. Plant (15), pp. 473-495. 39. Nambiar E. K. S. and A. G. Brown (1997), Management of Soil, Nutrients and Water in Tropical Plantation Forests, ACIAR- CSIRO- CIFOR, 571 p. 40. Nitsch J.P and Nitsch C. (1969), “Tea chrysanthemum improvement through tissue culture”. Science (85), pp. 47 - 53. 41. Phundan Sigh, Genetics Today, Kalyani Publishers (2001). 42. Street (1974), Plant tissue and cell culture, Bormonogrvol, Black well scient, London. 43. Sharma J. K. (1994), Pathological investigations in forest nurseries and plantations in Vietnam, FAO VIE/92/022. Hanoi, Vietnam. 46 p 44. Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R. (1990), The role of Cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globolus grown in vitro, Aust. For. 53(4), pp. 221-223. 45. V. J. Hartney và cs, Division of Forest Research, (Sharma, J. K., 1994) 46. W. Nitiwattanachai (Trindate, H. Ferreina, J.G. Pais, M.S. Aloni, R., 1990) 79 PHỤ LỤC Phụ lục 01. Thành phần môi trƣờng Litvay §a l•îng CaCl2 16. 61 mg/l 0. 15 mM KH2PO4 340. 00 2. 50 mM KNO3 1900. 0 0 18. 79 mM MgSO4 903. 38 7. 51 mM NH4NO3 1650. 00 20. 61 MM Vi l•îng CoCl2.6H2O 0.125 mg/l 0. 53 M CuSO4 0.500 2. 00 M FeNaEDTA 36.700 0. 10 mM H3BO3 31.000 0. 50 mM KI 4.150 25. 00 M MnSO4. H2O 21.000 0. 12 mM Na2MoO4.2 H2O 1.250 5. 17 M ZnSO4.7 H2O 43.000 0. 15 mM V i t a m i n Myo-Inositol 100.00 mg/l 0. 56 mM Nicotinic acid 0.50 4. 06 M Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.1 0. 49 M Thiamine HCl (vitamin B1) 0.1 0. 30 M 84 Phụ lục 06. Phân tích kết quả khử trùng mẫu cấy ► Dòng UE35. Ty l e song (% ) 1. 549 5 12 . 247 Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. ► Dòng UE56. 85 Ty l e s ong (% ) 786. 395 5 157. 279 24. 860 . 000 75. 919 12 6. 327 862. 314 17 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al S um of S quares df M ean S quare F S i g. 3 27. 2200 3 27. 2233 3 28. 3333 28. 3333 3 32. 2200 32. 2200 3 34. 4467 3 46. 1100 . 616 . 083 . 300 1. 000 P hut 20 12 30 10 40 11 S i g. Duncan a N 1 2 3 4 S ubset for al pha = . 05 M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed. Us es Harm oni c M ean S am pl e S i z e = 3. 000.a. 88 Phụ lục 8. ¶nh hƣởng của nồng độ B2 đến HSNC và TLCHH ► Dòng UE35. . 683 4 10 . 620 1. 914 4 10 . 185 He s o nhan c hoi (l an) Ty l e choi huu hi eu (% ) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. . 136 4 . 034 35. 231 . 000 . 010 10 . 001 . 146 14 69. 844 4 17. 461 14. 158 . 000 12. 333 10 1. 233 82. 177 14 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al He s o nhan c hoi (l an) Ty l e c hoi huu hieu (% ) S um of S quares df M ean S quare F S i g. 3 1. 1900 3 1. 4167 3 1. 4167 3 1. 4267 3 1. 4467 1. 000 . 296 Nong do vi t am i nB 2 (m g/ l ) . 0 1. 0 3. 0 4. 0 2. 0 S i g. Dunc an a N 1 2 S ubs et for al pha = . 05 M eans for groups i n hom ogeneous s ubs ets are di s pl ay ed. Us es Harm oni c Mean S am pl e S i z e = 3. 000.a. 90 Phụ lục 9. ¶nh hƣởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH ► Dòng UE35. 1. 244 4 10 . 353 . 753 4 10 . 579 He s o nhan c hoi (l an) Ty l e choi huu hi eu (% ) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. . 854 4 . 214 271. 428 . 000 . 008 10 . 001 . 862 14 234. 546 4 58. 636 59. 655 . 000 9. 829 10 . 983 244. 375 14 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al He s o nhan c hoi (l an) Ty l e c hoi huu hieu (% ) S um of S quares df M ean S quare F S i g. 3 1. 4333 3 1. 8167 3 1. 9133 3 1. 9600 3 2. 1567 1. 000 1. 000 . 069 1. 000 Nong do B A P (m g/ l ) . 0 1. 0 4. 0 3. 0 2. 0 S i g. Dunc an a N 1 2 3 4 S ubs et for al pha = . 05 M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s play ed. Us es Harm oni c Mean S am pl e S i z e = 3. 000.a. 3 12. 4967 3 18. 7067 3 19. 0000 3 22. 0167 3 24. 2067 1. 000 . 725 1. 000 1. 000 Nong do B A P (m g/ l ) 4. 0 3. 0 . 0 1. 0 2. 0 S i g. Dunc an a N 1 2 3 4 S ubs et for al pha = . 05 M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s play ed. Us es Harm oni c Mean S am pl e S i z e = 3. 000.a. 91 ► Dòng UE56. 93 ► Dòng UE56. . 127 4 10 . 969 1. 052 4 10 . 428 He s o nhan c hoi (l an) Ty l e choi huu hi eu (% ) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. . 294 4 . 073 297. 662 . 000 . 002 10 . 000 . 296 14 115. 604 4 28. 901 9. 107 . 002 31. 733 10 3. 173 147. 337 14 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al He s o nhan c hoi (l an) Ty l e c hoi huu hieu (% ) S um of S quares df M ean S quare F S i g. 3 1. 8000 3 1. 8633 3 1. 9167 3 2. 0667 3 2. 1833 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 Nong do IA A (mg/ l ) 2. 0 1. 5 1. 0 . 0 . 5 S i g. Dunc an a N 1 2 3 4 5 S ubs et for al pha = . 05 M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed. Us es Harm oni c M ean S ampl e S i z e = 3. 000.a. 95 ► Dòng UE56. 1. 760 4 10 . 213 1. 694 4 10 . 227 He s o nhan c hoi (l an) Ty l e choi huu hi eu (% ) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. . 435 4 . 109 196. 458 . 000 . 006 10 . 001 . 440 14 509. 303 4 127. 326 193. 897 . 000 6. 567 10 . 657 515. 869 14 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al He s o nhan c hoi (l an) Ty l e c hoi huu hieu (% ) S um of S quares df M ean S quare F S i g. 97 ► Dòng UE56. 1. 247 4 10 . 352 9. 323 4 10 . 002 He s o nhan c hoi (l an) Ty l e choi huu hi eu (% ) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. 100 ► Dòng UE56. 4. 684 4 10 . 022 1. 245 4 10 . 353 He s o nhan c hoi (l an) Ty l e choi huu hi eu (% ) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. 101 Phụ lục 14. ¶nh hƣởng của IBA đến hiệu quả ra rễ ► Dòng UE35. 2. 509 4 10 . 109 2. 955 4 10 . 075 Ty l e ra re (% ) S o re TB (re/ c ay) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. 6211. 424 4 1552. 856 453. 609 . 000 34. 233 10 3. 423 6245. 657 14 2. 671 4 . 668 27. 354 . 000 . 244 10 . 024 2. 915 14 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al Ty l e ra re (% ) S o re TB (re/ c ay ) S um of S quares df M ean S quare F S i g. 103 3 1. 280 3 1. 807 3 1. 833 3 2. 027 3 2. 527 1. 000 . 078 1. 000 Nong do IB A (mg/ l ) . 0 4. 0 1. 0 3. 0 2. 0 S i g. Duncan a N 1 2 3 S ubset for al pha = . 05 M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed. Us es Harm oni c M ean S am pl e S i z e = 3. 000.a. 37 . 4811 90 . 6578 90 . 7111 90 . 8600 90 1. 0878 1. 000 . 294 1. 000 1. 000 Nong do IB A (mg/ l ) . 0 4. 0 3. 0 2. 0 1. 0 S i g. Duncan a , b N 1 2 3 4 S ubset for al pha = . 05 M eans for groups i n hom ogeneous subs et s are di s pl ay ed. Us es Harm oni c M ean S ampl e S i z e = 69. 958.a. The group s i z es are unequal . The harm oni c m ean of t he group s i z es i s us ed. Ty pe I error l evel s are not guarant eed. b. 104 Phụ lục 15. ¶nh hƣởng của sự phối hợp giữa nồng độ IBA + ABT1 đến ► Dòng UE35. . 988 4 10 . 457 4. 059 4 10 . 033 Ty l e ra re (% ) S o re TB (re/ c ay) Levene S t at i st i c df1 df2 S i g. 106 2633. 151 4 658. 288 55. 195 . 000 119. 267 10 11. 927 2752. 417 14 1. 371 4 . 343 18. 722 . 000 . 183 10 . 018 1. 555 14 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al Ty l e ra re (% ) S o re TB (re/ c ay ) S um of S quares df M ean S quare F S i g. 107 Phụ lục 16. ¶nh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ► Dòng UE35. 1. 595 4 10 . 250 . 794 4 10 . 556 Ty l e song (% ) Chi eu c ao t rung bi nh (c m) Levene S t at i s ti c df1 df2 S i g. 4664. 667 4 1166. 167 48. 862 . 000 238. 667 10 23. 867 4903. 333 14 . 137 4 . 034 1. 907 . 186 . 180 10 . 018 . 317 14 B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al B et ween Groups W i t hi n Groups Tot al Ty l e song (% ) Chi eu c ao t rung bi nh (c m ) S um of S quares df M ean S quare F S i g. 3 45. 667 3 75. 667 3 86. 667 3 92. 000 3 93. 333 1. 000 1. 000 . 141 Thoi gian huan l uy en (ngay ) 0 4 16 12 8 S i g. Dunc an a N 1 2 3 S ubs et for al pha = . 05 M eans for groups in hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed. Us es Harm oni c M ean S am pl e Si z e = 3. 000.a. ► Dòng UE56. 2. 000 4 10 . 171 2. 000 4 10 . 171 Ty l e song (% ) Chi eu c ao t rung bi nh (c m) Levene S t at i s ti c df1 df2 S i g. 108