Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loại bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrhyza DB2

heo công thức: Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G + C) + 3,30C. Sau khi tính được nhiệt độ nóng chảy theo lý thuyết, chúng tôi đã tiến hành PCR thử nghiệm với các nhiệt độ khác nhau và đã chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 500C trong thời gian một phút. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ ở 720C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ làm việc tối ưu của Pfu DNA polymerase và thời gian thì đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng 2 kb. Ngoài ra, khi bắt đầu phản ứng chúng tôi đã cho chạy trước bước khởi động nóng ở 950C trong 4 phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số. Sau khi kết thúc 25 chu kỳ, chúng tôi đã đặt nhiệt độ 720C trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp DNA được kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ 40C. Sản phẩm PCR sau đó đã được kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả trên hình 3.3 cho thấy sản phẩm PCR của mẫu bèo tấm rất đặc hiệu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 1 2 M Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% M: Thang DNA chuẩn 1 kb 1: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR 2: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR là 2 kb đối với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR và 1 kb đối với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR, đúng với dự đoán của gen cần nhân. Sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm tách dòng gen tiếp theo. 3.2.2.2. Tách dòng trong vector pJET1.2 Nhằm mục đích tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter, chúng tôi tiến hành gắn sản phẩm PCR đã nhân được ở giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 vào vector pJET2.1 sử dụng bộ hóa chất GeneJETTM PCR Cloning Kit. Ưu điểm của việc sử dụng Kit này là thao tác đơn giản, tiện lợi, nhanh và hiệu quả. Vector pJET1.2 có chứa điểm khởi đầu sao chép rep (pMB1) nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli. Gen kháng Amp có trên vector cho phép chọn lọc những tế bào có mang vector này trên môi trường có Amp. Ngoài ra, vector này còn chứa gen eco471IR mã hóa cho nuclease phân hủy DNA nhân gây chết tế bào vật chủ. Khi vector được gắn thêm đoạn DNA ngoại lai thì gen eco471IR bị bất hoạt. Nhờ đó, quá trình lựa chọn dòng khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Trên vùng đa gắn MCS có chứa điểm nhận biết của các enzyme giới hạn như KpnI, XhoI, XbaI,… kế tiếp nhau giúp dễ dàng thao 2 kb 1 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 tác lắp ghép, thu lại và kiểm tra đoạn DNA được chèn vào. Cuối cùng, hai trình tự mồi pJET1.2 xuôi và pJET1.2 ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định trình tự gen. Trước khi thực hiện phản ứng ghép nối, chúng tôi tinh sạch sản phẩm PCR bằng Wizard kit. Thành phần phản ứng ghép nối như sau: 10 µl đệm phản ứng 2X, 5 µl sản phẩm PCR, 3 µl H2O, 1 µl vector pJET1.2 và 1 µl enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm của phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 370C qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra. 3.2.2.3. Tách chiết plasmid DNA Để tách chiết DNA plasmid, chúng tôi lấy 15 - 40 khuẩn lạc nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 370C từ 12 - 14 giờ. Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào); rồi bằng dung dịch II có chứa NaOH 0,2M và SDS 1%. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể của E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là rất quan trọng. DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose (hình 3.4) ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hình 3.4. Điện di plasmid trên gel agarose ĐC: DNA plasmid đối chứng 1-15: DNA plasmid mang gen giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA). Do vậy, độ cao thấp của các băng so với băng đối chứng là cơ sở để dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA ngoại lai. Kết quả trên hình 3.4 cho thấy ở giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 có các dòng đều cao hơn dòng đối chứng, như vậy có thể kết luận sơ bộ là các dòng này đã được chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. 3.2.3. Xác định đoạn điều khiển gen bằng RE Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid nói trên bằng phương pháp xử lý với enzyme giới hạn. Vector pJET1.2 có chứa điểm nhận biết enzyme XhoI ở phía bên trái và điểm nhận biết enzyme XbaI ở phía bên phải của vị trí ghép nối gen, tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi không dùng enzyme XhoI và XbaI như thường lệ mà dùng enzyme HindIII và NotI để kiểm tra đoạn gắn vì trong trình tự của đoạn promoter có các điểm nhận biết hai enzym hạn chế này. Qua đó, chúng tôi đã chọn được 3 dòng pJETSpUbip số 1, 4 và 5 với đoạn cắt kiểm tra bằng khoảng 1,3 kb và 3 dòng pJETSpUbipin số 14, 16 và 21 với đoạn cắt kiểm tra bằng khoảng 2,3 kb (hình3.5 A). Các dòng này lại được tiếp tục kiểm tra bằng các enzym hạn chế HincII và PstI bên trong đoạn này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Hình 3.5. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme A. Plasmid số 1, 4, 5 pJETSpUbip và số 4 pJETSpUbipin cắt bằng HindIII và NotI. B. Plasmid số 14, 16, 21 pJETSpUbipin cắt bằng HincII. C. Plasmid số 14, 16, 21 pJETSpUbipin cắt bằng PstI Các dòng pJETSpUbip, pJETSpUbipin đều có một điểm cắt của HincII tạo thành băng tương ứng khoảng 4 kb và 5 kb (hình 3.5 B). Hai điểm cắt của PstI (pJET1.2 có điểm cắt ở vị trí 158) ở các dòng pJETSpUbip đều cho hai băng 3,3 và 0,8 kb, còn pJETSpUbipin cho hai băng khoảng 4,2 kb và 0,8 kb (hình 3.5 C). Như vậy, kết quả kiểm tra các vị trí của enzym cắt hạn chế có thể dự đoán về đoạn gắn chính là đoạn chúng tôi cần tìm. 3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter Chúng tôi đã xác định trình tự DNA của 6 dòng này, mỗi dòng 3 lần trên máy xác định trình tự tự động dựa trên cơ sở phương pháp của Sanger. Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi pJET1.2 để xác định trình tự đoạn promoter trên các plasmid tái tổ hợp theo cả hai chiều. Sau đó số liệu được xử lý bằng các phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0, DNA Sequencing Analysis v5.2, Seqscape v2.5, BioEdit v7.0.5, đã nhận được trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin có chiều dài 2013 bp, còn đoạn promoter và 5’UTR có chiều dài là 1033 bp ở giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2. Sau đó chúng tôi đã tiến hành so sánh các trình tự này với trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài này ở Mỹ đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế. Kết quả so sánh trình tự đoạn điều khiển trong pJETSpUbipin16 được trình bày trên hình 3.6 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 A B kb kb kb 1.0 2.0 3.0 6.0 4.0 0.75 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 1 4 5 4 14 16 21 14 16 21 6 C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GAGATGGACAGATAATGAGATGAATTAGAAAAAAAAAATTCGTGTTGTAAGATAGAATAC pJETSpUbipin16 ............................................................ 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TTGCTATCTACTGATGAATGCAGTTCAGTTTTCCTCACGATCTTAAAGATCGCGCACTAT pJETSpUbipin16 ............................................................ 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CCTCAGCTTCACTCTGGAAATTTTGATTCTCTTCTTCTGCTCAGCAGCCTCGACTCTGTC pJETSpUbipin16 ............................................................ 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TAGGGTTTCGTACAATCGGACGCCATTCTACATGAATCGAGCACAGGGAATGAAGACAAT pJETSpUbipin16 ............................................................ 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TAGGAGATCCTCGATGTCCTCCGACTTACTTGCATGACTTGACGGGGAAGATCTCGAGCA pJETSpUbipin16 ............................................................ 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GGGAAGCGACGCCTCTCCGGAGGACTCGCCTCGCCGAGAGGACCTCCTCCGCGACACGGA pJETSpUbipin16 ............................................................ 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CCATGGCCTCCACGGGGTAGAAGCTGGCCCTGTTCTTTATTCTCTTGAGGATCATCGGCC pJETSpUbipin16 ............................................................ 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GAAGCCTCCGCAAATCCATCCCCGAGGAGTAGAATCTCGCCTGCAGGAAGCATCTGTCGA pJETSpUbipin16 ............................................................ 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GATCCTCGCCGAGGCGGCGGAGATACCTCGCCGGCGCCGCCATGGCGCCGGGGACGGAGC pJETSpUbipin16 ............................................................ 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ACCACCACGGAGAAGAAGAACCCTAACCCAAGGCATTAACGAAGTTGCGCAGATTATACA pJETSpUbipin16 ..........................................................T. 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core AAAGCCCTCAAATATCTTTCATTTTCTATTTCACTGATACATTTTCATTATTGTATATGA pJETSpUbipin16 ............................................................ 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GTGTTTATTTAAATTATTCCGTATTAGAAAAGCACCTCCAGAACCCGACAAAATAGGGTG pJETSpUbipin16 ............................................................ HSE HSE DRE Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ACGTCATCATGGTGTCATGACCGCCCAACAGCCGCAGATTTAAAATCGGTGGATGAGTGC pJETSpUbipin16 ........G...........T....................................... 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GGCCACGCCACGAAAGCGATGGGCCTTCGTCGATGCCGTGAGAATCCATCTGACATAAAG pJETSpUbipin16 ............................................................ 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TAAACGGCGCCGTCAGTATTGACGGCGTATGACACGTGGAAAGAAGCTATTGGTTCACGC pJETSpUbipin16 ..................C......................................... 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ATCGGTGGTTCCGCTAGCCTCCGTCGACCGCTAGTACTATAAATACGGTCCCGAGGCCTC pJETSpUbipin16 ............................................................ 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CTCACCACTCGCACATATCCTCTTTGTTTTCCTCTCCGTGAAAGAAGCGAGGAAGCGCGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CGTCTCTCCCAAGGTAAGGAGCAGATCTCTTTGATCGTTTTTGTTCTTCTTTTGTTTTGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TTTTTTTTTCTGCGGATCTTCGGTTGCATCATGCCTTGGCTGTTTTTATTAGTTTAGGAT pJETSpUbipin16 ........-................................................... 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ATCCTCGTTTGGATCTGAGCCGATCATATATGTTAAAGGTTGTGTTCGATCTCTTTGTTC pJETSpUbipin16 ............................................................ 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ATTTTCGCATGAAAAGGATGTATCCTTTTGATGTGAGGCGATCTTCTATGGTTAAGACTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TGTTCGGTCTATTGATCATTTCTGTTCTTCGTTTTTGAGTTTTTTTCTGCGGATATCGCA pJETSpUbipin16 .............................................-.............. 1330 1340 1350 1360 1370 1380 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TCATCCCTAGGTTTTTGCTTTGGTTAGGATGCATCCTTTGGATTTGAGCCGATCTCCCTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1390 1400 1410 1420 1430 1440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GGTTAAGGCTGTGTCTGTTGCAGAGGAGAAAGTCTGTCGAGGTCCTTATGCAGGCTTTGT pJETSpUbipin16 ............................................................ ABRE MYC-like G-box TATA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CCAGATGCGCGTGCTCTCTCATGCTATGAATTTATGTTTTGAGAACTCCTCCCGGTTTTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1510 1520 1530 1540 1550 1560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CTAGATCCGGATTTGAAGTATTCATTGCGGTTCCCCTTCGGTTTTATGTATTTCTCGAGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1570 1580 1590 1600 1610 1620 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TGATTTGGTCCATGATCGTGTTCTGTCCAGATCTCTCTTGATATGGATGAGATATTCGTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ACCTCTTTCAAACATCGGTGGATGTTCTTTTTAGTCTTGGCTCACCTTTATCTAGAAATT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core AATTTTCGGTTTGAAACCCCTGCTTGTTAAGGTGATGTATTCCTTCTTTATAGATTTCGG pJETSpUbipin16 ............................................................ 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TGTGTTATTTCTTAACGGTGATCTGTCCGATCCATGTGTTGCACCTCTTGTTTTCTGTGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core AATCCTCTGTGAATTATAATTATGTTTTGAAAACGTACTTAAGTAAGGGGCATGTTCCCC pJETSpUbipin16 ............................................................ 1870 1880 1890 1900 1910 1920 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GTTTAAAACTTTTGTTCTATCAATTTGTGGTTAATAGATCCTGATTTGTGGTCGCCTTAT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TCTGTCTTTAATCGTGGATTTTATTTATCTTGAGCGCGTCCTTTTCTTTTAAAATCATGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1990 2000 2010 ....|....|....|....|....|....|... Sp-Ubi-pin-core GTTTAACCTTTCAGTCGTCATATGTTCCATCAG pJETSpUbipin16 ................................. Hình 3.6: Trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với dự đoán các vùng chức năng promoter Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Từ kết quả so sánh trên, chúng tôi đã quan sát thấy rằng đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin có 4 vị trí thay đổi so với loài này của Mỹ được thống kê ở bảng 3.1 như sau: Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với Sp-Ubi-pin 16 (Việt Nam) STT Vị trí Sp-Ubi-pin (Mỹ) Sp-Ubi-pin16 1 599 C T 2 729 A G 3 741 C T 4 859 T C Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức năng trình tự bin/programs/promoter cho thấy đây là đoạn có những vùng chức năng của promoter (hình 3). Hộp TATA ở vị trí 938 và điểm khởi đầu phiên mã dự đoán là vị trí 974. Ngoài ra còn có các trình tự đặc trưng cho G-box (868) , ABRE (719), MYC - like (827), DRE (716), HSE (617 và 676)… Đây là các yếu tố điều hòa trên promoter cả các gen cảm ứng với ánh sáng, abscisic acid, điều kiện mất nước…Vùng có trình tự nGAAn và các trình tự ngược chiều nTTCn được dự đoán là các yếu tố sốc nhiệt (heat shock element - HSE) trên promoter của các gen mã hóa cho các HSP. 3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen từ loài bèo tấm L. aequinoctialis DB1 3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter Dựa trên trình tự các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài bèo tấm L. aequinoctialis DB1 đã được công bố [24] chúng tôi đã thiết kế mồi theo sơ đồ và vị trí các mồi trên hình 3.7. Tương tự như loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2, các mồi La-UbipF và La-UbipR nhằm phân lập đoạn promoter, còn mồi La-UbipinR sẽ kết hợp với La-UbipF để nhân đoạn bao gồm cả promoter , 5’UTR và intron. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.7: Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi. Trình tự các cặp mồi như sau: La-Ubip-F: 5’- GGG CAG TGT ACC AAT ATT TTA AAC CC - 3’ La-Ubip-R: 5’- ACT GAG AAA GAA GAA GGA TTC CGC CC - 3’ La-Ubipin-R: 5’- GGG CCT GCA AGG GAA AAT AAT AAA TTG - 3’ 3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR2.1 3.3.2.1. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR Chúng tôi tiến hành PCR nhân đoạn điều khiển bao gồm cả promoter và intron từ DNA tổng số của mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 sử dụng cặp mồi La-UbipF và La-UbipinR cho đoạn khoảng 2,1 kb (LaUbipin). Sản phẩm PCR này được sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn promoter với cặp mồi La-UbipF và La- UbipR với đoạn khoảng 1 kb (LaUbip). Kỹ thuật PCR được tiến hành trong môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác của enzyme về pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật PCR. Dung dịch đệm sử dụng cho enzyme Dream Taq DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM; pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl2 25 mM; gelatin 0,01%. Chúng tôi tiến hành nhân đoạn promoter với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính như sau: - Giai đoạn biến tính: lựa chọn 950C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ thích hợp để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành 2 sợi đơn đồng thời vẫn đảm bảo hoạt tính của Taq DNA polymerase. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn primer tối ưu của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 cao hơn so loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2: 550C trong thời ATG La-UbipF Promoter La-UbipR Intron La-UbipinR Sall-858 964 2068 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 gian một phút. Thông thường nhiệt độ gắn mồi sử dụng Taq DNA polymerase cao hơn so vói sử dụng Pfu DNA polymerase. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ ở 720C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ làm việc tối ưu của Taq DNA polymerase và thời gian thì đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng 2 kb. Ngoài ra, khi bắt đầu phản ứng chúng tôi đã cho chạy trước bước khởi động nóng ở 950C trong 4 phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số. Sau khi kết thúc 32 chu kỳ, chúng tôi đã đặt nhiệt độ 720C trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp DNA được kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ 40C. Sản phẩm PCR sau đó đã được kiểm tra trên gel agarose. 1 M 2 Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose M: Thang DNA chuẩn 1 kb 1: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF và La-UbipinR 2: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF và La-UbipR Kết quả trên hình 3.8 cho thấy sản phẩm PCR của mẫu bèo tấm rất đặc hiệu. Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR là 2,1 kb cho đoạn promoter và intron còn 1 kb cho đoạn promoter đúng với dự đoán của gen cần nhân. Sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm tách dòng gen tiếp theo. 2 kb 1 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 3.3.2.2. Tách dòng trong vector pCR2.1 Nhằm mục đích tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter, chúng tôi tiến hành gắn sản phẩm PCR đã nhân được ở giống bèo tấm L.aequinoctialis DB2 vào vector pCR2.1 sử dụng bộ hóa chất GeneJETTM PCR Cloning Kit nhờ những đặc điểm ưu việt của vector pCR2.1. Vecctor pCR2.1 chứa đầy đủ các thành phần cần thiết của một vector tách dòng để có thể tự sao chép trong tế bào chủ. Vector này có khả năng cho số lượng bản sao lớn trong tế bào (200 bản sao/ tế bào), có khả năng tải các đoạn gen tốt và ổn định trong tế bào chủ. Đồng thời nhờ có kích thước nhỏ mà nó dễ dàng được biến nạp vào tế bào. pCR2.1 chứa vùng trình tự đa điểm cắt, mang hai dấu chuẩn chọn lọc là gen kháng sinh ampicilin và kanamycin. Vector pCR2.1 đã được thiết kế để nhân gen ngoại lai ở vùng MCS. Ở mỗi đầu 3’ của mỗi sợi được gắn thêm một nucleotide T. Nucleotide T này rất dễ dàng bắt cặp bổ sung với nucleotide A ở trên đầu 3’ của sản phẩm PCR khi sử dụng Taq DNA polymerase. Khi đó, sản phẩm PCR và vector pCR2.1 có thể tự nối ghép với nhau một cách dễ dàng. Một đặc điểm nữa trong cấu trúc của vector pCR2.1 là trong vùng MCS có chứa operon LacZα mã hóa cho enzym β-galactosidaza như một dấu hiệu chọn lọc trắng- xanh để biến nạp mang plasmid tái tổ hợp: trên môi trường có chứa cơ chất Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D(-)-galactopyranoside) và IPTG (isopropylthio--D-galactoside) các khuẩn lạc tái tổ hợp sẽ có mầu trắng do đoạn chèn làm bất hoạt enzyme này. Để chuẩn bị ghép nối, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Wizard kit. Như đã biết, việc sử dụng Taq DNA polymerase trong PCR sẽ tạo ra khoảng 70 - 90% sản phẩm PCR có thêm một nucleotide A ở đầu 3’, do đó phản ứng ghép nối sản phẩm PCR được thực hiện như sau: 1 µl đệm phản ứng 10X; 5 µl sản phẩm PCR, 1 µl H2O, 1 µl vector pCR2.1 và 1 µl enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm của phản ứng ghép nối sẽ được đem biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ml), Xgal (50g/ml) và IPTG (50g/ml) ở 370C qua đêm. Kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc trắng là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra. 3.3.2.3. Tách chiết plasmid DNA Kết quả trên hình 3.9 cho thấy ở giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1 có các dòng từ 1, 3, 4, 10, 11, 13, 14,15, 16 cao hơn dòng đối chứng, như vậy có thể kết luận sơ bộ là các dòng này đã được chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Hình 3.9. Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% ĐC: DNA plasmid đối chứng 1-16: DNA plasmid mang gen giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1 3.3.3. Xác định đoạn điều khiển gen bằng RE Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid pCRLaUbipin bằng phương pháp xử lý với enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra kích thước đoạn gắn. Các plasmid pCRLaUbipin số 10, 11, 31 thu được 2 băng 3,9 kb và 2,1 kb tương ứng với kích thước của vector pCR2.1 (3,9 kb) và của sản phẩm PCR – LaUbipin (hình 3.10 A) và được chọn để khảo sát tiếp theo. Các dòng này được xử lý tiếp bằng các enzyme hạn chế Sall vì trong trình tự của đoạn promoter có 1 điểm nhận biết của enzyme hạn chế này. Các dòng pCR2.1 LaUbipin thu được băng 5,9 kb (hình 3.10B). Cũng tương tự đối với các dòng pCRLaUbip, sau khi xử lý với enzyme EcoRI chúng tôi chọn được dòng pCRLaUbip số 1 có hai băng 3,9 kb và 1 kb tương ứng với kích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 thước của vector pCR2.1 và sản phẩm PCR LaUbip. Dòng pCRLaUbip kiểm tra bằng SalI cho một băng 4,9 kb (hình 3.10 C). Như vậy, kết quả kiểm tra các vị trí của enzyme cắt hạn chế có thể dự đoán về đoạn gắn chính là đoạn chúng tôi cần tìm. Hình 3.10. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme M. Thang DNA chuẩn 1kb Đ/C. Plasmid đối chứng A. Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt bằng EcoRI. B. Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt bằng SalI. C. Plasmid pCRLaUbip cắt bằng EcoRI và Sall. 3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter Chúng tôi đã xác định trình tự DNA mẫu các plasmid số 10, 11 pCRLaUbipin và mẫu plasmid số 1 pCRLaUbip trên máy xác định trình tự tự động dựa trên cơ sở phương pháp của Sanger. Sau đó số liệu được xử lý bằng các phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0, DNA Sequencing Analysis v5.2, Seqscape v2.5, BioEdit v7.0.5, đã nhận đoạn promoter và 5’UTR có chiều dài là 964 bp ở giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1. Sau đó chúng tôi đã tiến hành so sánh các trình tự này với trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài này ở Mỹ đã được công bố trên GenBank. Kết quả so sánh đoạn LaUbipin mẫu số 10 với trình tự trên GenBank được trình bày trên hình 3.10. Từ kết quả cho thấy ở đoạn này có 2 vị trí thay đổi so với loài này của Mỹ được thống kê ở bảng 3.2 M Đ/C Đ/C M 3,9kb 5,9kb 1kb 3,9kb A B 2kb 10 11 31 10 11 31 4,9kb M B C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin AGTGTACCAATATTTTAAACCCTACATTTATCATTCTTTATTCATTATTGCCATAAGTTA Laubi-10 R ............................................................ 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin ATGAATATTGAAATTCAAATACGCGCAAGATGTCAATATCGATCGAATATGAATACCAGA Laubi-10 R ............................................................ 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin TATAAAATCAAAAATCAAATATCAAATTAATAAAGATATAAAATATTGAATCCAAAAGCA Laubi-10 R ............................................................ 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin ATAAAGAATATCACTATTAATATCAAAATATCGATTTGAAGTTCAAAAATTGGGTCCATT Laubi-10 R ............................................................ 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin AGGAGCCAAGACCGATCATGATCCGATACTGATATCAATATCTGTAGCTCAGTGGCTAGG Laubi-10 R ............................................................ 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin CCCCTCAATTTGCCTGGCCGAAGGCAGTGTACAAAACCTGGCTCTCGCAAGGGCAAAGAA Laubi-10 R ............................................................ 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin AGAGTCTTTCCCAAAAAAAAAAAAATCGAACCCATTTGTAGTATCCAATATTTGGATTGA Laubi-10 R ............................................................ 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin CATAAGATACCAAAA-CATAAAGTACTAACCACCCAATCTTATAATTAATCAAGATTTAT Laubi-10 R ...............A............................................ 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin ATCACATCCAATATCAAGATCCGATATCAATACCTAGACCGGTAAACCCTAATTTACTCT Laubi-10 R ............................................................ 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin TCCCCCCTCTAAAAATTTCCAATAAATATCTCCACATATTTAACTATTAAAAAATTGATA Laubi-10 R ............................................................ 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin AGAGATAGGCCCTAGCCCTAAGTCCTAACATATAACCACTCTCTATGAAAAGTCCTATTA Laubi-10 R ...........................................A................ 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin AATGACGTCATTTATTTATTTATTGCCGGTTGGCTGCTCCACAGCCGCAATTTAATGGAT Laubi-10 R ............................................................ G-box ABRE Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin GGCTGACACGGCACGAAACCGACGGGCGGTGCCGTGGGAATAATTCTAGAGTAAACCTAA Laubi-10 R ............................................................ 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin CGGCGCCGTTAACTTTGACGGTGGCGAAGACGCGTGGGGATAGGTGGTTGGTCCGCGTGA Laubi-10 R ............................................................ 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin CGGCGGCGGTTCAGCCCGTCGACCTTGAGCCGAGACTATAAATCGAGGCGAAGGGATGAG Laubi-10 R ...........................................G................ 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| La-Ubi-pin CTTTGCCATTGCGTTCTTCTTCTGTTCATCTCTGAAATTCGGGCGGAATCCTTCTTCTTC Laubi-10 R ......................................-........-............ ....| La-Ubi-pin TCAAG Laubi-10 R ..... Hình 3.11. Trình tự đoạn promoter của loài bèo tấm L. aequinoctialis DB1 với dự đoán các vùng chức năng promoter Bảng 3.2. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin với La-Ubi-10F STT Vị trí (tính từ vị trí khởi đầu của yếu tố điều khiển gen) La-Ubi-pin (Mỹ) La-Ubi-10F 1 644 T A 2 884 C G Kết quả giải trình tự cho chúng tôi thấy đoạn intron của các mẫu LaUbipin đọc còn một số điểm còn chưa nhất quán. Cần phải nhấn mạnh rằng vùng intron thường có nhiều đoạn trình tự A/T dài nên việc nhân bằng PCR cũng như xác định trình tự thường gặp khó khăn và cần phải lặp lại nhiều lần. Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức năng trình tự bin/programs/promoter cho thấy đây là đoạn có những vùng chức năng của promoter (hình 3.11). Hộp TATA ở vị trí 876 và điểm khởi đầu phiên mã dự đoán là vị trí 916. Ngoài ra còn có các trình tự đặc trưng cho G - box (662), ABRE (716), ABRE DRE HSE TATA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 DRE (738), HSE (758),… Đây là các yếu tố điều hòa trên promoter cả các gen cảm ứng với ánh sáng, abscisic acid, điều kiện mất nước… Trong đoạn trình tự yếu tố biểu hiện gen đặc hiệu ở cả hai loài bèo tấm trên chúng tôi đều quan sát thấy các trình tự DNA bảo thủ thường có mặt ở hầu hết các đoạn promoter như hộp TATA và hộp CCAAT, các trình tự bảo thủ này có tác động trực tiếp và đóng vai trò quan trọng trong quá trình biểu hiện gen. Kết quả thu được cho thấy các mẫu sử dụng trong nghiên cứu này có trình tự đoạn nucleotide chỉ sai một vài điểm so với trình tự gen được dùng làm tham khảo đã được công bố [24]. Đối với trình tự nucleotit đoạn promoter và 5’UTR của SpUbipin16 mà chúng tôi phân lập được dài 1033 bp có 4 vị trí nucleotide khác biệt với trình tự ở Mỹ đã được công bố, đó là các vị trí C->T (599); A->G (729); C->T (741) và T->C (859). Với trình tự nucleotide đoạn này của LaUbipin10 (964bp) có 2 vị trí thay đổi so với loài này ở Mỹ đó là T->A (644) và C->G (884). Trong khi đó, trình tự đoạn promoter và 5’ UTR của gen Ubiquitin ở ngô là 982 bp (899 bp trước TSS và 83 bp 5’UTR) [22], còn ở lúa là 1309 bp. Còn đoạn intron của gen này ở ngô dài 1010 bp và đoạn intron ở lúa dài 1141 bp [53]. Như vậy, promoter chúng tôi phân lập được có cấu trúc giống như các promoter của các gen Ubiquitin các loài thực vật khác. Ngoài ra, qua kết quả nghiên cứu thực tế chúng tôi nhận thấy rằng việc sử dụng enzyme Pfu DNA polymerase trong phản ứng PCR mang lại hiệu quả tốt hơn khi sử dụng enzyme Dream Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR. Ta đã biết trong cấu trúc của enzyme Pfu DNA polymerase có ít nhất 12 cuộn xoắn trong quá trình tổng hợp DNA với độ chính xác cao hơn enzyme Taq DNA polymerase (Stratagene) vì vậy nó có vai trò làm tăng hiệu quả trong quá trình nhân PCR không gây đột biến. Trên thực tế, việc tối ưu hóa phản ứng PCR cho Pfu DNA polymerase thường khó khăn hơn. Chúng tôi đã tối ưu hóa được điều kiện phản ứng PCR đối với loài S. polyrrhiza DB2 và đang tiếp tục tiến hành tối ưu các điều kiện phản ứng PCR đối với Pfu cho loài L. aequinoctialis DB1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Ubiquitin là một trong các HSP nhỏ. Cấu trúc của các gen polyubiquitin của ngô, lúa đều có vùng promoter, 5’UTR, intron và exon. Đoạn intron được dự đoán có chức năng tăng cường khả năng biểu hiện gen này. Vì vậy, để biểu hiện gen trong thực vật, người ta đã sử dụng không chỉ có đoạn promoter mà cả đoạn promoter và intron của gen Ubiquitin Nghiên cứu sử dụng các vùng riêng biệt của đoạn trình tự các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin ở lúa rubi3 trong biểu hiện gen GUS cho thấy: dưới tác động của promoter và 5’UTR, gen GUS biểu hiện ở tất cả các các dạng mô tế bào, còn đoạn intron tăng cường biểu hiện gen ở một số mô tế bào nhất định, trong khi đó, ở ngô, intron tăng cường biểu hiện trong phần lớn tất cả các mô [22], [41], [55]. Như vậy, khả năng sử dụng đoạn các yếu tố biểu hiện gen Ubiquitin của hai loài bèo tấm này như thế nào là vấn đề cần được nghiên cứu tiếp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ các kết quả đã đạt được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Đã hoàn thiện được phương pháp tách chiết DNA từ các loài bèo tấm khác nhau sử dụng kết hợp CTAB và PVP, CTAB và PEG hoặc SDS và PVP 2. Đã phân lập được đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen mã hóa cho Ubiquitin loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 bao gồm promoter, 5’UTR và intron trong đó promoter có độ dài 1033 bp, đoạn bao gồm promoter , 5’UTR và intron có độ dài 2013 bp. Đã phát hiện thấy có 4 vị trí nucleotide trên promoter khác với gen này được phân lập ở Mỹ. 3. Đã phân lập được đoạn promoter và 5’UTR của gen mã hóa cho Ubiquitin loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1: promoter và 5’UTR có độ dài 964 bp, trong đó có 2 vị trí nucleotide khác với promoter được phân lập từ loài này ở Mỹ . Đề nghị - Xác định đoạn intron trong đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin mẫu bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1. - Sử dụng đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin đã phân lập được của Spirodela polyrrhiza DB2 vào việc thiết kế các vector mang gen cần thiết để chuyển vào bèo tấm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt : 1. Lê Thị Thu Hiền, Lê Trần Bình, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải (2000), “Phân tích trình tự đoạn điều khiển của gen tổng hợp đường (Rsuc1-Promoter) từ giống lúa C71 ”, Tạp chí sinh học 23 : 45-50. 2. Lê Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2003), “Cây trồng biến đổi gen di truyền : Thực trạng và triển vọng ”, Tạp chí Công nghệ sinh học 1 : 265-285. 3. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(1): 1-18 4. Trần Bích Lan, Nguyễn Lan Hoa, Nguyễn Đức Doanh, Trần Duy Quý (1998), “Kết quả bước đầu sử dụng Agrobacterium tumefaciens trong nghiên cứu chuyển gen vào lúa”, Hội nghị Toàn quốc lần thứ nhất về Công nghệ sinh học Cây lúa, Huế : 98- 101. 5. Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (1997), “Chuyển tổ hợp gen GUS-BNG vào cây thuốc lá”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 2 : 23-27. 6. Đặng Trọng Lương, R. Offringa, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đồng, Trần Duy Quý, W. Dolff, Pau J. J. Hooykaas (1999), “Thiết kế lại cấu trúc gen Bt (Bacillus thurigensis) để chuyển gen vào cây hai lá mầm”, Báo cáo Khoa học Hội nghị sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội : 1371-1376. 7. Vũ Văn Tiến, (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen ở bèo tấm Lemna aequinoctialis”, Luận văn thạc sỹ khoa học. Tài liệu tiếng Anh: 8. Amin J., Anathan J., Voellmy R. (1988), “Key features of heat shock regulatory elements”, Mol Cell Biol 8: 3761-3769. 9. Albani D., Altossar I., Arnison P. G., Fabijanski S. F. (1991), ”A gene showing sequence similarity to pectin esterase is spesificially expressed in developing pollen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 of Brassica napus. Sequences in its 5’ flanking region are conserved in other pollen- specific promoter”, Plant Mol Biol 16: 501-513. 10. Angeles J.G.C., Laurena A.C., Tecson-Mendoza E.M (2005) Extraction of genomic DNA from the lipid-polysaccharide, and polyphenol-rich coconut (Cocos nucifera L.). Plant Mol Biol Rep 23: 297a-297i 11. Ainley W.M., Key J.L. (1990), “Development of heat shock inducible expression cassette for plants characterization of parameters for its use in transient espression assay”, Plant Mol Biol 14: 949-967. 12. Back E., Dunne W., Schneiderbauer A., De Framond A., Rasogi R., Tein S.J. (1991), ”Isolation of the spinach nitrite redutase gene promoter which confer nitrate inducibility on GUS gene espression in transgenic tobacco”, Plant Mol Biol 17: 9-18. 13. Bernard R.G., Jack J.P., 2006 “Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA”, Department of Biology, University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada. 14. Becker C., Shutov A.D., Nong Van Hai, Senyuk V.I., Jung R, Horstmann C., Fischer J., Nielsen N.C., Muntz K. (1995) Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B an asparagine-specific endopeptidase. Eur. J. Biochemystry 228: 456-462. 15. Binet M. N., Lepetit M., Weij J. H., Tessier L. H. (1990), “Analysis of a sunflower polyubiquitin promoter by transient expression”, Plant Sci 79: 87-94. 16. Buchanan C.D., Klein P.E., Mullet J.E. (2004), “Phylogenetic analysis of 5’ – noncoding regions from ABA – responsive rab 16/17 gene family of sorghum, maize, and rice provides insight in to the composition, organization and function of cis – regulatory modules”, Genetics 168: 1639 – 1654. 17. Bustos M. M., Begum D., Kalkan F. A., Battraw M. J., Hall T. C. (1991), ”Positive and negative cis-acting DNA domain are required for spatial and temporal regulation of gene expression by a seed storage protein promoter”, EMBO 10: 1469- 1479. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 18. Buzby J. S., Yamada T., Tobin E. M. (1990), “A light-regulated DNA-binding activity interacts with a conserved region of a Lemna gibba rbcS promoter”, Plant Cell 2: 805-814. 19. Callis J., RaaschJ. A., Vierstra R. D. (1990), “Ubiquitin extension proteins of Arabidopsis thaliana – structure, localization, and expression of their promoters in transgenic tobacco”, J Biol Chem 265: 12486-12493. 20. Chang W. C., Chiu L. (1978), “Regeneration of Lemnaceae gibba G3 through callus culture”, Z. Pflanzenphisiol 89: 91-94. 21. Chiera J. M., Bouchard R. A., Dorsey S. L., Park E. H., Buenrostro – Nava M. T., Ling P. P., Finer J. J. (2007), “Isolation of two highly active soybean promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system”, Plant Cell Rep 26: 1501-1509. 22. Christensen A.H., Sharrock RA, Quail P.H., (1992), “Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation”. Plant Mol Biol 18: 675- 689. 23. Cornejo M. J., Luth D., Blankenship K. M., Anderson O. D., Blechl A. E. (1993), “Activity of a maize uniquitin promoter in transgenic rice”, Plant Mol Biol 23(3): 567-581. 24. Dickey LF, Cox KM, Peele CG (2007) Expression control elements from the lemnaceae family. US Patent Application 20070180583. 25. D’Halluin K., Bonne E., Bossut M., De Beukeleer M., Leemans J. (1992), “Transgenic maize plants by tisue electroporation”, The Plant Cell 4: 1495-1505. 26. Departer B. S., Schilperoort R. A. (1992), “Structer and expression of a root- specific rice gene”, Plant Mol Biol 18: 161-164. 27. Eldeman M., Perl A., Flaishman M., Blumethal A. (1999), ”Transgenic Lemnaceae”, Patent No. WO 99/19498. 28. Garbarino J. E., Oosumi T., Belknap W. R. (1995), “Isolation of a polyubiquitin promoter and its expression in transgenic potato plamts”, Plant Physiol 109: 1371- 1378. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 29. Gasdaska J. R., Spencer D., Dickey L. (2003), ”Advantages of therpeutic protein production in the aquatic plant Lemna”, Biology Review 67: 16-37. 30. Golovchenko VV, Ovodova RG, Shashkov AS, Ovodov YS (2002) Structural studies of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna minor L. Phytochemistry 60(1):89-97. 31. Hadi M.Z., McMullen M.D., Finer J.J, (1996), “Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment”, Plant Cell Rep 15: 500 – 505. 32. Hernandez-Garcia CM, Martinelli AP, Bouchard RA, Finer JJ (2009), “A soybean (Glycine max) polyubiquitin promoter gives strong constitutive expression in transgenic soybean”, Plant Cell Rep 28: 837-849. 33. Kehoe DM., Dgenhardt.J, Winicov I, Tobin EM., (1994), “Two 10-bp regions are critical for Phytochorome regulation of a Lemna gibba Lhcb gene promoter”, The Plant Cell 6: 1123-1134. 34. Keim P, Olson TC, Shoemaker RC (1988) A rapid protocol for isolating soybean DNA. Soybean Genet Newsl 15: 150-152 35. Kohli A., Grifiths S., Palacios N., Twyman R.M.,Vai P., Laurie D.A., Christou P. (1999), “Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated recombination”, The Plant Journal 17: 591 – 601. 36. Landolt E. (1986), The family of Lemnaceae - a monographic study. Vol.1, Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 71. 37. Landolt, E.and Kandeler, R. (1987). The family of Lemnaceae - a monographic study. Vol.2,. Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 95. 38. Les D.H., Crawford D.J., Landolt E., Gabel J.D., Kimball R.T. (2002), “Phylogeny and systematics of Lemnaceae, the Duckweed Family”, Systematic Botany 27(2): 221-240. 39. Lewin B, (2004), Genes VIII, Oxford University Pres, Oxford – New York – Tokyo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 40. Li J., Jain M., VunshR., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M. (2004), “Callus induction and generation in Spirodela and Lemna”, Plant Cell Report 22: 457-464. 41. Lu J, Sivamani E, Li X, Qu R (2008) Activity of the 5’ regulatory regions of the rice polyubiquitin rubi3 gene in transgenic rice plants as analyzed by both GUS and GFP reporter genes. Plant Cell Rep 27: 1587-1600. 42. Mardanov A. V. (2008), “Complete Sequence of the Duckweed ( Lemna minor ) Chloroplast Genome: Structural Organization and Phylogenetic Relationships to Other Angiosperms”, J. Molec. Evol. 66(6):555-564. 43. McElrroy D., Chamberlain D.A., Moon E., Wilson K.J. (1995), “Development of gusA reporter gene constructs for cereal transformation: Availability of plant transformation vectors from the CAMBIA molecular genetics resource serevice”, Mol Breed 1: 27-37. 44. Noad R.J., Turner D.S., Covey S.N. (1997), “Expression of function elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic Acids Res 15: 1123 – 9 .46. Okubaca PA, Tobin EM, (1991), “Isolation and characterization of three genes negatively regulated by Phytochrome action in Lemna gibba”, Plant Physiol 96: 1237-1245. 46. Pineda Rodo A, Brugiere N, Vankova R, Malbeck J, Olson JM, Haines SC, Martin RC, Habben JE, Mok DWS, Mok MC (2008), “Over-expression of a zeatin O-glucosylation gene in maize leads to growth retardation and tasselseed formation” J Exper Bot 59(10): 2673-2686 47. Plesse B., Criqui M. C., Durr A., Parmentier Y., Fleck J., Genschik P. (2001), “Effects of the polyubiquitin gene Ubi.u4 leader intron and first ubiquitin monomer on reporter gene expression in Nicotiana tabacum”, Plant Mol Biol 45: 655-667. 48. Rothwell G.W., Van M.R., Ballard H.E., Stockey R.A. (2004), ”Molecular phylogenetic Relationships among Lemnaceae and Araceae using Chrotoplast trnL- trnF intergenic spacer”, Molecular phylogenetics and Evulotion 30: 378-385. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 49. Rollfinke I. K., Silber M. V., Pfizner U. M. (1998), “Charaterization and expression of a heptaubiquitin gene from tomato”, Gene 211: 267-276. 50. Rusoff L.L., Blamkeney E. W., Gulley D.D, (1980), “Duckweeds (Lemnaceae): A potential Source of Protein and Amino Acid”, J. Agricult. Food Chem. 28: 848- 850. 51. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (2001), "Molecular Cloning: A laboratary manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 52. Shahmuradov I.A., Gammerman A.J., Hancock J.M., Bramley P.M., Solovyev V.V. (2003). “ PlantPron: a database of plant promoter sequences”, Nucleic Acids Research 31(1): 114-117. 53.Sivamani E., Qu R. (2006), “Expression enhancement of a rice polyubiquitin gene promoter”, Plant Mol Biol 60: 225-239. 54. Soltis DE, Soltis PS, Bennett MD, Leitch IJ. (2003), “Evolution of genome size in the angiosperms 1” , American Journal of Botany 90:1596-1603. 55.Stefaniak B., Wozng A., Budna T. (2002), “Callus induction and plant regeneration in Lemna minorL”, Biologia Plantarium 45(3): 469-472 56. Stewart C.N.Jr., Via L.E.(1993) A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications. BioTechniques 14: 748-751. 57. Stomp A. M., Rajbhardari N. (2000), “Generatically engineered duckweed”, US patent No. 6040498. 58. Van De Meer I. M., Spelt C. E., Mol J. N., Stuitje A. R. (1990), ”Promoter analysis of chalcone synthase (chsA) gene of Petunia hybrida: A 67 bp promoter region directs flower –specific expression’, Plant Mol Biol 15: 95-109. 59. Walden R., Koncz C., SchellJ. (1990), “The use of gene vectors on plant moleculer biology”, Methods in Molecular and Cellular Biology: 175-194. 60. Wang J., Oard J. H., (2003), “Rice ubiquitin promoters: deletion analysis and potential usefulness in plant transformation systems”, Plant Cell Rep 22: 129-134.; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 61. Weathermax S. C., William S. A., Tingay S., Tobin E. M. (1998), “The phytochrome response of the Lemna gibba NPR1 gene is mediated primarily through changes in absscisic acid levels”, Plant Physiol 116: 1299-1305. 62. Weeks K.E., Chuzhanova N.A., Donnison I.S., Scott I.M. (2007), “Evolutionary hierarchies of conserved blocks in 5’ noncoding sequenced of dicot rbcS genes”, BMC Evol Biol 7: 51. 63. Wei H. R., Wang M. L., More P. H., Albert H H. (2003), “Comparative expression analysis of two sugarcane polyubiquitin promoters and flanking sequences in transgenic plants”, Plant Physiol 160: 1241-1251. 64. Yamaguchi Shinozaki K., Mino M., Mundy J., Chua N. H. (1990), “Analysis of an ABA – Responsive rice gene promoter in transgenic tobacco”, Plant Mol Biol 15: 905-912. 65. Yamamoto Y.T.; Rajbhandari N.; Lin X.; Bergmann B.A.; Nishimura Y.; Stomp A.M. (2001) "Genetic transformation of duckweed Lemna gibba and Lemna minor." In Vitro Cellular and Development Biology - Plant 37(3):349-353. 66. Yin Y., Chen L., Beachy R. (1997), “Promoter elements required for phloem- specific gene espression from the RTBV promoter in rice”, The Plant Journal 12: 1179-1188. 67. Zuccarello GC, Critchley AT, Smith J, Sieber V, Lhonneur GB, West JA (2006) Systematics and genetic variation in commercial Kappaphycus and Eucheuma (Solieriaceae, Rhodophyta). J Appl Phycol, 2006, DOI:101007 10811-006-9066-2. 68. 69.