Nghiên cứu phân tích chất chẹn beta trong nước tiểu sử dụng kỹ thuật lc/ms/ms - Nguyễn Hồng Khánh

34 NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CHẤT CHẸN BETA TRONG NƢỚC TIỂU SỬ DỤNG KỸ THUẬT LC/MS/MS Đến tòa soạn 30 - 03 - 2016 Nguyễn Hồng Khánh, Phạm Tuấn Linh, Phan Tiến Hƣng, Nguyễn Thành Đồng Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nguyễn Thị Thảo, Từ Bình Minh Khoa Hóa học, Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN SUMMARY ANALYSIS OF BETA-BLOCKERS IN URINE SAMPLE USING LC/MS/MS TECHNIQUE An analytical method has been developed for analysis of ten beta-blockers in urine sample. Extraction of ten beta-blockers was carried out based on the dispersive solid phase extraction sample preparation method. Determination was performed using liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC/ESI-MS/MS). Mother ion and two fragment ion transitions of each beta-blocker were identified by direct injection to MS mode and by multiple reactions monitoring (MRM) mode, respectively. Spiking experiments was carried out to determine the recovery, precision and limit of quantitation (LOQ) of the method. The overall recoveries of all beta - blockers were between 62% and 102% with relative standard deviation lower than 15%. The limit of quantitation (LOQ) for all studied compounds was acceptable in comparison with regulations of World Anti Doping Agency. 1. MỞ ĐẦU Các chất chẹn beta (beta-blockers) thƣờng đƣợc sử dụng trong phòng chống các bệnh về tim mạch, cao huyết áp và đột quỵ [1]. Cơ chế hoạt động của chất chẹn beta là có ảnh hƣởng tới lƣợng adrenaline đƣợc sản sinh ra trong cơ thể và qua đó làm giảm sức hoạt động của hệ tim mạch, góp phần làm cho cơ thể sử dụng ít máu và lƣợng ô xy tiêu tốn ít hơn trong quá trình hoạt động của cơ thể [2]. Do có tác dụng nhƣ vậy nên một số vận động viên trong khi thi đấu thể thao đã sử dụng chất chẹn beta này nhằm mục đích ổn định tâm lý, chống run tay, giảm nhịp dồn dập, hồi hộp trƣớc khi thi đấu. Các môn thể thao thƣờng lạm dụng sử dụng chất chẹn beta thƣờng là các môn đòi hỏi không quá Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 21, Số 3/2016 35 nhiều sức mạnh nhƣ võ thuật, bắn súng [3]. Chính vì những lý do này, Tổ chức chống doping thế giới (World Anti Doping Agency - WADA) đã liệt nhóm chất chẹn beta vào danh mục chất cấm ở phần P2 là phần các chất cấm trong khi thi đấu [4]. Nhóm chất chẹn beta bao gồm Atenolol, Acebutolol, Levobunolol, Esmolol, Celiprolol, Labetolol, Metoprolol, Alprenolol, Propranolol và Betaxolol đều là các chất khó bay hơi, có độ phân cực cao. Trong công tác phân tích các chất chẹn beta, hiện nay chủ yếu tham khảo theo hƣớng dẫn của dƣợc điển nghiêng về phân tích chất lƣợng thuốc, trong đó đó, các kỹ thuật sử dụng chủ yếu ở dƣợc điển là kỹ thuật phổ phân tử và sắc ký bản mỏng. Với các kỹ thuật này, để đạt đến độ nhạy cỡ phần tỷ là một thách thức cực lớn. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với hệ thống đầu dò đa khối phổ (LC/MS/MS) đã đƣợc sử dụng trong một số các nghiên cứu cho phân tích chất chẹn beta trên thế giới [5, 6]. Do vậy, nhằm mục đích có thể phân tích chính xác và kéo giới hạn phát hiện xuống cỡ phần tỷ, trong nghiên cứu này kỹ thuật LC/MSMS đã đƣợc sử dụng. 2. THỰC NGHIỆM 1. Hóa chất Atenolol, Acebutolol, Levobunolol, Esmolol, Celiprolol, Labetolol, Metoprolol, Alprenolol, Propranolol và Betaxolol đƣợc đặt mua từ các nhà cung cấp nhƣ Aldrich (WI, Mỹ), EP (Pháp). Độ tinh khiết của các chất chuẩn này là từ 98 – 99%. Acetonitrile loại tinh khiết sắc ký đƣợc mua từ nhà cung cấp J.T. Baker (Philipsburg, NJ, Mỹ). Formic acid loại tinh khiết sắc ký đƣợc mua từ nhà cung cấp Merck (Darmstadt, Đức). Nƣớc siêu sạch đạt giá trị 18MΩ đƣợc cấp bởi hệ thống lọc nƣớc siêu sạch Ultra- pure water-Sinhan science tech, Hàn quốc. Các chất hấp thụ khác nhƣ Primary secondary amine (PSA) đƣợc mua từ nhà cung cấp Varian (Varian, Harbor City, Úc). MgSO4 và NaCl đƣợc đặt mua từ các nhà cung cấp Wako (Osaka, Nhật bản). Chuẩn gốc của từng chất chẹn beta (1,00 mg/mL) đƣợc chuẩn bị trong acetonitrile và đƣợc lƣu giữ ở âm 20 oC. Dung dịch chuẩn làm việc của hỗn hợp các chất chẹn beta đƣợc chuẩn bị trong acetonitrile. 2. Thiết bị Thiết bị LC/ESI-MS/MS: hệ thống sắc ký lỏng khối phổ 1200 của hãng Agilent (Palo alto, CA, Mỹ) bao gồm hệ thống bơm, bơm mẫu tự động và detector 6410 triple Quad MS/MS (Palo alto, CA, Mỹ). Việc xác định đƣợc thực hiện với detector Agilent 6410 triple Quad MS/MS họat động ở chế độ ion hoá dƣơng. Thế của mao quản đặt ở 4.0 kV và áp suất của buồng phun là 10 psi. Dòng khí nitơ đặt ở 6L/phút và nhiệt độ buồng va đập đặt ở 350 oC. Dụng cụ chuẩn bị mẫu: Máy lắc Glas-Col Multi Pulse Votexer (Glas-Col, Terre 36 Haute, Mỹ) và máy li tâm lạnh Hanil Refrigerated Centrifuge (Hanil Science Industrial, Hàn quốc) đƣợc sử dụng cho công tác chuẩn bị mẫu. 3. Chuẩn bị mẫu Lấy mẫu: Mẫu nƣớc tiểu đƣợc lấy từ các tình nguyện viên khoẻ mạnh. Chiết mẫu: 10 mL mẫu đƣợc chuyển vào ống ly tâm Teflon dung tích 50 mL, thêm hỗn hợp nội chuẩn và 10 mL dung môi acetonitrile vào ống ly tâm và lắc mạnh trong thời gian 1 phút bằng máy lắc vortex mixer. Sau đó, ống ly tâm chứa mẫu đƣợc đặt vào trong tủ lạnh khoảng 30 phút rồi lấy ra, thêm 4 gam MgSO4 và 1 gam NaCl vào ống ly tâm và tiếp tục lắc mạnh trong thời gian 1 phút bằng máy lắc vortex mixer. Ly tâm hỗn hợp này bằng hệ thống ly tâm lạnh ở 4 oC, tốc độ ly tâm là 3500 vòng/phút. Lấy 2 mL dung dịch ở phía trên trong ống ly tâm và chuyển vào ống ly tâm nhỏ có thể tích 5 mL. Trong ống ly tâm nhỏ này có để sẵn 50 mg PSA và 300 mg MgSO4. Lắc mạnh trong thời gian 1 phút bằng máy lắc vortex mixer, sau đó ly tâm hỗn hợp này bằng hệ thống ly tâm lạnh ở 4 oC, tốc độ ly tâm là 3500 vòng/phút. Lấy 1.0 mL dung dịch ở phía trên chuyển sang lọ bơm mẫu tự động để đƣa vào phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS). Chuẩn bị mẫu cho nghiên cứu độ thu hồi: Để thực hiện công việc nghiên cứu độ thu hồi, 10 mL mẫu (mẫu thu đƣợc từ các tình nguyện viên không chứa chất chẹn beta) đƣợc thêm chuẩn bằng cách thêm hỗn hợp dung dịch chuẩn của các chất chẹn beta sao cho nồng độ cuối cùng đạt là 50,0; 100,0 và 200,0 ng/mL. Sau đó, các mẫu thêm chuẩn này đƣợc tiến hành chuẩn bị và phân tích theo quy trình đƣa ra ở trên. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Xác định ion chính và các ion chuyển hóa Các chất chẹn beta đƣợc xác định bằng kỹ thuật Electro Spray Ionization ở chế độ ion dƣơng. Ban đầu, từng chất đƣợc xác định ở chế độ quét phổ để xác định ion chính (Mother ion) và sau đó tiếp tục đƣợc xác định ở chế độ MRM để xác định các ion chuyển hoá cho từng chất nghiên cứu. 1.1 Acebutolol Ion chính của Acebutolol có số khối là 337, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Acebutolol là các mảnh có số khối 116 và 260. Ion chuyển hóa m/z =116 là ion hay gặp của các chất chẹn beta. Phân mảnh ở liên kết C- O của nhóm phenol ete sẽ cho mảnh m/z =116. Píc ion chuyển hóa 260 ứng với (M+ + H) – 77 là ion thƣờng gặp. Việc mất một phân tử H2O và đứt mạch ở liên kết C-N và việc loại bỏ phân tử C3H7NH2 cho ion (M + + H) – H2O-C3H7NH2 tƣơng ứng với mảnh m/z = 260. 37 1.2 Alprenolol Ion chính của Alprenolol có số khối là 250, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Alprenolol là các mảnh có số khối 116 và 173. Các ion chuyển hóa 116 và 173 ứng với (M + + H) - 77 là các píc thông thƣờng và đƣợc hình thành tƣơng tự nhƣ hợp chất Acebutolol. 1.3 Atenolol Ion chính của Atenolol có số khối là 267, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Atenolol là các mảnh có số khối 145 và 190. Peak 190 là píc ứng với (M+ + H) – 77, píc ion 145 là píc riêng biệt của Atenolol khi mất thêm nhóm amide CO-NH3 từ ion chuyển hóa với mảnh có m/z = 190. 1.4 Betaxolol Ion chính của Betaxolol có số khối là 308, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Betaxolol là các mảnh có số khối 116 và 231. Các píc ion m/z =116 và 231 là các ion thƣờng gặp trong các hợp chất chẹn beta, ứng với nhóm C6H14NO và (M + + H) - 77, tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp của Acebunolol và Alprenolol. 1.5 Celiprolol Ion chính của Celiprolol có số khối là 380, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Celiprolol là các mảnh có số khối 251 và 307. Píc ion m/z = 307 đƣợc tạo thành do đứt liên kết C - N để loại phân tử C4H9NH2. Píc m/z = 251 là do ion 307 – 56 đƣợc tạo thành do mất thêm 4 nhóm CH2 từ ion m/z =307. 1.6 Esmolol Ion chính của Esmolol có số khối là 296, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Esmolol là các mảnh có số khối 145 và 219. Píc ion m/z = 219 = (M+ + H) - 77 là píc thƣờng gặp đối với nhóm chẹn beta. Tiếp đó, sự gãy liên kết ở vị trí C - C loại nhóm CH2COOCH3 để tạo phân mảnh ion với m/z là 145. 38 1.7 Labetolol Ion chính của Labetolol có số khối là 329, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Labetolol là các mảnh có số khối 162 và 311. Mất phân tử nƣớc từ Labetolol sẽ cho píc ion với m/z = 311 là peak của (M+ + H) – 18. Việc gãy liên kết C - C cho ion có mảnh 162. 1.8 Levobunolol Ion chính của Levobunolol có số khối là 292, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Levobunolol là các mảnh có số khối 201 và 236. Với phân tử có nhóm tert-butyl, gãy liên kết C - N loại bỏ một phân tử isobutene sẽ cho píc ion chuyển hóa (M+ + H) – 56. Mất phân tử nƣớc (H2O = 18) và nhóm tert-butyl amin (C4H9NH2 = 63) sẽ cho píc ion với m/z = 201 là píc của (M+ + H) – 91. 1.9 Metoprolol Ion chính của Metoprolol có số khối là 268, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Metoprolol là các mảnh có số khối 116 và 191. Các píc ion m/z =116 và 133 là các ion thƣờng gặp trong các hợp chất chẹn beta, ứng với nhóm C6H14NO và (M + + H) - 77, tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp của Acebunolol và Alprenolol. 1.10 Propranolol Ion chính của Propranolol có số khối là 260, hai ion chuyển hoá đƣợc lựa chọn cho Propranolol là các mảnh có số khối 116 và 183. Các píc ion m/z =116 và 183 là các ion thƣờng gặp trong các hợp chất chẹn beta, ứng với nhóm C6H14NO và (M + + H) - 77, tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp của Acebunolol và Alprenolol. 39 2. Quá trình tách sắc ký Các chất chẹn beta đƣợc tách qua cột C18 (5 cm x 2,1 mm; 1,8 m) của hãng Agilent (Palo alto, CA, Mỹ). Tốc độ pha động đƣợc khống chế ở 0,2 mL/phút. Thể tích bơm mẫu là 5L cho cả chất chuẩn và các mẫu phân tích. Pha động chạy ở chế độ gradient với hai pha dung môi A và B, trong đó A là nƣớc có pha 1% formic acid và B là acetonitrile. Chế độ gradient đƣợc khống chế và thiết lập dựa trên hệ bơm binary của hệ thống sắc ký lỏng nhƣ sau: Chạy isocratic trong 2 phút với 100 % dung môi B, sau đó chạy gradient từ phút 2,1 đến phút thứ 5 để đạt 85% dung môi B. Giữ nguyên chế độ 85% dung môi B đến 10 phút. Tiếp tục chạy gradient từ phút thứ 10 đến phút thứ 20 để đạt 35% dung môi B và giữ nguyên 35% dung môi B không đổi từ phút thứ 20 đến phút thứ 22. Theo hình 1, độ phân giải của các chất chẹn beta nói chung là tốt và toàn bộ đã đƣợc tách trong thời gian khoảng 20 phút. Hình 1. Sắc đồ phân tách 10 chất chẹn beta 3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp 3.1 Khoảng tuyến tính Các chất chẹn beta có khoảng tuyến tính trong nồng độ đánh giá là 25, 50, 100, 200 và 400 ng/mL với hệ số xác định (determination coefficients) của các chất đều  0.99. 3.2 Giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp đƣợc tính toán dựa trên giá trị 10 lần của tín hiệu nhiễu của từng chất chẹn beta. Với hầu hết các chất, giá trị giới hạn định lƣợng đều nhỏ hơn 5 ng/mL. 3.3 Độ thu hồi Độ thu hồi đạt đƣợc của các chất chẹn beta nằm trong khoảng từ 77 đến 112 %. Độ chính xác của phƣơng pháp, thể hiện với giá trị độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) nhỏ hơn 15% nhƣ thể hiện trong bảng 1 là đáp ứng đƣợc với yêu cầu phân tích lƣợng vết. 40 Bảng 1. Độ thu hồi của các mẫu thêm chuẩn Tên chất Giá trị thu hồi trung bình ± RSD (n=4) 50 ng/mL 100 ng/mL 200 ng/mL Atenolol 75  8 80  3 89  5 Acebutolol 77  4 88  6 87  10 Levobunolol 72  8 82  13 86  8 Esmolol 75  14 81  6 87  6 Celiprolol 72  15 90  15 94  12 Labetolol 74  11 83  12 89  10 Metoprolol 62  9 75  12 79  11 Alprenolol 75  11 88  9 90  7 Propranolol 86  6 84  10 86  7 Betaxolol 78  9 81  6 102  6 4. KẾT LUẬN Ion chính và các ion chuyển hóa đã đƣợc xác định cho công tác phân tích các chất chẹn beta trong mẫu nƣớc tiểu. Độ lặp lại và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là phù hợp cho việc phân tích các chất chẹn beta trong mẫu nƣớc tiểu đối với công tác kiểm tra doping trong thể thao. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Stoschizly K., Zernig G., Lindner W. (1998) Racemic beta blockers fixed combinations of different drugs; J. Clin. Bas. Cardiol., 1: 14-18. [2] Bristow M. R. (2000) Beta Adrenergic Receptor Blockade in Chronic Heart Failure; Circulation, 101: 558-569. [3] [4] WADA_Prohibite_List_2015. [5] Alnouti, Y., Srinivasan, K., Waddell, D., Bi, H., Kavetskaia, O., Gusev, A.I. (2005) Development and application of a new on-line SPE system combined with LC-MS/MS detection for high throughput direct analysis of pharmaceutical compounds in plasma; J. Chromatogr. A, 1080: 99 –106. [6] Josefsson M., Sabanovic A. (2006) Sample preparation on polymeric solid phase extraction sorbents for liquid chromatographic–tandem mass spectrometric analysis of human whole blood – a study on a number of beta-agonists and beta-antagonists; J. Chromatogr. A, 1120: 1–12.