Nghiên cứu quy trình nhân giống hoa Đồng Tiền bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Lời Cảm Ơn Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của toàn thể cán bộ công nhân viên Bộ Môn Đột Biến và Ưu Thế Lai – Viện Di truyền Nông Nghiệp, những người đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn. Đặc biệt em biết ơn sâu sắc tới: TS.Lê Đức Thảo - người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực tập, giúp đỡ em thực hiện đề tài tốt nghiệp này Em cũng xin chân thành cảm ơn Cử nhân Nguyễn Thị Liên, người đã luôn quan tâm chỉ bảo em trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cuối cùng em xin bày tỏ long biết ơn của mình đối với những người thầy đã dạy dỗ em trong suốt 4 năm học qua, cũng như toàn thể ban chủ nhiệm khoa CNSH- Viện ĐH Mở Hà Nội và tất cả các bạn lớp KS CNSH 07-05 Viện ĐH Mở Hà Nội Hà Nội, ngày 7 tháng 3 năm 2011 Sinh Viên Hoàng Văn Nam Mục lục Trang Phần I: Mở đầu……………………………………………………. 2 I.1/ Đặt vấn đề ……………..……………………………… 2 I.2/ Mục đích, yêu cầu …………………………………….. 3 Phần II: Tổng quan tài liệu …..…………………………………… 5 II.1/ Tình hình sản xuất hoa trong nước và trên thế giới …... 5 II.2/ Giới thiệu về hoa Đồng Tiền………………………….. 8 Phần III: Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu………….. 10 III.1/Đối tượng …………………………………………….. 10 III.2/ Nội dung……………………………………………… 10 III.3/ Các chỉ tiêu theo dõi …………………………………. 12 III.4/ Xử lý số liệu ………………………………………….. 13 Phần IV: Kết quả và thảo luận …… ………………………………. 15 IV.1/ Thí nghiệm tạo nguồn vật liệu vô trùng………………. 15 IV.2/ Giai đoạn nhân nhanh…………………………………. 17 Phần VI: Kết luận và đề nghị……………………………………….. 20 V.1/ Kết luận ………………………………………………… 20 V.2/ Đề nghị ………………………………………………… 20 Phụ lục …………………………………………………………….. 21 Tài liệu tham khảo……………….………………...,………………. 23 Phần I MỞ ĐẦU I.1/ Đặt vấn đề: Từ thời cổ xưa con người đã sớm biết thưởng thức cái đẹp của thiên nhiên. Hoa đã đi vào cuộc sống như một nét đẹp không thể thiếu trong các ngày lễ tết, hội hè, đình đám, tranh hoàng nhà cửa… Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế gới nói chung và ở nước ta nói riêng tăng nhanh hơn bao giờ hết. hoa tươi trở thành loại sản phẩm mang lại giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt trong thị trường hang hóa nông nghiệp của thế giới. Thị trường hoa tươi tập trung ở các nước có nền công nghiệp phát triển cao: Hà Lan; Pháp; Anh; Nhật; Ý; Nhật; Mỹ. Các nước chiếm ưu thế trên thị trường là các nước có nền công nghiệp phát triển cao, có công nghệ sản xuất hoa tiên tiến và hiệu quả. Họ đã nghiên cứu và ứng dụng thành công những kĩ thuật sinh học và nông học hiện đại trong từng khâu sản xuất như: chọn, tạo giống mới, nhân giống, nuôi trồng, bảo quản hoa tươi… Rõ rang để có thể thương mại hóa ngành sản xuất hoa thì phải chương trình hóa được quá trình sản xuất : bao nhiêu sản phẩm, loại gì, thời gian nào,kích thước, tiêu chuẩn…Điều đó chỉ có thể thực hiện được trên nền kĩ thuật rất cao và trước hết phải có công nghệ nhân giống hiện đại. Đó chính là công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Chỉ tính riêng ở Hà Lan hàng năm đã sản xuất 15 triệu cây giống hoa đồng tiền bằng nuôi cấy mô tế bào để cung cấp cho sản xuất, Mấy năm gần đây, trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây/ năm, ước tính đạt 250 triệu cây trên năm mới đáp ứng được với nhu cầu của thực tế. Một vấn đề đặt ra hiện nay là giá giống cây nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô còn cao , vì vậy cần phải cải tiến các quy trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ giới hóa các khâu nhân giống và mở rộng quy mô, tăng năng xuất sản xuất các giống. Trong các loại hoa đang trồng phổ biến ở Việt Nam thì hoa đồng tiền (Gerbera) là 1 loài hoa khá đẹpvới nhiều màu sắc đa dạng phong phú, đang được nhiều người ưa chuộng, nhu cầu giống đang tăng cao.Với ưu thế của nhân giống invitro là từ 1 lượng nhỏ của cây mẹ có thể tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ được đặc tính của cây mẹ, có hệ số nhân giống cao dễ khắc phục khi gặp điều kiện bất lợi và đặc biệt là tạo ra được một lượng lớn cây sạch bệnh, phẩm chất tốt, đáp ứng được nhu cầu về giống hoa hiện nay. Với ưu điểm dễ trồng, dễ nhân giống, chăm sóc đơn giản ít tốn công, trồng một lần có thể thu hoạch liên tục từ 4 - 5 năm. Hiện nay, diện tích hoa đồng tiền chiếm tới 8% trong cơ cấu chủng loại sản xuất hoa cả nước và không ngừng được mở rộng. Tuy nhiên, các giống hoa trong sản xuất được người trồng nhập về từ nhiều nguồn khác nhau không qua khảo nghiệm đánh giá một cách hệ thống cho nên năng suất, phẩm chất hoa chưa đáp ứng được thị hiếu người tiêu dùng. Do vậy, công tác nghiên cứu chọn tạo, nhập nội giống, tuyển chọn giống hoa đồng tiền thích nghi với điều kiện khí hậu nước ta có ý nghĩa rất quan trọng góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất, tăng thu nhập cho người dân.Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần vào công tác chọn tạo giống cũng như hoàn thiện quy trình kỹ thuật thâm canh nâng cao năng suất, chất lượng và hiệu quả sản xuất hoa đồng tiền, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu quy trình nhân giống hoa Đồng Tiền bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào” . I.2/ Mục đích, yêu cầu: I.2.1/ Mục đích: Nghiên cứu nhân nhanh invitro giống hoa Đồng Tiền. I.2.2/ Yêu cầu: I.2.2.1/ Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương pháp khử trùng mẫu với các lọa mẫu cấy, tạo nguyên liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính invitro. I.2.2.2/ Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng tới quá trình nhân chồi. I.2.2.3/ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điêu tiết sinh trưởng đến quá trình tạo cây hoàn chỉnh. I.2.2.4/ Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của cây Đồng Tiền khi đưa ra vườn ươm. *. Với thời gian thực tập là 3 tháng chúng tôi chỉ hi vọng hoàn thành 2 yêu cầu (I.2.2.1 và I.2.2.2) còn hai yêu cầu cuối chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành nghiên cứu khi thời gian cho phép. Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1/ Tình hình sản xuất hoa Đồng Tiền trong nước và trên thế giới: II.1.1/ Tình hình sản xuất hoa Đồng Tiền trên thế giới Ngày nay sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và trở thành một ngành thương mại cao. Sản xuất hoa mang lại lợi ích to lớn cho nền kinh tế các nước trồng hoa cây cảnh, trong đó có các nước châu Á. Sản xuất hoa ở các nước châu Á đang phát triển mạnh và cạnh tranh quyết liệt để chiếm lĩnh thị trường hoa trên thế giới. Cây hoa đồng tiền tên khoa học là Gerbera jamesonic Bolus, là một trong 10 loại hoa quan trọng nhất trên thế giới (sau hoa hồng, cúc, lan, cẩm chướng, lay ơn). Hoa đồng tiền có nguồn gốc ở Nam Phi, năm 1697 Relomen phát hiện thấy ở vùng phía Nam châu Phi (Delansia) và ông đã đưa về vườn thực vật nước Anh. Iwin Lych là người đầu tiên tiến hành lai tạo các giống đồng tiền với nhau. Sau đó người Pháp và người Hà Lan cũng tiến hành lai tạo và dần dần hai nước này cũng trở thành trung tâm tạo giống cho đồng tiền thế giới (Đặng Văn Đông và cs, 2003). Hiện nay công tác nghiên cứu và sản xuất hoa ở nước ngoài rất phát triển. Trình độ tạo giống sản xuất của các nước Hà Lan, Nhật Bản, Mỹ, Đức.... rất cao như công ty Forist của Hà Lan là công ty dẫn đầu thế giới về tạo giống, nghiên cứu, sản xuất, buôn bán hoa đồng tiền. Họ có lực lượng rất mạnh về nghiên cứu khoa học về thiết bị sản xuất đã tạo ra rất nhiều giống, sản lượng ngày càng nhiều, việc sử lý sau thu hoạch, bảo quản, đóng góp đều ở trình độ rất cao. Ở Trung Quốc ngay từ những năm 20 của thế kỷ 20 đã có sản xuất hoa đồng tiền cắt cành. Ở Mai Long Thượng Hải, nhưng do giống thoái hoá nghiêm trọng nên không phát triển được cho đến năm 1987 vận dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật nhân giống nhanh khắc phục được tình trạng thoái hoá giống thì hoa đồng liền mới khôi phục và phát triển. Hiện nay Thượng Hải là nơi có diện tích trồng lớn nhất 35 ha, trong đó trung tâm nhân giống hoa Hà Viên Nghê ở nông trường Đông Hải đứng đầu trong sản xuất và nhân giống hoa đồng tiền. Ở Giang Tô cũng là nơi phát triển mạnh hoa đồng tiền, năm 1995 mới có trên 6.000m2, đến năm 1999 đã có tới 6 ha. Viện nghiên cứu rau, Viện nghiên cứu khoa học nông nghiệp và nông trường Liên Vân... là những đơn vị có diện tích trồng lớn, kỹ thuật tương đối cao. Tuy nhiên trong sản xuất hoa đồng tiền ở một số nước đang phát triển vẫn có một số biểu hiện sau: Tính chuyên nghiệp và quy mô sàn xuất chưa cao. Rất ít có công ty chuyên sản xuất, quy mô sản xuất thường nhỏ nên không có sản phẩm đứng đầu, đủ sức cạnh tranh trên thị trường trong nước và quốc tế. Ví dụ: ở Tô Châu diện tích trồng hoa Đồng Tiền lớn nhất không quá 2 ha, nhỏ thì chỉ trên 1.000m2, sản lượng hoa hàng ngày rất ít, nên phí thu hái, bao gói, vận chuyển không cân xứng, tiêu thụ tại chỗ thì thừa, bán ra ngoài thì không kinh tế nên hiệu quả kinh tế thấp. Trong khi đó ở Colombia có hơn 100 nông trường quy mô từ 20 ha đến 30 ha, mỗi nông trường chỉ trồng 2 - 3 giống, mỗi giống 8-10 ha. Tổng diện tích sản xuất lớn. sản lượng ít, chất lượng kém. Diện tích trồng trọt được mở rộng nhưng phân tán, lực lượng kỹ thuật không tập trung lại thêm thiết bị sản xuất thấp, chất lượng kém ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả kinh tế. Theo thống kê năm 1996 diện tích trồng hoa của Trung Quốc là 75.000 ha, giá trị 600 triệu đơm Mỹ. Trong khi đó tại Hà Lan trồng 8017 ha giá trị sản lượng 3 tỷ 590 triệu đôla Mỹ gấp 56 lần Trung Quốc. Trang thiết bị trồng trọt lạc hậu, hàm lượng kỹ thuật cao ít. Tỷ lệ thiết bị tiên tiến trong trồng trọt rất nhỏ, cách trồng cổ truyền văn chiếm ưu thế gây lên sản lượng thấp, chất lượng kém, mùa vụ sản xuất không phù hợp với nhu cầu lúc cần, khả năng cung ứng hoa quanh năm không mạnh do đó giá cả không ổn định, hiệu quả kinh tế thấp. Nghề trồng hoa ở Hà Lan đã áp dụng rộng rãi nhu cầu công nghiệp hoá tự động hoá và trên 80% hoa được trồng trong môi trường không cần đất. II.1.1.2/ Tình hình sản xuất Đồng Tiền hoa trong nước: Ở nước ta hoa Đồng Tiền được trồng tập trung và chủ yếu ở các vùng trồng hoa truyền thống như là: Ngọc Hà, Sa Pa, Đà Lạt… Hiện nay, diện tích trồng hoa của cả nước chiếm khoảng 2000ha chiếm 0.02% diện tích đất trồng trọt, trong đó dẫn đầu là Hà Nội (500ha); Nam Định (390ha); Hải Phòng(320ha)(Nguyễn Xuân Linh 1998) Năm 2001 diện tích trồng hoa chuyên canh đã tăng lên 3500ha, trong đó hơn 100ha được thâm canh cao trong các nhà lồng, nhà kính, nhà lưới. Công tác chọn tạo giống mới chậm so với sản xuất. Hiện nay giống trong sản xuất rất ít, đa số là giống nhập từ nước ngoài, không tự sản xuất được, các giống trồng trong sản xuất đã lạc hậu, biểu hiện ở năng suất thấp, không được tươi lâu cây dễ nhiễm sâu bệnh... Đầu tư cho cơ quan khoa học về hoa cắt rất ít nên còn rất nhiều vấn đề về chọn tạo giống, nhân giống ứng dụng công nghệ cao vào sản xuất bảo quản, xử lý hoa. Vì vậy, Nhà nước cần có chính sách đầu tư phát triển như: Nhập nội, chọn lọc, lai tạo giống hoa mới chất lượng cao. Áp dụng các công nghệ mới cho nghề trồng hoa ( nhà lưới,b sản xuất cây giống sạch bệnh….) Đầu tư cơ sở vật chất cho nghề trồng hoa. Đào tạo đội ngũ cán bộ nâng cao hiểu biết về hoa, giống, phân bón, thuốc bảo vệ thực vật… II.2/ Giới thiệu về hoa Đồng Tiền II.2.1/ Nguồn gốc và sự phân bố: Tên khoa học: Gerbera (Tên gọi Gerbera được đặt theo tên nhà tự nhiên học người Đức Traugott Gerber, một người bạn của Carolus Linnaeus.) Tên Việt Nam: Đồng Tiền hoặc Cúc Đồng Tiền. Họ: Asteraceae Bộ: Asterales Nguồn Gốc: Có khoảng 30-100 loài sống hoang dã, phân bổ ở Nam Mỹ, châu Phi đại lục, Madagascar và vùng nhiệt đới châu Á. Miêu tả khoa học đầu tiên về chi Gerbera đã được J.D. Hooker thực hiện trong tạp chí thực vật Curtis năm 1889 khi ông miêu tả Gerbera jamesonii, một loài ở Nam Phi được biết dưới tên gọi cúc Transvaal hay cúc Barberton. Ở Việt Nam hoa Đồng Tiền được trồng phổ biến và rộng rãi. II.2.2/ Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của cây hoa Đồng Tiền: Thân, lá: thân ngầm, không phân cành mà chỉ đẻ nhánh, lá và hoa phát triển từ thân. Lá mọc chếch so với mặt đất một góc 15o – 45o.Lá có hình lông chim, xẻ thùy nông hoặc sâu, mặt lưng lá có lớp lông nhung. Rễ: thuộc loại rễ chùm, phát triển khỏe, rễ hình ống ăn ngang và nổi phía trên mặt luống, rễ thường vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra. Hoa: đồng tiền do hai loại hoa nhỏ hình lưỡi và hình ống tạo thành, là loại hoa tự đơn hình đầu. Hoa hình lưỡi tương đối lớn mọc ở phía ngoài xếp thành một vòng hoặc vài vòng nhỏ, do sự thay đổi hình thái và mầu sắc nên được gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa rất được chú trọng. Trong quá trình hoa nở, hoa hình lưỡi nở trước, hoa hình ống nở theo thứ tự từ ngoài vào trong, theo từng vòng một. Quả: quả đồng tiền thuộc dạng quả bế có lông, không có nội nhũ, hạt nhỏ, một gam hạt có khoảng 280 - 300 hạt (Đặng Văn Đông và cs, 2003). PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu: III.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là giống Gerbera. III.1.2Vật liệu nghiên cứu: - Các nụ hoa non khoẻ mạnh, không sâu bệnh. - Các thiết bị, dụng cụ và hoá chất trong nuôi cấy mô, tế bào bao gồm: + Thiết bị và dụng cụ: nồi hấp khử trùng, bình tam giác, đèn cồn, box cấy vô trùng. + Hoá chất: dung dịch MS, cồn 70o và 90o, một số phytohoocmon như BAP, Kinetin, NAA, IBA, chất khử trùng HgCl2... + Ngoài ra còn sử dụng một số chất khác như: agar, đường saccarose III.1.2Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: phòng nuôi cấy mô hoa cây cảnh – Bộ môn đột biến và Ưu thế lai – Viện Di truyền Nông nghiệp. Thời gian nghiên cứu: từ 6 tháng 12 đến hết 7 tháng 3 III.2 Nội dung nghiên cứu III.2.1Giai đoạn trong phòng III.2.1.1Giai đoạn khử trùng mẫu Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng HgCl2 0.1% đến tỷ lệ mẫu nhiêm. Thời gian khử trùng trong 1, 3, 5 và 6 phút.Môi trường MS cơ bản CT1: Khử trùng trong 5 phút CT2: Khử trùng trong 7 phút CT3: Khử trùng trong 10 phút CT4: Khử trùng trong 15 phút Thí nghiệm: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng Oxy già (H2O2) đến tỷ lệ mẫu nhiêm. Thời gian khử trùng trong 15 phút.Môi trường MS cơ bản CT1: Khử trùng nồng độ 25% CT2: Khử trùng nồng độ 30% CT3: Khử trùng nồng độ 35% CT4: Khử trùng nồng độ 40% III.2.1.2Giai đoạn tái sinh nhân nhanh chồi Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP trong môi trường MS đến khả năng phát sinh chồi. Môi trường MS, bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau: 0.2 mg/l; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 mg/l CT1: MS (đối chứng) CT2: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.1 mg/l BAP CT3: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.3 mg/l BAP CT4: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.5 mg/l BAP CT5: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.7 mg/l BAP Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và Kinetin trong môi trường MS đến quá trình nhân nhanh. CT1: MS (đối chứng) CT2: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.1 mg/l BAP + 0.1mg/l Kinetin CT3: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.3 mg/l BAP + 0.1mg/l Kinetin CT4: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.5 mg/l BAP + 0.1mg/l Kinetin CT5: MS + 30g saccarose + 6,5g Aga + 0.7 mg/l BAP + 0.1mg/l Kinetin III.3/ Các chỉ tiêu theo dõi III.3.1/Các chỉ tiêu theo dõi trong phòng Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =
× 100 Tỷ lệ mẫu chết (%) =
× 100 Tỷ lệ mẫu sống (%) = 100% - Tỷ lệ mẫu nhiễm - Tỷ lệ mẫu chết Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (%) =
× 100 Hệ số nhân chồi (lần/tháng) =
Chiều cao chồi trung bình (cm/cây) =
Chất lượng chồi: +++: Tốt (chồi mập, lá to, xanh đậm) ++: Trung bình (chồi to trung bình, lá to trung bình, xanh) +: Kém (chồi nhỏ, lá nhỏ, xanh nhạt hoặc vàng) Số lá trung bình (lá/chồi) =
Độ dài của rễ (cm/rễ) =
Số rễ trung bình (rễ/cây) =
III.3.2Các chỉ tiêu theo dõi ngoài vườn ươm Tỷ lệ cây sống (%) =
× 100 Chiều cao cây trung bình (cm/cây) =
Số lá trung bình (lá/cây) =
Đường kính tán (cm/cây) =
Thời gian sinh trưởng, phát triển (ngày) III.4 Xử lý số liệu Bố trí thí nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên và số liệu được xử lý theo chương trình Excel và IRRISTAT. Phần V Kết quả và thảo luận IV.1/ Thí nghiệm khử trùng mẫu: Đây là giai đoạn đưa đối tượng nuôi cấy từ điều kiện bình thường vào nuôi cấy vô trùng trong ống nghiệm. Vì vậy, đối với tất cả các loại cây trồng khác nhau việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có vai trò quyết định tới sự thành công của quá trình nghiên cứu invitro. Giai đoạn này cần các yêu cầu sau; tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mẫu phân hóa và sinh trưởng tốt Bảng 1: Hiệu quả của phương pháp khử trùng bằng HgCl2 0.1% Nồng độ HgCl2 (%)  Thời gian khử (Phút)  Số mẫu đưa vào  Số mẫu chết  Số mẫu nhiễm  Tỉ lệ chết (%)  Tỉ lệ nhiễm (%)  Tỉ lệ tái sinh (%)   0,1  5  30  0  9  0  30  70   0,1  7  30  0  6  0  20  80   0,1  10  30  1  2  3  6  91   0,1  15  30  5  1  16  3  81   Bảng 2: Hiệu quả khi khử trùng bằng H2O2 Nồng độ H2O2 (%)  Thời gian khử (Phút)  Số mẫu đưa vào  Số mẫu chết  Số mẫu nhiễm  Tỉ lệ chết (%)  Tỉ lệ nhiễm (%)  Tỉ lệ tái sinh (%)   25  15  30  0  13  0  43  57   30  15  30  0  10  0  33  67   35  15  30  4  9  13  30  57   40  15  30  5  9  16  30  54   Qua kết quả thu được từ 2 phương pháp trên chúng tôi thấy rằng phương pháp khử trùng bằng HgCl2 0.1% trong 10 phút và Oxy già 30% trong 15 phút cho hiệu quả cao. Sau khi khử trùng phải ngâm mẫu vào trong nước cất vô trùng 15 phút rồi tráng lại nhiều lần bằng nước cất. Trước khi cấy phải cắt bỏ bớt phần vết cắt có tiếp xúc với chất khử trùng để tránh làm chết mẫu. Kết Luận: Để tạo được nguồn vật liệu sạch ban đầu cho quá trình nhân nhanh cây hoa Đồng Tiền caand thực hiện phương pháp khử trùng như sau: Chọn nọ hoa non khỏe mạnh→Mẫu được cắt bớt phần cuống chỉ để lại 7-10cm→ Rửa sạch dưới vòi nước sạch→ Ngâm trong nước xà phòng loãng 15 phút→ Rửa vài lần bằng nước sạch→Ngâm trong nước 15 phút→ Tráng lại bằng nước cất→ tráng bằng cồn 70% trong 1 phút→ Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần→ Ngâm trong HgCl2 10 phút →rửa lại nhiều lần và ngâm trong nước cất vô trùng→ Tráng lại vài lần rồi gắp vào đĩa Petri có đặt sẵn giấy thấm vô trùng để thấm hết nước. IV.2/ Giai đoạn nhân nhanh: Thí nghiệm theo dõi ảnh hưởng của một số tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng tới sự tái sinh trồi của cây hoa Đồng Tiền: Các nghiên cứu ở giai đoạn này nhằm tìm ra môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi. Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả và tốc độ của công nghệ invitro, giai đoạn này cần các yêu cầu sau: Tạo hệ số nhân giống cho hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm tối đa nguyên liệu, sử dụng môi trường đơn giản, hóa chất rẻ và dễ kiếm. Các trồi tạo ra phải đồng nhất về mặt di truyền, có sức sinh trưởng tốt, các chồi này khi tạo cây hoàn chỉnh đem trồng phải có tỉ lệ sống cao, cây phát triển mạng mẽ, tỉ lệ biến dị thấp nhất. Để nhân nhanh cây hoa Đồng Tiền chúng tôi sử dụng phương thức tạo, nhân nhanh chồi từ các chồi sạch được được sinh ra từ mẫu được sinh ra ở thí nghiệm trên. Trong giai đoạn này chúng tôi lần lượt tiến hành nghiên cứu tác dụng của các tổ hợp KIN + BAP và BAP với nồng đọ khác nhau lên sự tạo chồi nhằm tìm ra môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh hoa Đồng Tiền. Thí nghiệm 2.1 : Ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân: Môi trường  Số mẫu ban đầu  Số mẫu tạo thành  Hệ số nhân    BAP      CT1  0.1  30  122  4.1   CT2  0.3  30  130  4.3   CT3  0.5  30  135  4.5   CT4  0.7  30  120  4   Đối chứng  MS  30  82  2.7   Qua bảng kết quả chúng tôi rút ra kết luận: Đỉnh chồi đưa vào môi trường nuôi cấy có khả năng bật chồi ngay cả trong điều kiện môi trường cơ bản không chưa chất điều tiết sinh trưởng.Tuy nhiên số chồi tạo ra thấp và sinh trưởng kém. Ở môi trường MS có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau thì hệ số nhân trồi khác nhau.Quy luật chung về sự tác động của BAP đến hệ số nhân chồi của hoa Đồng tiền trong thí nghiệm là: trong khoảng nồng độ 0,1mg/l BAP đến 0,5mg/l BAP thì hệ số nhân tăng dần theo tỉ lệ tăng nồng độ của BAP. Nếu tiếp tục tăng dần nồng độ BAP thì hệ số nhân lại giảm dần Vậy ở môi trường có bổ sung 0,5mg/l BAP Cây khỏe, mập, phát triển đều, hệ số nhân đạt tới 4.5 Thí nghiệm 2.2 : Ảnh hưởng của BAP + KIN đến hệ số nhân: Môi trường  Số mẫu ban đầu  Số mẫu tạo thành  Hệ số nhân    BAP  KIN      CT1  0.1  0.1  30  103  3.4   CT2  0.3  0.1  30  150  5   CT3  0.5  0.1  30  130  4.5   CT4  0.7  0.1  30  123  4.1   Đối chứng  MS  30  82  2.7   Qua bảng trên ta thấy ở môi trường CT3 ( 0.5mg/l BAP + 0.1KIN) hệ số nhân là cao nhất 5 lần, Mẫu cao, mập, xanh thẫm và cây con phát triển đều.Khi ta so với môi trường chỉ chưa 0.5mg/l BAP thì lớn hơn điều này chứng tỏ sự kết hợp BAP và KIN có hiệu quả cao hơn khi chỉ sử dụng BAP. Phần VI Kết Luận và Đề Nghị V.1/ Kết Luận Từ những kết quả thu được chúng tôi rút ra một số kết luận sau: Để tạo nguồn nguyên liệu sạch khởi đầu của cây Đồng Tiền cho quá trình nuôi cấy invitro thì chế độ khử trùng tốt nhất là : Khử trùng bởi HgCl2 0,1% trong 10 phút với tỉ lệ tái sinh là 91% Để tái sinh và nhân nhanh chồi Đồng Tiền, môi trường nhân tôt nhất là MS có bổ sung 0.3mg/l BAP + 0.1mg/l KIN. Trên môi trường này, sau 4 tuần nuôi cấy , cây đạt hệ số nhân cao nhất là 5 V.2/ Đề Nghị: Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được trong thời gian thực tập chúng tôi có một số đề nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu tìm chế độ khử trùng tốt nhất , đơn giản nhất, ít độc hại với người thực hiện nghiên cứu. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng khác tới quá trình tạo và nhân nhanh chồi nhằm đạt hiệu quả cao, giá thành hạ. Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình tạo rễ; tạo cây hoàn chỉnh, tìm giá rẻ thích hợp cho quá trình ươm và đưa cây vào sản xuất trên đồng ruộng. Phụ lục Thành phần mô trường dinh dưỡng Murashige and Skoog – 1962 (MS) Lượng pha 1 lít cho dung dịch mẹ Lượng lấy cho 1 lít môi trường 1. Đa lượng: NH4NO3 33.0g KNO3 38.0g MgSO4 7.4g Lấy 50ml/l KH2PO4 3.4g CaCl2.4H2O 8.8g 2.Vi lượng H3BO4 620mg MnSO4.4H2O 2230mg ZnSO4. 4H2O 860mg Lấy 10ml/l KI 83mg MoO4Na.2 H2O 25mg CoCl2.6 H2O 2.5mg CuSO4.5 H2O 2.5mg 3.Sắt FeSO4.7 H2O 5.56mg Lấy 5ml/l Na2EDTA 7.46mg 4.Vitamin Glycine 400mg Axit Nicotinic (B5) 100mg Pyricloxin (B6) 100mg Lấy 5ml/l Thiamin HCL (B1) 200mg Ionsitol 100mg/l Agar 6,5g/l Đường Saccaroza 20mg/l pH: 5,7 – 5,8 Tài liệu tham khảo 1./ Giáo trình sinh lý thực vật ( Nguyễn Quang Thạch – Hoàng Minh Tấn: NXB Nông Nghiệp 1996) 2./ Cách sử dụng chất điều hòa sinh trưởng và vi lượng đạt hiệu quả ( Lê Văn Tri : NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội -1992) 3./ Hoa và Kĩ thuật trồng hoa (Nguyễn Xuân Linh; NXB Nông Nghiệp-1998) 4./Nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nghiên cứu mô cây trồng (Nguyễn Văn Uyển và Cộng sự)