Nghiên cứu quy trình phân tích đồng thời salbutamol, metoprolol bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (ce-C4d)- Cao Văn Hoàng

21 Tập 12, Số 1, 2018 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI SALBUTAMOL, METOPROLOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC (CE-C4D) CAO VĂN HOÀNG*,1, NGUYỄN LÊ MINH DƯƠNG1, PHẠM THỊ KIẾM2 1Khoa Hóa, Trường Đại học Quy Nhơn 2Trường THPT Phan Đình Phùng, Phú Yên TÓM TẮT Việc sử dụng trái phép chất tạo nạc trong chăn nuôi để làm giảm tỷ lệ mỡ/nạc ở động vật gây ra các bệnh nghiêm trọng như đau cơ, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, co thắt phế quản,... Trong bài báo này, chúng tôi sử dụng một phương pháp đơn giản để xác định đồng thời hai chất tạo nạc: Salbutamol và Metoprolol trong một số loại thức ăn chăn nuôi lợn, thịt lợn và các sản phẩm từ thịt bằng phương pháp điện di mao dẫn sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc. Điều kiện tối ưu xác định được gồm: mao quản silica đường kính 50 µm; chiều dài hiệu dụng là 53 cm; dung dịch đệm chứa 10 mmol/L Arginine được điều chỉnh đến pH = 4,0 bằng axit axetic đậm đặc; thời gian phân tách là 12 phút; thế tách là 15 kV. Keywords: Điện di mao quản, chất tạo nạc, Salbutamol, Metoprolol. ABSTRACT Investigation of Simultaneous Analysis of Salbutamol and Metoprolol by Capillary Electrophoresis with Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detection The illegal use of lean substance in livestock to reduce the fat/the lean ratio in animals causes serious diseases such as muscle pain, cardiac arrhythmias, hypertension, bronchospasm, and so on. In this study, we use a simple method for the simultaneous determination of two common substance lean: Salbutamol and Metoprolol in some form of animal feed pigs, pork and meat products by capillary electrophoresis using contactless conductivity detector. The optimum conditions for this study were found as follow: silica capillary 60 cm x 50 μm i.d. (53 cm to detector); buffer containing 10 mmol/L Arginine adjusted to pH = 4,0 with concentrated acetic acid; all of the target analytes can be detected within 12 min; 15 kV applied voltage. Keywords: Capillary electrophoresis, Substance lean, Salbutamol, Metoprolol. 1. Mở đầu Salbutamol (Sal) và Metoprolol (Met) là hai hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm dùng để điều trị bệnh phổi ở người cũng như gia súc và động vật. Tuy nhiên, hai chất này được một số người sử dụng trái phép để bổ sung trong thực phẩm cho lợn để thúc đẩy tăng trưởng, tiêu giảm tỷ lệ mỡ/nạc, kích thích lợn bung đùi, nở vai, tạo nạc trong thời gian ngắn. Các chất này tồn tại trong thịt với dư lượng lớn, nếu tiêu thụ thức ăn có nguồn gốc từ thịt bị nhiễm các chất này sẽ gây ra những ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng như các bệnh liên quan đến tim Tạp chí Khoa học - Trường ĐH Quy Nhơn, ISSN: 1859-0357, Tập 12, Số 1, 2018, Tr. 21-27 *Email: caovanhoang@qnu.edu.vn Ngày nhận bài: 25/4/2017; Ngày nhận đăng: 14/5/2017 22 Cao Văn Hoàng, Nguyễn Lê Minh Dương, Phạm Thị Kiếm mạch, hệ thần kinh trung ương [5]. Tại Việt Nam, Salbutamol và Metoprolol được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong các phòng thí nghiệm với trang bị hiện đại, sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ tinh khiết, giá thành phân tích cao [2, 3]. Phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) là một phương pháp phân tích mới với những ưu điểm như: trang bị nhỏ gọn, có thể tự động hóa và triển khai tại hiện trường, hoạt động tương đối đơn giản, lượng mẫu và hóa chất nhỏ, chi phí phân tích thấp [1, 4], cho thấy tiềm năng ứng dụng kiểm tra nhanh ngay tại các đội quản lý thị trường ở các địa phương. Trong bài báo này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công quy trình phân tích đồng thời hai chất Sal và Met ứng dụng vào phân tích các mẫu thức ăn gia súc, mẫu thịt, bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc. 2. Thực nghiệm 2.1. Thiết bị Hệ thiết bị điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (Hình 1) là một hệ bán tự động được chế tạo bởi công ty 3SAnalysis ( phối hợp với nhóm nghiên cứu của giáo sư Peter C.Hauser (Đại học Basel, Thụy Sĩ). Hình 1. Hệ thiết bị điện di mao quản CE-C4D tự chế, bán tự động sử dụng trong nghiên cứu (1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D), 4: Bộ phận kết nối bán tự động, 5: Núm điều chỉnh, 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén) 2.2. Hóa chất Các hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích. Salbutamol, Metoprolol, axit Acetic, axit Clohydric và Natri hydroxit (Merck), L-Histidine và L- Arginine (Fluka), nước deion. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Khảo sát, tối ưu điều kiện tách các chất phân tích 3.1.1. Khảo sát hệ đệm điện di Thành phần hệ đệm là một yếu tố có ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng xuất hiện và tách chất trong quá trình điện di. Vì vậy, công việc quan trọng là tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hệ đệm. Hệ đệm được khảo sát gồm một trong hai hợp phần bazơ thường sử dụng trong phương pháp CE-C4D là Arginine (Arg) (pKa = 9,09) hoặc Histidine (His) (pKa = 8,97), kết hợp với hợp phần axit thông dụng như axit Acetic (Ace). Trong đó, hợp phần bazơ được giữ nguyên nồng độ 23 Tập 12, Số 1, 2018 10 mM và dùng hợp phần axit để điều chỉnh đến pH mong muốn bằng máy đo pH. Kết quả khảo sát cho thấy hệ đệm Arg-Ace cho đường nền ổn định, tín hiệu pic của các chất phân tích cao hơn và độ phân giải tốt hơn hệ đệm His-Ace. Do đó, hệ đệm này được sử dụng để khảo sát pH và các điều kiện khác. Giá trị pH được thực hiện khảo sát trong khoảng từ 3,5 đến 6,0. Các kết quả được thể hiện trong Hình 2 và Hình 3. Hình 2. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phân tách của Sal, Met 50 mg/l trong vùng pH từ 3,5 đến 6,0. Dung dịch đệm điện di: Arg-Ace, thế tách +15 kV, mao quản silica có chiều dài hiệu dụng 46 cm. Hình 3. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa tín hiệu diện tích pic, độ phân giải R của 2 pic Sal và Met phụ thuộc vào pH của dung dịch đệm điện di Kết quả ở Hình 2 và Hình 3 cho thấy, khi tăng pH, tổng thời gian phân tích giảm, nhưng diện tích pic và khả năng phân tách pic của hai chất cũng giảm. Tại giá trị pH = 4,0 cho kết quả tốt nhất về diện tích pic, độ phân giải giữa các pic, tín hiệu nền ổn định và thời gian phân tích hợp lý. Do đó, nó được lựa chọn để thực hiện các khảo sát tiếp theo. 40 mV 24 Cao Văn Hoàng, Nguyễn Lê Minh Dương, Phạm Thị Kiếm 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của chiều dài mao quản Chiều dài mao quản là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự khuếch tán của vùng mẫu, dẫn đến ảnh hưởng diện tích pic, độ phân giải pic hay khả năng tách các pic. Vì vậy cần khảo sát lựa chọn chiều dài dây mao quản hợp lý để vừa đảm bảo được tín hiệu đủ lớn, độ nhạy tốt mà chân pic không bị giãn rộng và tránh trường hợp chồng pic. Các giá trị chiều dài được lựa chọn để khảo sát là 40, 46, 50, 53 cm. Kết quả khảo sát được thể hiện trong Hình 4. Hình 4. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của chiều dài mao quản đến sự phân tách của Sal, Met 50 mg/l. Dung dịch đệm điện di: Arg-Ace 10 mM, pH = 4,0, thế tách +15 kV Trong Hình 4 cho thấy khi tăng chiều dài mao quản thì thời gian di chuyển của các chất tăng, đồng thời diện tích pic và độ phân giải cũng bị ảnh hưởng. Có thể thấy khi mao quản có chiều dài hiệu dụng 53 cm cho kết quả tốt về diện tích pic, độ phân giải giữa các chất tốt, tín hiệu nền ổn định, thời gian phân tích hợp lý. Do đó, mao quản có chiều dài hiệu dụng (L eff ) 53 cm (l = 60 cm) là điều kiện tối ưu. 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu Chiều cao bơm mẫu là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy, thời gian lưu cũng như diện tích pic. Khi tăng chiều cao bơm mẫu thì lượng mẫu đi vào mao quản nhiều hơn, cho tín hiệu các pic tăng lên tương ứng. Nhưng nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì làm giảm hiệu suất tách và để thuận lợi cho quá trình bơm mẫu cũng như thời gian bơm mẫu thì tiến hành khảo sát chiều cao bơm mẫu ở 5 giá trị 10, 15, 20, 25, 30 cm. Kết quả được thể hiện trong Hình 5. Hình 5. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu đến tín hiệu của Sal, Met 50 mg/l. Dung dịch đệm điện di: Arg-Ace 10 mM, pH = 4,0, Leff = 53 cm, thế tách +15 kV. 40 mV 25 Tập 12, Số 1, 2018 Dựa vào Hình 5 ta thấy, khi ta tăng chiều cao bơm mẫu thì thời gian di chuyển của các chất phân tích thay đổi không đáng kể, nhưng diện tích pic thì tăng lên rất nhiều. Tại chiều cao 20 cm cho kết quả tốt cả diện tích pic, độ phân giải giữa hai pic, đồng thời tín hiệu nền ổn định nên chiều cao này được lựa chọn tối ưu cho quy trình phân tích. 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu Giống như khi ta tăng chiều cao bơm mẫu, khi tăng thời gian bơm mẫu thì lượng mẫu đi vào mao quản sẽ tăng lên. Trong phương pháp điện di, lượng mẫu đi vào mao quản phải đủ lớn để đảm bảo cho quá trình điện di có độ nhạy tốt. Nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì xuất hiện sự phân tán mạnh (mở rộng vùng mẫu) do hiện tượng khuếch tán làm giảm hiệu suất tách. Vì vậy cần khảo sát để chọn thời gian bơm mẫu hợp lý, đảm bảo thu được tín hiệu lớn nhất mà pic không bị giãn rộng, đảm bảo được độ nhạy của phép đo. Việc khảo sát thời gian bơm mẫu được thực hiện với 5 giá trị thời gian bơm mẫu khác nhau là 20, 25, 30, 35 và 40 s. Kết quả được thể hiện trong Hình 6. Hình 6. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến tín hiệu của Sal, Met 50 mg/l. Dung dịch đệm điện di: Arg-Ace 10 mM, pH = 4,0, Leff = 53 cm, thế tách +15 kV. Từ các kết quả khảo sát ở Hình 6 có thể nhận thấy, khi tăng thời gian bơm mẫu từ 20 s - 40 s thì thời gian di chuyển tương đối giữa các chất hầu như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít và diện tích pic tăng tương ứng. Điều này là hoàn toàn phù hợp vì khi tăng thời gian bơm mẫu sẽ làm tăng lượng mẫu được bơm vào mao quản, tạo tín hiệu lớn hơn nên diện tích pic tăng. Đây là một yếu tố làm tăng giới hạn phát hiện của chất phân tích. Tuy nhiên, khi thời gian bơm mẫu dài sẽ tạo tín hiệu lớn hơn và làm dịch chuyển đôi chút về thời gian di chuyển của các chất cũng như làm giảm độ phân giải giữa các pic. Khi đó khả năng tách sẽ giảm. Đồng thời trong phân tích mẫu thực, hàm lượng các cation lớn nên khi tăng thời gian bơm mẫu các pic của cation cũng tăng, có thể cản trở pic chất phân tích. Qua khảo sát ta thấy, tại giá trị thời gian bơm mẫu 30 s cho kết quả về độ phân giải, đảm bảo độ nhạy của phép đo. Do đó, giá trị này được dùng làm điều kiện tối ưu trong phân tích. 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thế điện di đặt vào hai đầu mao quản Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế (E) một chiều nhất định đặt vào hai đầu mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Để cho kết quả tốt và ổn định thì cần phải chọn thế thích hợp nhất và giữ để thế này luôn ổn định trong suốt quá trình phân 26 Cao Văn Hoàng, Nguyễn Lê Minh Dương, Phạm Thị Kiếm tách. Trên cơ sở trang thiết bị sẵn có các điện thế được lựa chọn khảo sát là: 13, 15, 17 và 19 kV. Kết quả khảo sát thế thể hiện trong Hình 7. Từ kết quả trên Hình 7 cho thấy, khi tăng thế điện di thì thời gian di chuyển của các chất giảm, đồng thời độ phân giải giữa các pic cũng giảm. Tại giá trị thế áp đặt 15 kV cho kết quả đường nền ổn định, thời gian phân tích hợp lý, độ phân giải tốt. Vì vậy thế 15 kV được lựa chọn làm thế tách tối ưu. Hình 7. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách đến tín hiệu của Sal, Met 50 mg/l. Dung dịch đệm điện di: Arg-Ace 10 mM, pH = 4,0, Leff = 53 cm. 3.2. Lập đường chuẩn cho Salbutamol và Metoprolol Đường chuẩn của hai chất salbutamol, metoprolol được thiết lập trên cơ sở điều kiện phân tích tối ưu khảo sát được, trong khoảng tuyến tính từ 7,0.10-5 M đến 3,0.10-4M. Hình 8. Đường chuẩn của Salbutamol Hình 9. Đường chuẩn của metoprolol Bảng 1. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) cho Sal và Met Tên chất Phương trình đường chuẩn (y = a + bx) Hệ số tương quan LOD (mol/l) LOQ (mol/l) Sal y = (0,02798 ± 0,03256) + (0,22955 ± 0,00253)x 0,99939 2,5.10-5 2,5.10-5 Met y = (0,08634 ± 0,02139) + (0,20768 ± 0,00166)x 0,99968 7,0.10-5 7,0.10-5 40 mV 27 Tập 12, Số 1, 2018 3.3. Độ lặp lại của phương pháp Tiến hành đo lặp lại 8 lần tại nồng độ 8,5.10-5 M, cả hai chất đều cho độ lặp lại khá tốt. Cụ thể ở nồng độ 8,5.10-5 M, giá trị RSD Sal = 1,61%; RSD Met = 1,29%. Cả hai chất đều có giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD < 3%. Tức là mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình có thể chấp nhận được. Điều đó chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt. 4. Kết luận Đã nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm để xây dựng quy trình phân tích hàm lượng Sal và Met bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc. Các điều kiện thực nghiệm trong quy trình được tóm tắt như sau: Mao quản silica đường kính 50 µm có chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng là 53 cm; phương pháp bơm mẫu theo kiểu xi phông ở độ cao 20 cm; dung dịch đệm điện di chứa 10 mM Arginine được điều chỉnh đến pH = 4,0 bằng dung dịch axit acetic đậm đặc; thời gian bơm mẫu là 30s; thế điện đi là 15 kV. Phương pháp này cho kết quả khoảng tuyến tính tương đối rộng, độ lặp lại tốt, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp. Qua đó cho thấy, quy trình phân tích Salbutamol và Metoprolol bằng phương pháp CE-C4D có thể ứng dụng vào việc phân tích nhanh Salbutamol và Metoprolol trong các mẫu như thức ăn gia súc, thịt lợn ngay tại hiện trường. Do đó, phương pháp này có thể được phát triển như một công cụ hiệu quả để kiểm soát chất lượng thực phẩm, bảo vệ người tiêu dùng, đáp ứng được nhu cầu thực tiễn tại Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Thị Ánh Hường, Nghiên cứu xác định các dạng asen vô cơ trong nước ngầm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, (2010). 2. Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, Phạm Thị Ánh, Chu Phạm Ngọc Sơn, Khảo sát ảnh hưởng của Clenbuterol, Salbutamol trên sự tăng trọng gà, heo và đánh giá sự tồn lưu của chúng trên gà, heo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học,16, trang 39-44, (2011). 3. Phạm Xuân Viết, Tạ Mạnh Hùng, Trần Hoàng, Phùng Thị Vinh, Võ Xuân Minh, Phạm Quốc Bảo, Định lượng salbutamol trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tạp chí Dược học, 11, trang 14-18, (2008). 4. Felix S. Fabiana, Quintino S.M. Maria, Carvalho Z. Alexandre, Coelho H.G. Lúcia, Lago L. do Claudimir, Angnes Lúcio, Determination of salbutamol in syrups by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection (CE-C4D), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40, pp 1288–1292, (2006). 5. Weiyu Wang, Yulian Zhang, Jinyan Wang, Xue Shi, Jiannong Ye (2010), Determination of β agonists in pig feed, pig urine and pig liver using capillary electrophoresis with electrochemical detection, Meat Science, 85, pp 302–305, (2010).