Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế Enzym Acetylcholinesterase In Vitro của một số dược liệu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 235 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƢỢC LIỆU Đỗ Thị Quỳnh Quyên*, Nguyễn Thị Hồng Phúc**, Nguyễn Thị Minh Thuận*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mở đầu: Các chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) thường được sử dụng để điều trị Alzheimer. Nghiên cứu n|y được thực hiện nhằm tìm ra thuốc điều trị Alzheimer tiềm năng với cơ chế ức chế AChE từ dược liệu góp phần ngăn chặn tiến triển của bệnh. Phương pháp: Khảo sát tác dụng ức chế AChE trên in vitro của cao chiết cồn 80% từ 12 dược liệu bằng phương ph{p đo quang Ellman sử dụng cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB trong đĩa 96 giếng ở bước sóng 415nm. Chọn mẫu dược liệu có tác dụng mạnh nhất để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học. Kết quả: Đề tài chọn được cao toàn phần Dừa cạn có tác dụng ức chế 50,26% ở nồng độ 1mg/ml. Khảo sát thành phần hóa thực vật của dừa cạn, từ c{c cao ph}n đoạn thu được 3 ph}n đoạn có hoạt tính ức chế enzym AChE tiềm năng. Kết luận: Những kết quả này là tiền đề cho những nghiên cứu s}u hơn về hướng tác dụng ức chế AChE của dược liệu Dừa cạn. Đồng thời có thể dựa vào quy trình sàng lọc đã được x{c định để tiếp tục thử nghiệm trên các mẫu dược liệu khác nhằm tìm ra dược liệu có tiềm năng cao hơn. Từ khóa: Ức chế enzym acetylcholinesterase, Dừa cạn, in vitro ABSTRACT IN VITRO SCREENING FOR ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITION ACTIVITY FROM SOME MEDICINAL PLANTS Do Thi Quynh Quyen, Nguyen Thi Hong Phuc, Nguyen Thi Minh Thuan, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 235 - 240 Introduction: Acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs) are commonly used for Alzheimer’s treatment. This research aims to find potential agents from medicinal plants helping prevent progressive Alzheimer's disease. Methods: Evaluation of the AChE inhibitory activity of alcoholic 80% extracts of 12 plants was performed in vitro by using Ellman method with acetylthiocholine iodide as substrate and dithiodinitrobenzoic acid as reagent in 96-well plates at 415 nm. The strongest effectively extracts were taken to investigate its chemical compositions. Results: The present study demonstrated that total extract of Catharanthus roseus possessed 50,26% inhibitiory activity at concentration of 1mg/ml. Investigation of the plant composition Catharanthus roseus from total extract obtained 3 fraction extracts having a potential AChEi activity. Conclusion: Results are a prerequisite for further studies toward AChEi activity of Catharanthus roseus. Furthermore, the screening model of AChE inhibitory activity in vitro established could be used for other medicinal plants to find the higher potential AChEi agents. Keyword: Acetylcholinesterase inhibitors, Catharanthus roseus, in vitro *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dƣợc, Đại học Nguyễn Tất Thành Tác giả liên lạc: Võ Thị Bạch Huệ ĐT: 0908420240 Email: vothibachhue@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 236 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của cuộc sống hiện đại thì sa sút trí tuệ - căn bệnh vẫn đƣợc biết đến với c{i tên Alzheimer đ ng trở nên phổ biến. Sinh bệnh học của Alzheimer rất phức tạp liên qu n đến rất nhiều yếu tố nhƣ myloid bet Aβ (5), protein tau(9), viêm thần kinh(11), sự tổn thƣơng củ c{c syn p cũng nhƣ c{c tế bào thần kinh(3) < Vì thế việc sử dụng các loại thuốc cổ truyền với nhiều mục tiêu có lẽ sẽ có ƣu thế hơn so với việc sử dụng một loại thuốc điều trị một triệu chứng bệnh lý. Acetylcholin (ACh) có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thần kinh, nó là chất dẫn truyền thần kinh tại khe synap và nồng độ ACh đƣợc duy trì ổn định bởi enzym acetylcholinesterase (AChE), một enzym có chức năng l|m ngƣng lại các hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh ACh thông qua việc thủy phân ACh tạo thành cholin và acid acetic. Ở các bệnh nhân Alzheimer, nồng độ ACh bị suy giảm đ{ng kể(1). Do vậy, các thuốc ức chế AChE đóng v i trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự tiến triển của bệnh Alzheimer. Các thuốc ức chế cholinesterase trên thị trƣờng hiện n y đ số là thuốc t}n dƣợc nhƣng gi{ th|nh thuốc tƣơng đối cao và có những tác dụng phụ không mong muốn. Nhu cầu nghiên cứu phát triển các thuốc mới có nguồn gốc từ dƣợc liệu để hỗ trợ v| điều trị Alzheimer l| điều cần thiết. Vì vậy nghiên cứu n|y đƣợc tiến hành nhằm tìm r ph}n đoạn chiết tiềm năng từ dƣợc liệu góp phần ngăn chặn tiến triển chứng suy giảm trí nhớ cũng nhƣ bệnh Alzheimer. NGUYÊN LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 12 dƣợc liệu đƣợc lựa chọn từ kinh nghiệm dân gian, từ các tài liệu tổng quan về c{c dƣợc liệu và hoạt chất có tác dụng ức chế AChE đã đƣợc sàng lọc tại nhiều nƣớc trên thế giới(4,7,10). C{c dƣợc liệu n|y đƣợc thu thập tại TpHCM và các tỉnh miền Trung Việt Nam theo danh sách trong bảng 1. ảng : Danh mục c{c dược liệu được tiến hành khảo s{t sơ bộ tác dụng ức chế AChE TT Tên dược liệu Tên khoa học Họ Bộ phận dùng Cỏ sữa Euphorbia thymifolia Euphorbiaceae Toàn cây Cỏ cứt lợn Ageratum conyzoides Asteraceae Toàn cây trên mặt đất Đan sâm Salvia miltiorrhiza Lamiaceae Rễ củ Dừa cạn Cantharanthus roseus Apocynaceae Toàn cây Gùi Willughbeia cochinchinensis Apocynaceae Dây Khương hoạt Notopterygium incisum Apiaceae Thân rễ Mần trầu Eleusine indica Poaceae Toàn cây Muồng hòe Cassia surattensis Fabaceae Lá Riềng Alpinia officinarum Zingiberaceae Thân rễ Tri mẫu Anemarrhena asphodeloides Liliaceae Thân rễ Trinh nữ Mimosa pudica Fabaceae Toàn cây Xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum Rutaceae Vỏ quả Nguyên liệu đƣợc định danh dựa vào hình ảnh, tài liệu tham khảo để tránh nhầm lẫn. Hóa chất AChE loại C3389 (Sigma-Aldrich), Acetylthiocholin iodid (ATCI) (Sigma-Aldrich), Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) (Sigma-Aldrich). Các dung môi n-hexan, chloroform, ethyl cet t EtOAc đạt tinh khiết phân tích. Phƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE các mẫu dược liệu in vitro Chuẩn bị mẫu: 30g dƣợc liệu khô sau khi xay nhỏ thành bột đƣợc rây qua rây 2mm và tiến hành chiết nóng với dung môi là cồn 80%. Dịch chiết thu đƣợc cô loại dung m i thu đƣợc cao toàn phần mẫu thử. Pha cao mẫu thử trong DMSO 10% ở nồng độ 1mg/ml. Đ{nh gi{ t{c dụng ức chế enzym AChE của mẫu dƣợc liệu bằng phƣơng ph{p đo qu ng in vitro dựa trên nguyên tắc củ phƣơng ph{p Ellman(2): Cơ chất ATCI bị thủy phân bởi enzym AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid DTNB tạo thành hợp chất Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 237 acid 5-thio-2-nitro benzoic có m|u v|ng Cƣờng độ màu của chất này tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym AChE. Dự v|o độ hấp thu của mẫu thử đƣợc x{c định ở bƣớc sóng 415nm để đ{nh gi{ khả năng ức chế hoạt tính enzym AChE của dƣợc liệu. Hoạt tính ức chế AChE in vitro của mẫu thử đƣợc x{c định bằng giá trị phần trăm hoạt tính enzym bị ức chế I% v| đƣợc x{c định theo công thức: I% = (1 – AbsT/AbsC) x 100 (CT1) Trong đó: I%: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế. AbsT và AbsC lần lƣợt l| độ hấp thu của mẫu thử và mẫu chứng. Mỗi mẫu thử đƣợc thực hiện lặp lại 3 lần, mỗi lần làm trên 3 giếng. Thành phần hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày ở bảng 2. ảng : Thành phần hỗn hợp phản ứng đo quang in vitro STT Thành phần Mẫu thử (µl) Mẫu trắng thử (µl) Mẫu đối chứng (µl) Mẫu trắng chứng (µl) 1 Đệm phosphat pH 8 80 100 80 100 2 Mẫu thử 20 20 0 0 3 DMSO 10% 0 0 20 20 4 Enzym AChE 0,25U/ml 20 0 20 0 5 ACTI 2,4mM 40 40 40 40 6 DTNB 2,4mM 40 40 40 40 Tổng thể tích (µl) 200 200 200 200 Quy trình thử nghiệm đƣợc tóm tắt theo sơ đồ ở hình 1. Để có cơ sở đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, berberin clorid đƣợc lựa chọn làm mẫu đối chứng dƣơng Hợp chất n|y đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh sở hữu hoạt tính ức chế AChE in vitro khá mạnh. Thực tế, berberin clorid cũng đã đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng trong một số nghiên cứu(6,8). ình : Sơ đồ quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế AChE in vitro Từ kết quả sàng lọc trên, chọn mẫu dƣợc liệu có tác dụng cao nhất để tiếp tục khảo sát hóa học và sàng lọc c{c ph}n đoạn nhỏ có tác dụng dƣợc lý mạnh nhất trong dƣợc liệu này. Khảo sát thành phần hóa thực vật của mẫu dƣợc liệu theo định hƣớng tác dụng ức chế enzym AChE in vitro Chiết xuất và phân lập Dƣợc liệu đƣợc chiết ngấm kiệt với cồn 80% (tỷ lệ dƣợc liệu và dung môi là 1: 15). Sau khi cô quay thu hồi thu đƣợc cao toàn phần. Từ cao toàn phần, lắc phân bố với các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi (n-hexan, chloroform, ethyl cet t để phân tách thành c{c ph}n đoạn có độ phân cực khác nhau. Theo dõi qu{ trình t{ch ph}n đoạn bằng sắc ký lớp mỏng S u đó, ph{t hiện các vết bằng phƣơng ph{p soi UV ở bƣớc sóng 254nm, 365nm và bằng thuốc thử vanillin – sulfuric (VS). Sau khi, loại dung m i thu đƣợc các ph}n đoạn đơn giản. Từ c{c ph}n đoạn này, tiến hành phân lập bằng phƣơng ph{p sắc ký cột ch}n kh ng để t{ch th|nh c{c ph}n đoạn nhỏ hơn Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn đã phân lập được Tiến hành khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE củ c{c ph}n đoạn thu đƣợc từ phƣơng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 238 pháp sắc ký cột ch}n kh ng theo quy trình nhƣ đối với các mẫu c o dƣợc liệu để chọn ra phân đoạn có tác dụng cao nhất. KẾT QUẢ Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE của 12 dược liệu nghiên cứu STT Tên dược liệu % ức chế Cỏ sữa - Cỏ cứt lợn 9,23 Dừa cạn 50,26 Đan sâm - Gùi 8,54 Khương hoạt - Mần trầu 2,91 Muồng hòe 3,67 Riềng - Tri mẫu - Trinh nữ - Xuyên tiêu - * Ghi chú: (-) không có tác dụng hoặc tác dụng không rõ ràng Nhận xét: Kết quả ở bảng 3 cho thấy trong 12 mẫu dƣợc liệu khảo sát chỉ có 5 mẫu dƣợc liệu có khả năng enzym ức chế AchE, 7 mẫu dƣợc liệu không có tác dụng hoặc tác dụng không rõ ràng. Trong 5 mẫu dƣợc liệu có tác dụng trên in vitro, Dừa cạn có tác dụng kháng enzym AChE rõ rệt (50,26%) so với các mẫu còn lại. Vì thế, Dừa cạn đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát hóa học và phân lập ph}n đoạn nhỏ có tác dụng mạnh nhất trong dƣợc liệu này. Khảo sát thành phần hóa thực vật của cây Dừa cạn theo định hƣớng tác dụng ức chế enzym AChE Chiết xuất và tách phân đoạn Theo kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật dƣợc liệu Dừa cạn nhận thấy mẫu dịch chiết cồn 80% có alkaloid là thành phần nổi bật. Vì thế, khi chiết xuất và phân lập sẽ tập trung vào thành phần alkaloid củ dƣợc liệu. Quy trình chiết xuất và xử lý sơ bộ cao alkaloid toàn phần từ dƣợc liệu Dừa cạn đƣợc trình theo sơ đồ trong hình 2 và hình 3. ình : Quy trình chiết xuất cao alkaloid toàn phần từ dược liệu Dừa cạn ình : Quy trình xử lý sơ bộ cao alkaloid toàn phần Dựa vào sắc ký lớp mỏng và khối lƣợng các c o thu đƣợc, chọn cao n-hexan 2 và cao EtOAc 2 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 239 để tiến hành sắc ký cột chân không. UV 365 UV 245 Thuốc thử VS Thuốc thử Dragendorff ình 4: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra c{c cao ph}n đoạn Kết quả: Từ cao n-hex n 2 thu đƣợc 8 phân đoạn nhỏ đƣợc kí hiệu từ H1 – H8. Từ cao EtOAc 2 thu đƣợc 18 ph}n đoạn nhỏ kí hiệu từ E1 – E18. Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn đã phân lập được Áp dụng phƣơng ph{p đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE in vitro đã đƣợc x{c định để khảo sát tác dụng củ c{c ph}n đoạn phân lập đƣợc từ hai cột sắc ký trên. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4 và bảng 5. ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AChE của c{c ph}n đoạn cột cao n-hexan 2 Phân đoạn (1mg/ml) H1 H2 H3 H4 % ức chế 4,97 13,15 6,31 -7,26 Phân đoạn (1mg/ml) H5 H6 H7 H8 % ức chế 30,22 17,20 16,74 29,90 ảng : Kết quả đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AchE của c{c ph}n đoạn cột cao EtOAc 2 Phân đoạn (1mg/ml) E1 E2 E3 E4 E5 E6 % ức chế -6,47 13,54 25,61 13,10 18,99 16,93 Phân đoạn (1mg/ml) E7 E8 E9 E10 E11 E12 % ức chế 23,98 19,27 25,70 16,46 22,69 35,65 Phân đoạn (1mg/ml) E13 E14 E15 E16 E17 E18 % ức chế 40,24 67,26 61,97 68,45 78,79 37,16 Nhận xét: Ở nồng độ 1mg/ml, c{c ph}n đoạn của cao EtOAc 2 cho kết quả ức chế enzym tốt hơn so với c{c ph}n đoạn của cao n-hexan 2. Nhƣ vậy c{c ph}n đoạn có độ phân cực trung bình đến mạnh sẽ có tác dụng dƣợc lý tốt hơn c{c ph}n đoạn kém phân cực. Trong đó, ph}n đoạn E17 có kết quả ức chế enzym ở mức khá c o 78,79% , c{c ph}n đoạn E14 v| E16 cũng cho kết quả ở mức tƣơng đối (67,26 và 68,45%). Có h i ph}n đoạn cho kết quả âm có thể là vì dung môi không thể hòa tan hoàn toàn mẫu làm cho dung dịch phản ứng bị đục và dẫn tới sai lệch kết quả. BÀN LUẬN Khảo sát tác dụng ức chế AChE trên in vitro của cao chiết cồn 80% từ 12 dƣợc liệu bằng phƣơng pháp đo quang Ellman sử dụng cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB trong đĩa 96 giếng ở bƣớc sóng 415nm. Chọn mẫu dƣợc liệu có tác dụng mạnh nhất để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học. Đề tài này đã định hƣớng để tiếp tục khảo sát sâu hơn về cây Dừa Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 240 cạn- là dƣợc liệu đã từ lâu đƣợc biết với các alkaloid (vincristin; vinblastin) trị ung thƣ vú KẾT LUẬN Từ 12 dƣợc liệu sàng lọc đã chọn đƣợc Dừa cạn có tác dụng ức chế AChE. Phân tích thành phần hóa học Dừa cạn thu đƣợc 3 ph}n đoạn của cao EtOAc 2 cho tác dụng ức chế AChE tốt là E14, E16 v| E17 Trong tƣơng l i có thể tiến hành nghiên cứu s}u hơn trên dƣợc liệu Dừa cạn và có thể áp dụng quy trình sàng lọc đã x{c định để tìm ra một dƣợc liệu mới có tiềm năng ức chế AChE tốt hơn TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Auld DS, Kornecook TJ, Bastianetto S, Quirion R (2002). Alzheimer’s dise se nd the b s l forebr in cholinergic system: rel tions to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in neurobiology, 68(3):209-245. 2. Ellman GL, Courtney KD, Andres V, Featherstone RM (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical pharmacology, 7(2):88IN191-9095. 3. Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK (1999). The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s dise se: review of progress. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66(2):137-147. 4. Gholamhoseinian A, Moradi M, Sharifi-Far F (2009). Screening the methanol extracts of some Iranian plants for acetylcholinesterase inhibitory activity. Research in pharmaceutical sciences, 4(2):105. 5. Hardy J, Allsop D (1991). Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in pharmacological sciences, 12:383-388. 6. Hoàng Việt Dũng Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của hai loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. Thomsonii và Piper hymenophyllum Miq., họ hồ tiêu Piper ce e , Đại học Dƣợc Hà Nội; 2014. 7. Houghton PJ, Ren Y, Howes M-J (2006). Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi. Natural Product Reports, 23(2):181-199. 8. Min BS, Cuong TD, Lee J-S, Shin B-S, Woo MH, Hung TM (2010). Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus buds. Archives of pharmacal research, 33(10):1665-1670. 9. Mudher A, Lovestone S (2002). Alzheimer's disease–do tauists and baptists finally shake hands?. Trends in neurosciences, 25(1):22-26. 10. Mukherjee PK, Kumar V, Mal M, Houghton PJ (2007). Acetylcholinesterase inhibitors from plants. Phytomedicine, 14(4):289-300. 11. Shen Z (2004). Brain cholinesterases: II. The molecular and cellular basis of Alzheimer's disease. Medical hypotheses, 63(2):308-321. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018