Nghiên cứu sự đa hình vùng D-Loop của giống chó h’mông cộc đuôi ứng dụng trong công tác chọn giống

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 11 NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH VÙNG D-LOOP CỦA GIỐNG CHÓ H’MÔNG CỘC ĐUÔI ỨNG DỤNG TRONG CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG BÙI XUÂN PHƯƠNG (1), PHẠM THANH HẢI (1), ĐINH THẾ DŨNG (1), HỒ THỊ LOAN (2), ĐẶNG TẤT THẾ (2) 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Chó nhà là một trong những động vật được con người thuần hóa từ rất sớm. Trải qua quá trình chọn lọc tự nhiên cũng như chọn lọc nhân tạo đã hình thành các giống chó khác nhau về hình thái, mầu sắc, tầm vóc Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga trong giai đoạn từ 2006 - 2010 đã xác định 13 dạng chó khác nhau, trong đó có giống chó H’mông cộc đuôi [2]. Các giống chó có vai trò khác nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng của con người. Kết quả huấn luyện ban đầu cho thấy giống chó H’mông cộc đuôi là một trong những giống chó bản địa Việt Nam có thể sử dụng làm chó nghiệp vụ [1]. Tuy nhiên với cách thức chăn nuôi đơn lẻ cùng với việc chưa có hệ thống quản lý nhân giống riêng, các giống chó bản địa Việt Nam không tránh được sự pha tạp các nguồn gen từ những giống chó ngoại nhập cũng như sự pha lẫn nguồn gen giữa các giống chó bản địa. Do đó cần có biện pháp khôi phục, bảo tồn nguồn gen các giống chó bản địa Việt Nam. Ty thể là một bào quan cung cấp năng lượng cho tế bào ở động vật có xương sống. Cùng với hệ gen của nhân thì ty thể có hệ gen độc lập với kích thước chiều dài từ 15 - 20 kilobases (kb) bao gồm 37 gen, trong đó 13 gen mã hóa protein, 2 rRNA, 22 gen vận chuyển tRNA [9]. Hệ gen ty thể của động vật có xương sống được coi là một trong những công cụ phổ biến để nghiên cứu mối quan hệ, nguồn gốc loài khác nhau với những đặc điểm riêng biệt của chúng bao gồm sự di truyền theo dòng mẹ [3, 6], không có sự tái tổ hợp và tốc độ tiến hóa nhanh [7]. Vùng điều khiển (D-loop) của hệ gen ty thể là vùng không mã hóa nhưng nó kiểm soát quá trình sao chép và là vùng biển đổi nhiều nhất trong hệ gen ty thể [4], vùng này có ý nghĩa trong việc nghiên cứu nguồn gốc phát sinh, quan hệ di truyền giữa các loài [10]. Việc ứng dụng ADN ty thể vào việc nghiên cứu di truyền quần thể và quan hệ phát sinh chủng loại chó bản địa trên thế giới đã thu được nhiều kết quả tích cực trong những năm gần đây. Nhóm tác giả Godinho R., Llaneza L., Blanco J.C., Lopes S., Álvares F., García E.J., Palacios V., Cortés Y., Talegón J., Ferrand N. đã sử dụng kết hợp giữa nghiên cứu về ADN ty thể với phương pháp nghiên cứu trên nhiễm sắc thể giới tính Y và nghiên cứu về microsatellite để phân tích di truyền quần thể trong quá trình lai tạo chó bản địa với chó sói hoang dại tại vùng bán đảo Iberian. Trong nghiên cứu trên, nhóm tác giả đã sử dụng kết hợp 42 microsatellite của nhiễm sắc thể thường với các microsatellite đột biến trên nhiễm sắc thể giới tính Y và trình tự ADN ty thể để xác định sự xuất hiện và biến động quần thể chó lai. Nghiên cứu đã sử dụng song song việc phân tích Bayesian và các bộ nghiên cứu mô phỏng để đánh giá sự khác biệt giữa chó bản địa và chó sói, tần số và phân bố lai tạo, lai có định hướng. Nghiên cứu thu được ba kết quả quan trọng: Không có sự khác biệt về di truyền giữa chó bản địa và chó sói hoang; giới hạn sinh sản và mở rộng phân bố của chó sói; bằng chứng về sự biến động trong quần thể lai được tạo ra bởi quá trình lai giữa chó bản địa đực và sói cái [5]. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 12 Ở Việt Nam hiện nay, việc ứng dụng công nghệ gen trong công các nghiên cứu các giống chó bản địa đang được nhóm tác giả Trần Hoàng Dũng, Trương Nguyễn Thị Như Mai, Trần Ngọc Trình, Huỳnh Văn Hiếu, Thái Kế Quân, Chung Anh Dũng đang thực hiện từ năm 2014 nhưng chỉ là nghiên cứu bước đầu về định dạng haplotype và truy tìm nguồn gốc chó Phú Quốc bằng trình tự vùng D-loop trong genome ty thể. Nhằm phục hồi sự đa dạng về nguồn gen, định hướng cho quá trình nhân giống bảo tồn nguồn gen giống chó bản địa H’mông cộc đuôi, nhóm tác giả tiến hành nghiên cứu sự đa hình vùng D-loop của giống chó H’mông cộc đuôi nhằm ứng dụng trong công tác chọn lọc và nhân giống. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Lựa chọn và thu mẫu Thu mẫu mô tai của 120 cá thể chó bản địa H’mông cộc đuôi tại Hà Giang và Lào Cai được lựa chọn theo kiểu hình, đảm bảo phù hợp với bản tiêu chuẩn giống và được loại bỏ các yếu tố quan hệ huyết thống thông qua phỏng vấn điều tra. Trong đó, bao gồm 60 cá thể đực, được kí hiệu từ HC01 - HC60 và 60 cá thể cái được kí hiệu từ HC61 - HC120. Mẫu được thu bằng dụng cụ chuyên biệt tại vị trí tai của chó với kích thước mẫu khoảng 3mm x 3mm và được bảo quản trong môi trường cồn 90o. Tách chiết và nhân bản DNA DNA tổng số được tách chiết sử dụng kit DNA của hãng Qiagen (Đức). Nhân tổng số khoảng 600 bp đầu thuộc vùng D-loop vì đây là phần xảy ra biến đổi nhiều nhất bằng kỹ thuật PCR, sử dụng hỗn hợp PCR Taq Mastermix (Qiagen) với cặp mồi (primer) có mã hiệu và trình tự: CaF30: 5' - ACAGCCGACACATCCTCAGCC - 3' CaR30: 5' - CGAAGAATCGGGTGAGCGTGGC - 3' Với chu trình nhiệt theo các bước: Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian (s) Số chu kì Biến tính ban đầu 95 120 1 Biến tính 95 25 35 Bắt cặp mồi 56 25 Kéo dài 72 40 Hoàn thiện 72 300 1 Giữ mẫu 4 Đến khi lấy mẫu Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Qiagen. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 13 Giải trình tự Giải trình tự sản phẩm PCR sử dụng bộ hóa chất BigDye terminator cycle sequence kit v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) và máy đọc trình tự ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer. Xử lý số liệu So sánh, sắp xếp, phân tích các trình tự DNA giải mã được bằng phần mềm BioEdit 7.0.0 và DnaSP. Xác định khoảng cách di truyền trên phần mềm MEGA 6.0.5 (Tamura et al., 2013) [8]. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhân đoạn DNA vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR Để có đủ số lượng DNA phục vụ công tác nghiên cứu đã tiến hành nhân đoạn D-loop bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi CaF30 và CaR30, cặp mồi được thiết kế đặc hiệu dựa trên kết quả khảo sát hơn 2.000 trình tự D-loop loài chó nhà (Canis familiaris) trên ngân hàng gen và được kiểm tra trên phần mềm Primer - Blast Tool uses Primer 3 và thực nghiệm. Theo lý thuyết sản phẩm thu được sau khi nhân bản bằng cặp mồi trên có chiều dài khoảng 600 bp. Sau khi nhân bản tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR và chạy điện di kiểm tra trên gel agrose 1%. Một số kết quả được trình bày ở hình 1. Hình 1. Kết quả điện di nhân đoạn DNA vùng D-loop Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR thu được là đặc hiệu có độ dài ~600 bp phù hợp với lý thuyết khi thiết kế cặp mồi. Sản phẩm PCR không xuất hiện vạch phụ, không bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, thông qua sản phẩm PCR không xác định được đặc điểm đa hình của D-loop, bởi vậy cần tiến hành giải trình tự vùng D-loop bằng kỹ thuật và máy đọc trình tự ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer. Xác định trình tự và đặc điểm đa hình đoạn D-loop Sau khi sử dụng bộ hóa chất BigDye terminator cycle sequence kit v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) và máy đọc trình tự ABI 3100 - Avant Genetic Analyzer. Để giải trình tự sản phẩm PCR vùng D-loop, cùng với việc sử dụng phần mềm BioEdit 7.0.0 và DnaSP sắp xếp, so sánh và phân loại 120 trình tự từ 120 mẫu xác định 10 điểm đa hình và tạo thành 8 kiểu đa hình tức 8 kiểu Haplotype kí hiệu từ Hap1 đến Hap8. Kết quả được trình bày ở bảng 1 và bảng 2. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 14 Bảng 1. Các kiểu đa hình vùng D-loop giống chó H'mông cộc đuôi Điểm đa hình (SNP) Kiểu đa hình 74 89 92 94 112 114 127 421 487 495 Hap1 T G T C T G T C C A Hap2 - A C - - A - - T - Hap3 - - C - - - - T - G Hap4 - - C T - - - - - - Hap5 C - C - - A - - T - Hap6 - - C - C - - T - - Hap7 - - C - - A C - T - Hap8 - - C T - - - - - - Bảng 1 cho thấy, nếu lấy Hap1 làm chuẩn, xác định được 10 điểm đa hình được xác định tại vị trí nucleotide 74, 89, 92, 94, 112, 114, 127, 421, 487, 495. Các điểm đa hình chỉ là biến đổi đồng hoán các nucleotide bị thay thế không có điểm nào thêm hoặc bớt nucleotide, trong đó có 10 điểm thay thế từ T-C (1 điểm T72C, 7 điểm T92C, 1 điểm T112C và 1 điểm T127C); 4 điểm G-A (1 điểm G89A, 3 điểm G94A); 7 điểm C-T (2 điểm C94T, 2 điểm C421T và 3 điểm C487T); 1 điểm A-G (A495G). Bảng 2. Tỷ lệ các kiểu đa hình vùng D-loop của giống chó H’mông cộc đuôi STT Kiểu Hap Số mẫu Tỷ lệ (%) 1 Hap1 25 20,83 2 Hap2 15 12,50 3 Hap3 17 14,17 4 Hap4 12 10,00 5 Hap5 10 8,33 6 Hap6 16 13,33 7 Hap7 13 10,83 8 Hap8 12 10,00 Tổng 120 100 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 15 Qua bảng 2 có thể thấy các kiểu đa hình xuất hiện với tỷ lệ khác nhau. Kiểu đa hình Hap1 chiểm tỷ lệ cao nhất đạt 20,83%, kiểu đa hình Hap5 thấp nhất với tỷ lệ 8,33%. Các kiểu đa hình Hap8, Hap4, Hap7, Hap6, Hap2, Hap3 có tỷ lệ lần lượt là: 10%, 10,83%, 12,50%, 13,33% và 14,17%. Như vậy vùng D-loop của giống chó H’mông cộc đuôi có sự thay đổi và đa dạng về các kiểu đa hình. Khoảng cách di truyền và ứng dụng trong chọn lọc nhân giống Theo kết quả điều tra khảo sát của Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga, các giống chó bản địa Việt Nam chủ yếu được nuôi thả tự do, đơn lẻ trong các hộ gia đình, việc quản lý, nhân giống tự phát [9], do đó không chỉ nguồn gen của giống chó H’mông cộc đuôi mà của các giống chó bản địa khác có khả năng bị pha tạp. Bởi vậy, để nâng cao hiệu quả chọn lọc cũng như phục hồi nguồn gen vốn có của giống chó H’mông cộc đuôi đã tiến hành xác định khoảng cách di truyền bằng phần mềm MEGA 6.0.6 dựa trên kết quả phân tích đặc điểm đa hình đoạn D-loop. Kết quả được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Khoảng cách di truyền giữa các haplotype Hap1 Hap2 Hap3 Hap4 Hap5 Hap6 Hap7 Hap8 Hap1 Hap2 0,007 Hap3 0,005 0,009 Hap4 0,004 0,007 0,005 Hap5 0,007 0,004 0,009 0,007 Hap6 0,005 0,009 0,004 0,005 0,009 Hap7 0,007 0,004 0,009 0,007 0,004 0,009 Hap8 0,002 0,005 0,004 0,002 0,005 0,004 0,005 Bảng 3 cho thấy khoảng cách di truyền cao nhất đạt 0,009 (Hap3-Hap2; Hap3- Hap5; Hap6-Hap2; Hap6-Hap5; Hap3-Hap7; Hap7-Hap6) và khoảng các di truyền thấp nhất là 0,002 (Hap8-Hap1 và Hap8-Hap4). Các kiểu đa hình khác có khoảng cách di truyền từ 0,004 đến 0,007. Từ kết quả nghiên cứu khoảng cách di truyền đã xác định được các cặp bố mẹ và cách ghép đôi, tuy nhiên việc chọn lọc các cá thể bố mẹ còn phụ thuộc vào đặc điểm hình thái, hành vi và các dạng thần kinh nhằm khai thác huấn luyện sau này. Kết quả chọn lọc ghép đôi được trình bày ở bảng 4. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 16 Bảng 4. Cách ghép đôi giữa các cá thể đực - cái SST Đực Cái KCDT STT Đực Cái KCDT STT Đực Cái KCDT 1 HC31 HC113 0.009 28 HC43 HC73 0.009 55 HC5 HC81 0.009 2 HC37 HC113 0.009 29 HC45 HC73 0.009 56 HC54 HC81 0.009 3 HC39 HC113 0.009 30 HC47 HC73 0.009 57 HC7 HC81 0.009 4 HC1 HC117 0.009 31 HC5 HC73 0.009 58 HC31 HC82 0.009 5 HC12 HC117 0.009 32 HC54 HC73 0.009 59 HC37 HC82 0.009 6 HC19 HC117 0.009 33 HC7 HC73 0.009 60 HC39 HC82 0.009 7 HC23 HC117 0.009 34 HC1 HC79 0.009 61 HC1 HC87 0.009 8 HC3 HC117 0.009 35 HC12 HC79 0.009 62 HC12 HC87 0.009 9 HC40 HC117 0.009 36 HC19 HC79 0.009 63 HC19 HC87 0.009 10 HC43 HC117 0.009 37 HC23 HC79 0.009 64 HC23 HC87 0.009 11 HC45 HC117 0.009 38 HC3 HC79 0.009 65 HC3 HC87 0.009 12 HC47 HC117 0.009 39 HC40 HC79 0.009 66 HC40 HC87 0.009 13 HC5 HC117 0.009 40 HC43 HC79 0.009 67 HC43 HC87 0.009 14 HC54 HC117 0.009 41 HC45 HC79 0.009 68 HC45 HC87 0.009 15 HC7 HC117 0.009 42 HC47 HC79 0.009 69 HC47 HC87 0.009 16 HC31 HC61 0.009 43 HC5 HC79 0.009 70 HC5 HC87 0.009 17 HC37 HC61 0.009 44 HC54 HC79 0.009 71 HC54 HC87 0.009 18 HC39 HC61 0.009 45 HC7 HC79 0.009 72 HC7 HC87 0.009 19 HC31 HC65 0.009 46 HC1 HC81 0.009 73 HC31 HC87 0.009 20 HC37 HC65 0.009 47 HC12 HC81 0.009 74 HC37 HC87 0.009 21 HC39 HC65 0.009 48 HC19 HC81 0.009 75 HC39 HC87 0.009 22 HC1 HC73 0.009 49 HC23 HC81 0.009 76 HC31 HC97 0.009 23 HC12 HC73 0.009 50 HC3 HC81 0.009 77 HC37 HC97 0.009 24 HC19 HC73 0.009 51 HC40 HC81 0.009 78 HC39 HC97 0.009 25 HC23 HC73 0.009 52 HC43 HC81 0.009 79 HC31 HC98 0.009 26 HC3 HC73 0.009 53 HC45 HC81 0.009 80 HC37 HC98 0.009 27 HC40 HC73 0.009 54 HC47 HC81 0.009 81 HC39 HC98 0.009 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 17 Qua bảng 4 có thể thấy rằng khoảng cách di truyền của các cá thể cao nhất là 0,009, đảm bảo cho việc nhân giống tạo đàn con có tính đa dạng, nâng cao hiệu quả chọn lọc. Kết quả cũng chỉ ra có 81 phép ghép đôi nhân giống từ 14 cá thể đực được kí hiêu: HC1, HC3, HC5, HC7, HC19, HC23, HC31, HC37, HC39, HC40, HC43, HC45, HC47, HC54 và 11 cá thể cái được kí hiệu: HC113, HC117, HC61, HC65, HC73, HC79, HC81, HC82, HC87, HC97, HC98. 4. KẾT LUẬN - Sử dụng cặp mồi CaF30 và CaR30 nhân bản thành công đoạn DNA thuộc vùng D-loop của giống chó H’mông cộc đuôi với độ dài 600 bp đảm bảo cho nghiên cứu tiếp theo và phù hợp với các kết quả khác đã công bố. - Trình tự vùng D-loop của giống chó H’mông cộc đuôi có 8 kiểu đa hình tại 10 vị trí bao gồm: 74, 89, 92, 94, 112, 114, 127, 421, 487, 495. Các điểm đa hình là đồng hoán với sự thay thế các nucleotide 10 điểm T-C, 4 điểm G-A, 7 điểm C-T và 1 điểm A-G. - Với các cá thể được lựa chọn, khoảng cách di truyền của các kiểu đa hình cao nhất là 0,009; thấp nhất là 0,002 và từ đây có thể xây dựng các cách ghép đôi để tạo ra thế hệ sau có tính đa dạng di truyền cao nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Hữu Côi, Bùi Xuân Phương, Đinh Thế Dũng, Nguyễn Tiến Tùng, Khả năng huấn luyện chó nghiệp vụ giống H’mông cộc đuôi và chó dạng sói, Tạp chí KHKT chăn nuôi, 2011, 2(143):27-31. 2. Bùi Xuân Phương, Đinh Thế Dũng, Trần Hữu Côi, Thành phần khu hệ chó nhà tại một số tỉnh phía bắc và bắc Trung bộ Việt Nam, Tuyển tập BCKH về Sinh thái nhiệt đới, Nxb. Nông nghiệp, 2010, tr.157-163. 3. Avise J.C., Arnold J. and Ball R.M. Jr., Intraspecific phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics, Ann. Rev. Syst. Ecol., 1987, 18:489-522. 4. Clayton D.A., Replication and transcription of vertebrate mitochondrial DNA, Annu. Rev. Cell Biol., 1991, 7:453-478. 5. Godinho R., Llaneza L., Blanco J.C., Lopes S., Álvares F., García E.J., Palacios V., Cortés Y., Talegón J., Ferrand N., Genetic evidence for multiple events of hybridization between wolves ADN domestic dogs in the Iberian Peninsula, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos, Universidade do Porto, Campus Agrário de Vairão, 4485-661 Vairão, Portugal. rgodinho@mail.icav.up.pt, 2011 Dec; 20(24):5154-66, doi: 10.1111/j.1365-294X.2011.05345.x. Epub 2011 Nov 9. 6. Gyllensten U., Wharton D., Josefsson A. and Wilson A.C., Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice, Nature, 1991, 352:255-257. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 18 7. Stoneking M., Hedgecock D., Higuchi R.G., Vigilante L. and Erlich H.A., Population variation of hum an mtDNA control region sequences detected by enzymatic amplification and sequence-specific oligonucleotide probes, Ann. J. Hum. Genet., 1991, 48:370-382. 8. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S., MEGA6.0.5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 6.0.5, 2013. 9. Wallace D.C., Mitochondrial genes and disease, Hosp, Pract., 1986, 21:77-92. 10. Wilson A.C., Cann R.L., Carr S.M., George M., Gyllensten U.B., Helm- Bychowski K.M., Higuchi R.J., Palumbi S.R., Prager E.M., Sage R.D. and Stoneking M., Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics, J. Biol., 1985, 26:375-400. SUMMARY A STUDY ON D-LOOP REGION POLYMORPHISM OF H’MONG SHORT TAIL DOG BREED APPLIED IN DOG BREEDING The study was carried out on 120 tissue samples from domestic H’mong dogs with short tail, including 60 samples from males and 60 samples from the females. The study results showed that the D-loop region of the H’mong short tail dog breed is polymorphic. The sequence of the D-loop region of these dogs has 8 polymorphic variants in 10 locations, including: 74, 89, 92, 94, 112, 114, 127, 421, 487, 495. The polymorphisms are transition with nucleotide substitutions 10 points TC, 4 points GA, 7 points CT and 1 point AG. The highest and the lowest genetic distance of the polymorphic variant is 0.009 and 0.002 respectively and it is able to build the pairing scheme to create the next generation with the highest genetic diversity. Từ khóa: Dogs Vietnamese indigenous dog, Breed of dogs H’mong with short tails. D-loop gene. Nhận bài ngày 22 tháng 6 năm 2015 Hoàn thiện ngày 3 tháng 10 năm 2015 (1) Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga. (2) Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật