Nghiên cứu sử dụng cây dầu giun làm thuốc bảo vệ thực vật

n hành nghiên cứu gieo trồng ở những vùng đồi núim vùng đất khó canh tác và trồng trọt những loại cây nông nghiệp khác thành những vùng trồng DG tập trung để tạo được nguồn cung cấp ổn định để sản xuất thuốc BVTV từ cây dầu giun. C10H16O2 . M = 162,22 Hình 1.2.1. Công thức cấu tạo của Ascaridol Ascaridol (ascarisin) (1,4 peroxydo - P.Menthen -2) là chất lỏng (không bền vững) nhất và có mùi vị khó chịu. Điểm đông đặc: 50, điểm sôi 750/1,5 mg H9D2525 1,0061, ND25: 1,4718. Ascaridol bị phân huỷ, gây nổ ở nhiệt độ 130 - 1500 hoặc với tác dụng của acid vô cơ. Ascaridol hoà tan trong hexan, ethanol, toluen, benzen. Thành phần của TD thay đổi tuỳ theo chủng loại TV và một số điều kiện khác. Thông thường cây Dầu giun có hàm lượng tinh dầu là 0,3 - 0,4% (so với NL tươi) cao nhất ở hạt (0,65 - 1%), lá (0,35%) rồi đến cành. 1.2.2. Bảo quản tinh dầu giun: Hiện nay với phương tiện và điều kiện bảo quản của ta còn gặp nhiều khó khăn thiếu thốn; nhưng để bảo quản tinh dầu giun được tốt, cần phải chú trọng những điểm chính sau: - TGD sau khi được cất xong cần cho vào chai màu (hoặc chai trắng cũng được) có đựng sẵn natri sulfat khan, ngâm trong 2 hay 3 ngày để lọc cho kiệt nước, lấy tinh dầu ra bảo quản riêng, Không nên ngâm natri sulfat khan trong tinh dầu quá lâu, ảnh hưởng tới nồng độ và tính chất của ascaridol. - Bảo quản vào chai lọ màu (hoặc trắng) nút chặt bằng nút lie hoặc nút bấc có bọc giấy bóng hay giấy thiếc, ngoài gắn xi sáp, bọc giấy đen quanh chai lọ và để vào chỗ tối, mát. - TGD bảo quản ở nhiệt độ càng thấp thì độ ascaridol càng ít giảm.Vì thế, ở những nơi có điều kiện nên cho vào tủ lạnh. 1.2.3. Tác dụng và công dụng. Tinh dầu giun là một thứ thuốc tẩy giun cổ điển đã được dùng ở nhiều nước. Hoạt chất chính cho tác dụng diệt giun ký sinh người và động vật là ascaridol, do đó tinh dầu giun dùng trong điều trị phải có hàm lượng ascaridol đạt >=60%. Về tác dụng diệt giun, ascaridol mạnh gấp hai lần so với tinh dầu giun. Tinh dầu giun có tác dụng mạnh với giun đũa, một dung dịch chỉ cần có nồng độ tinh dầu giun là 1:5000 cũng đủ làm tê liệt giun. Thí nghiệm thấy cá có thể bị chết trong 12h với dung dịch có nồng độ 1/8000 TD giun. Liều độc của ascaridol là 0,3 mcg cho 1 Kg thể trọng của thỏ, chuột bạch là 0,60 mcg còn với ếch là 0,5 mcg. Tinh dầu giun có hiệu nghiệm mạnh đối với các loài giun ký sinh là do hoạt chất ascaridol nhiều hay ít. Tác dụng của tinh dầu giun mạnh nhất đối với giun đũa và có tác dụng đối với giun mỏ. Nhưng ít có tác dụng đối với giun tóc, giun kim và sán. Riêng đối với giun ký sinh ngựa, chỉ cần một liều từ 16 – 20 ml là có thể tiêu diệt hết. Tinh dầu giun sản xuất ở Việt Nam đã được thử nghiệm về tác dụng diệt giun trên giun đũa lợn (Ascaris suum) là loại giun về mặt hình thái và tô chức học gần giống với giun đũa ơ người (Ascaris lumbricoides). Tinh dầu được chọn 3 mẫu có hàm lượng ascaridol khác nhau (80,44; 62,30; 43,21%) pha loãng trong dầu lạc trung tính hoặc nước nuôi giun. Kết quả cho thấy cả 3 mẫu tinh dầu giun đều có tác dụng diệt giun và cường độ tác dụng diệt giun có liên quan đến hàm lượng ascaridol.Mẫu tinh dầu giun có hàm lượng ascaridol cao làm giun chết nhanh, còn ở mẫu có hàm lượng ascaridol thấp, giun chết chậm, với nồng độ 1:100 pha loãng trong dầu lạc trung tính, mẫu có hàm lượng ascaridol 80.44 % làm chết giun trung bình sau 1 giờ kể từ khi tiếp xúc,mẫu có hàm lượng ascaridol 62.38 % sau 1 giờ 30 phút và mẫu có hàm lượng 43,21 sau 2 giờ. Nhân dân ta thường dùng thường dùng các dạng thuốc thông thường để tẩy giun như: Dầu tẩy giun 25%: Công thức: tinh dầu giun có 60 % ascaridol 25 ml Dầu thầu dầu trung tính vừa đủ 1000 ml Công dụng: có tác dụng tốt đối với giun đũa,giun mỏ. Cách dùng và liều dùng: (Sáng hôm sau uống thuốc thì từ chiều hôm trước nên ăn cháo hoặc ăn ít cơm). Uống xong cần nghỉ khoảng 30 phút để cho thuốc tác dụng với giun, sau đó uống từ 500 - 1000ml nước. Người lớn uống 1 lọ là 30 ml Trẻ em từ 3 - 5 tuổi uống 1/6 lọ Trẻ em từ 6 - 10 tuổi uống 1/3 lọ Kiêng kị: Người già, phụ nữ có thai, trẻ em dưới 3 tuổi. Thân và lá cây Dầu giun cũng đã được nhiều nước sử dụng làm vật liệu để pha nước giải khát như chè khô, có tác dụng phòng và chữa một số dạng bệnh cancer (ung thư), uterine fibroids (u xơ dạ con) (US Patent 6841175 - Chenopodium ambrosioides extract for treating uterine fibroids) và ở một số nước khác còn được sử dụng làm thảo dược chữa nhiều bệnh như: Rheumatism (thấp khớp, dạ dày…) Bột lá khô hay tinh dầu cây dầu giun đã được thử nghiệm trừ một số loài sâu hại kho như: mọt gạo, mọt ngô Sitophilus granarius, S. zeamais… Tinh dầu loài này cũng đã được thử nghiệm thành công trừ rệp cam quýt citrus mealybug = Planococcus citri (Risso); Rệp đào green peach aphid = Myzus persicae, Rệp đuôi dài longtailed mealybug = Pseudococcus longispinus (Targioni Tozzetti); Rệp hại hoa western flower thrips = Frankliniella occidentalis (Pergande)… như một số chế phẩm từ thực vật như dầu vừng, tỏi, dầu khoáng và chế phẩm sinh học vi sinh BT (Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis). Tinh dầu cũng có tác dụng kìm hãm hoạt động của nhiều loài nấm mốc, nấm ký sinh thực vật: bệnh héo vàng Fusarium oxysporum, Thối hạch Sclerotium rolfsii, Tiêm lửa hại lúa Helminthosporium oryzae và chết rạp cây con Pythium debaryanum trong các nghiên cứu trong phòng và đặc biệt, có tác dụng kìm hãm sự hình thành độc tố aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus trong thực phẩm [23 Nancy]. Ở Trung Quốc, cây dầu giun còn được sắc làm nước rửa, chữa viêm kẽ chân và eczema. Tinh dầu giun tuy có tác dụng mạnh đối với giun đũa, nhưng lại là một thứ thuốc độc bảng B, chỉ ở liều tương đối thấp cũng đã có tác dụng làm cho tim suy yếu, ngoài ra còn có tác dụng hạ huyết áp và có hại đến nhịp thờ. Nếu uống tinh dầu giun với liều mạnh có thể gây điếc tại tạm thời, bị chóng mặt, hoa mắt làm lạnh đầu ngón chân, ngón tay, kích ứng ống tiêu hoá, làm suy nhược tim và bộ máy hô hấp. Ngoài ra, liều cao tinh dầu giun gây thoái hoá tế bào ở gan, thận, gây xung huyết ở não và viêm nghiêm trọng ở niêm mạc ruột. Ở ruột, tinh dầu giun được hấp thu dễ dàng và sau đó làm tê liệt nhu động ruột gây nên táo bón. Một phần tinh dầu giun đã được hấp thu bài tiết qua phổi, do đó trong hơi thở có mùi khó chịu đặc biệt của TG. Vì thế, nếu dùng không thận trọng sẽ gây nguy hiểm chết người. Riêng đối với phụ nữ có thai và người già yếu thì không nên dùng Như vậy, bên cạnh những tác dụng có ích trên của DG, nó còn tiềm tàng những nguy hiểm rất lớn nếu như chúng ta không thận trọng khi sử dụng. Chính vì lẽ đó, chúng ta nên nghĩ đến hướng phát triển nguồn dược liệu này sao cho hiệu quả theo hướng hạn chế sử dụng trực tiếp cho cơ thể người. Và làm thuốc BVTV là một hướng phát triển của chúng tôi. 1.3. THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 1.3.1. Khái niệm thuốc BVTV Là những chế phẩm có nguồn gốc hoá chất, thực vật, động vật, vi sinh vật và các chế phẩm khác dùng để phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật. Hoá chất BVTV gồm: các chế phẩm dùng để phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật, các chế phẩm điều hoà sinh trưởng thực vật, chất làm rụng hay khô lá, các chế phẩm có tác dụng xua đuổi, hoặc thu hút các loài sinh vật gây hại tài nguyên thực vật đến để tiêu diệt. 1.3.2. Yêu cầu của thuốc BVTV Thuốc BVTV là những chất độc, nhưng muốn là thuốc BVTV phải đạt một số yêu cầu sau: - Chỉ tiêu diệt các loài sinh vật gây hại mà không gây hại cho đối tượng không phòng trừ (tính chọn lọc) - An toàn đối với người, môi sinh và môi trường - Dễ bảo quản, chuyên chở, và sử dụng - Giá thành hợp lý. Tuỳ theo giai đoạn phát triển của biện pháp hoá học mà các yêu cầu được đánh giá cao thấp khác nhau. Hiện nay, yêu cầu "an toàn với người, môi sinh và MT" là yêu cầu quan trọng, được toàn thế giới quan tâm nhiều nhất. Chính vì vậy, thuốc BVTV có nguồn gốc từ thực vật ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng. 1.3.3. PHÂN LOẠI THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT Thuốc BVTV rất đa dạng và phong phú. Theo yêu cầu nghiên cứu và sử dụng chúng ta cần phải phân loại chúng. Có nhiều cách để phân loại như dựa vào đối tượng phòng chống, dựa vào con đường xâm nhập vào dịch hại hay dựa vào nguồn gốc hoá học… Dựa vào nguồn gốc hoá học chúng ta có các loại thuốc BVTV như sau: Thuốc có nguồn gốc thảo mộc: Bao gồm các thuốc làm từ cây cỏ hay các sản phẩm chiết xuất từ cây cỏ có khả năng tiêu diệt dịch hại Thuốc có nguồn gốc sinh học: Bao gồm các loài sinh vật (thiên địch), các sản phẩm có nguồn gốc sinh vật (các loài kháng sinh) có khả năng tiêt diệt dịch hại Thuốc có nguồn gốc vô cơ: Bao gồm các chất vô cơ (dung dich Boocđô, lưu huỳnh) có khả năng tiêu diệt dịch hại. Thuốc có nguồn gốc hữu cơ: Gồm các chất hữu cơ tổng hợp có khả năng tiêu diêt dịch hại (clo hữu cơ, lân hữu cơ, cacbarmat). Phân loại theo cơ chế tác động: Thuốc có tác động tiếp xúc, nội hấp… Phân theo dạng chế phẩm: thuốc bột, thuốc dạng dung dịch, dạng hạt… 1.3.4. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI Việt Nam được xem là một trong những quốc gia sử dụng thuốc bảo vệ thực vật nhiều nhất thế giới và trong danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng có tới hàng trăm tên thương mại khác nhau, trong đó nhiều loại được pha chế ờ các loại hóa chất cực độc và vấn đề quan tâm đối với các loại thuốc này tính độc lại có tính bền vững trong môi trường, sử dụng nhiều thì khả năng tích tụ trong đất càng cao dẫn đến ô nhiễm tầng nước mặt và tầng nước ngầm. Theo Viện Y Học Lao Động và Vệ Sinh Môi Trường qua những nghiên cứu cho thấy “nồng độ hoá chất BVTV đã làm ô nhiễm môi trường vượt tiêu chuẩn cho phép từ 1,33 – 21 lần”. Theo thống kê của Viện Bảo Vệ Thực Vật Việt Nam, năm 1990 lượng thuốc BVTV ở Việt Nam từ 10.300 tấn lên 33.000 tấn đến năm 2003 tăng lên 45.000 tấn và chỉ tính đến năm 2005 đã là 50.000 tấn. Sự lạm dụng hóa chất và sử dụng những loại thuốc BVTV cực độc đã làm cho độ màu mỡ của đất sút giảm, các loài sinh vật có ích bị ảnh hưởng dần dần đất cạn kiệt chất dinh dưỡng và trở thành đất hoang hóa. Lý do để lý giải có thể một phần do sức ép về dân số, bình quân ruộng đất thấp nên cần phải tăng vụ và do vậy, làm tăng khả năng cung cấp thức ăn cho sâu hại, kéo dài thời gian tích luỹ quần thể sâu và làm cho nguy cơ bùng phát dịch luôn hiện hữu. Mặt khác, VN lại có điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh hại phát sinh. Việc sử dụng quá mức thuốc hoá học BVTV vừa gây độc cả trực tiếp cho con người, vừa gây hại gián tiếp qua tồn dư còn lại trong sản phẩm nông nghiệp, gây ô nhiếm môi trường. Chính vì vậy, Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) và hầu hết các quốc gia trên thế giới đề quan tâm đến việc nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật, từ thảo mộc để từng bước thay thế thuốc trừ sâu độc hại và đã thu được nhiều thành công trên cây thuốc cá, cây Xoan tây (neem) và có tính an toàn cao, vừa giảm được chi phí BVTV, lại không tạo sức ép chọn lọc hình thành tính kháng. Đáng chú ý là các chất Matrine (từ cây Khổ sâm), Azadirachtin (từ cây Neem, là một loài Xoan ở Ấn Độ), Rotenone (từ cây Thuốc cá)… Từ lâu, con người đã biết dùng thuốc thảo mộc để trừ sâu nhưng gần đây do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng cùng với các tiến bộ về công nghệ, các chất có nguồn gốc thảo mộc trừ sâu ngày càng được phát triển nhanh. Các chất này cũng có hiệu lực diệt sâu nhanh, phổ tác dụng rộng, phòng trừ nhiều loại sâu hại cho nhiều loại cây trồng. Ở nước ta hiện nay các thuốc trừ sâu nguồn gốc thảo mộc cũng đã được đăng ký với nhiều tên thương mại của nhiều đơn vị, trong đó có các chế phẩm Đầu Trâu Jolie (hoạt chất Matrine), Vineem (Azadirachtin), Vironone (Rotenone)… Thuốc Đầu Trâu Jolie 1,1SP chứa 11g matrine/1l, là thuốc đặc trị bọ trĩ hại lúa và các cây trồng khác. Sử dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật có lợi hại ra sao? Có lợi: • Diệt dịch hại nhanh, có khả năng chặn đứng được sự tàn phá của sâu bệnh hại. • Cho kết quả rõ rệt, triệt để. • Thường nâng cao năng suất, phẩm chất nông sản một cách đáng kể. Có hại: • Dễ gây độc cho người sử dụng thuốc. • Để lại dư lượng trong nông sản làm tăng nguy cơ gây hại cho con người và gia súc, gia cầm. • Gây ô nhiễm môi trường sống. • Lưu tồn lâu trong đất, nước, sinh vật. • Gây nên hiện tượng kháng thuốc của sâu hại cần phòng trừ. Việc sử dụng thuốc trừ sâu bằng hóa chất làm ô nhiễm môi trường và có nguy cơ ảnh hưởng tới chất lượng thực phẩm, rau quả gây hại trực tiếp đến gia súc, nhất là sức khỏe con người, để giảm thiểu các tác hại và khắc phục môi trường khỏi ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Các chất độc là các hợp chất thiên nhiên cho nên dễ bị phân hủy sau khi sử dụng, không để lại dư lượng ở trong đất và trong nông sản, ít gây độc hại cho người và môi trường. Tuy nhiên, thời gian xảy ra tác động lâu hơn thuốc trừ sâu hóa chất. Cây dầu giun, nhờ tác dụng diệt giun ký sinh trước đây nên đã có cơ hội phát triển rộng ra khắp thế giới. Gần đây, nhiều quốc gia đã nghiên cứu và phát hiện tinh dầu và một số chất hoá học khác có trong cây dầu giun có khả năng trừ sâu, trừ tuyến trùng, hạn chế sự phát sinh của một số loài nấm… Về cơ chế tác động, một số nghiên cứu đã chỉ ra tinh dầu từ cây dầu giun có khả năng tác động đến lớp da ngoài, làm cản trở quá trình hô hấp của côn trùng dẫn đến làm chết côn trùng. Do đây là các chất có nguồn gốc tự nhiên nên dễ phân huỷ trong môi trường và hầu như không để lại dư lượng trên sản phẩm sau khi sử dụng nên đã được một số quốc gia tiên tiến trên thế giới như Mỹ, Đức coi trọng việc ưu tiên sử dụng thay thế các thuốc BVTV độc hại. Một số sản phẩm thuốc BVTV từ cây hay tinh dầu cây DG đã trở thành sản phẩm hàng hoá, được thương mại hoá… và được khuyến cáo ưu tiên sử dụng trong các chương trình sản xuất nông sản an toàn GAP. Có thể kể tên thuốc Requirem do Canada sản xuất và đã được cung ứng cho thị trường thuốc BVTV tại Mỹ. Một sản phẩm khác do chính Mỹ sản xuất có tên là ECANA (Extract of Chenopodium ambrosioides near ambrosioides) đã được Cục Bảo vệ Môi trường Mỹ ưu tiên cấp phép sử dụng vì là thuốc có nguồn gốc thảo mộc… Tại Việt Nam, dù đã có nhiều cơ quan quan tâm đến nghiên cứu và sản xuất thuốc hoá học BVTV từ thảo mộc như Viện Khoa học Nông nghiệp VN, Viện BVTV… nhưng mới chỉ tập trung vào một số cây đã có truyền thống sử dụng như thuốc cá… và hầu như chưa có tài liệu nào nghiên cứu về sử dụng cây dầu giun trong BVTV.. 1.4. VÀI NÉT VỀ SÂU: 1.4.1. Sâu có hại: Ở Việt Nam, côn trùng và sâu có trên 1 triệu loài, chiếm khoảng 2/3 số côn trùng và sâu trên thế giới. Trong các loài sâu, ngoài các loài có lợi cho con người, còn có nhiều loài có hại, như chúng phá hoại mùa màng, các loại cây trồng. Theo Đường Hồng Duật có khoảng 123 loài sâu bệnh chủ yếu có hại trên 24 loại cây trồng phổ biến ở Việt Nam. Năm 2004 diện tích trồng rau xanh trên cả nước khoảng 614,5 nghìn ha tương đương với 7% đất sử dụng trong nông nghiệp. Năm 2003 kim nghạch xuất khẩu rau xanh đạt 182,554 triệu USD. Theo tính toán của bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn lượng rau xanh bị sâu bọ hại chiếm từ 10-40% sản lượng. Để đảm bảo chất lượng rau, ngày 28/04/1998 Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã ra quyết định số 67-1998/QĐ/BNN – PTNT “Qui định tạm thời về sản xuất rau an toàn”. 1.4.2.2. Sâu quy (Mọt khuẩn nhỏ: Alphitobius diapernis (Panzer 1797) (Coleoptera: Tenebrionidae) ¨ Về phân loại sau quy được phân loại khoa học như sau: Giới động vật Animalia Ngành chân đốt Arthropoda Lớp côn trùng Insecta Bộ cánh cứng Coleoptera Bộ phụ đa thực Polyphaga Họ ánh kim Tenebrionidae Loài sâu quy (mọt khuẩn nhỏ) Alphitobius diaperinus ¨ Hình dạng: • Mọt trưởng thành - dài 6 mm. Mọt trưởng thành mới rụng lông có màu hơi đỏ-nâu chuyển sang đen. • Ấu trùng - dài 7,5 mm. Thon nhỏ, phân đốt và giống như sâu với ba cặp chân rất bé trên ngực và một chân giả ở phía sau bụng. ¨Chu kỳ sống • Mọt cái có thể đẻ ít nhất 110 trứng trong khoảng thời gian một tháng và trứng thwờng nở sau 4-7 ngày. • Ấ́u trùng phát triển trong khoảng 7 tuần, có 8 lần lột xác. Ấu trùng trưởng thành tìm một nơi ẩn náu để phát triển thành nhộng. • Nhộng thường tồn tại khoảng 7 đến 11 ngày trước khi vũ hoá thành mọt trưởng thành. • Mọt trưởng thành có thể sống đến hai năm. ¨ Tập quán • Loài mọt này bị hấp dẫn bởi các hoạt động gia cầm, là những nơi có các điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của chúng. Mọt khuẩn nhỏ gây thiệt hại cho sự cách ly khi chúng tìm kiếm một nơi an toàn để phát triển thành nhộng vì bọ đen săn bắt mọt khuẩn nhỏ. PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1.1.Nguyên liêụ ¨ Đối tượng nghiên cứu: - Cây Dầu giun (Chenopodium ambrosioides L.) được thu hái ở ven bờ đê sông Hồng (Hà Nội) vào thời điểm tháng 2 đến tháng 5/2009. Sâu quy (Alphitobius diaperinus (Panzer)) (Coleoptera: Tenebrionidae), đạt tiêu chuẩn quy định: sâu khoẻ, khôngbị bệnh tật (nấm kí sinh…), kích thước 1,5cm/con. Tuyến trùng nốt sưng Medoilogyne spp. được Viện bảo vệ thực vật cung cấp. ¨ Phương tiện nghiên cứu: * Thiết bị – máy móc: - Nồi cất tinh dầu - Tủ sấy: Memmert, Shellab - Kính hiển vi: Leica BME, Leica CME - Hộp nuôi sâu, hộp thí nghiệm sâu. - Các dụng cụ khác như: Phễu, pipet, lam kính,lá kính, thuyền tán *Hoá chất – dung môi: - Hoá chất: xanhmethylen, đỏ son phèn, dung dich acid acetic 5%, dung dịch javen , các hoá chất để định lượng như: dd natrithiosulfat, dd kali iodid,… - Dung môi: Dầu thực vật, ethanol… Tất cả các hoá chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích (P). 2.1.2. Phương pháp thực nghiệm 2.1.2.1. Nghiên cứu về thực vật * Mô tả đặc điểm thực vật và kiểm tra tên khoa học của mẫu nghiên cứu: Mô tả đặc điểm cây, hoa, quả, hạt của cây thu hái và đối chiếu với các tài liệu về thực vật[], chụp ảnh, đối chiếu; tham khảo ý kiến của các nhà thực vật học. * Nghiên cứu đặc điểm vi học: làm vi phẫu thân, lá theo tài liệu thực tập dược liệu[] và tài liệu kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp kính hiển vi[] 2.1.2.2. Nghiên cứu về hoá học: · Xác định hàm lượng tinh dầu có trong dược liệu thu hái được từ thực địa: - Nguyên tắc: Tách tinh dầu ra khỏi dược liệu bằng phương pháp cắt kéo hơi nước. Từ lượng tinh dầu thu được so với khối lượng dược liệu tính được hàm lượng tinh dầu trong dược liệu. Có nhiều bộ dụng cụ khác nhau để định lượng tinh dầu, dưới đây là sơ đồ bộ dụng cụ: (D = 0,920 - 0,980 < 1) - Dụng cụ: Bộ dụng cụ với ống hứng trong Hình : Bộ dụng cụ cất tinh dầu (dược điển Việt Nam II) A. Bình cầu đựng dược liệu B. Ống nối C. Sinh hàn H1: Bộ phận hứng tinh dầu nhẹ hơn nước. H2: Bộ phận hứng tinh dầu nặng hơn nước. Ðể tiện cho việc lắp ráp, bộ dụng cụ trên được gia công thêm một ống nối để nối bình cấu với sinh hàn. Trong ống nối có 3 mấu thuỷ tinh để giữ bình hứng (theo hình vẽ). Chú ý: Tinh dầu dễ bị phá huỷ khi chưng cất vì vậy thời gian cất một mẻ là 25 – 30 phút kể từ lúc bắt đầu sôi trong nồi cất · Nghiên cứu Ascaridol: [Dược điển Việt Nam I-tr577,Bài giảng dliêu 2] - Định lượng ascaridol trong tinh dầu cất được bằng phương pháp oxy hoá - khử: Nghuyên tắc: Lấy tinh dầu đã cất được với lượng chính xác đem tiến hành phản ứng oxyhoá-kh ử trong môi trường acid, ascaridol oxy hoá kali iodid dư giải phóng iod tự do,iod giải phóng ra được đinh lượng bằng dd natri thiosulfat chuẩn. Đọc thể tích dd natri thiosulfat chuẩn đã phản ứng. · Tiến hành SK khí: Tiến hành nghiên cứu tại Viện Dược liệu Hà Nội - Máy GC/MS – QP 2010 của hãng SHIMAZU - Cột sắc ký DB – 5MS (30 x 0,25mm ID) - Khí mang He - Nhiệt độ buồng tiêm: 200oC - Nhiệt độ detector: 200oC - Chương trình hoá nhiệt độ: 70 – 290oC; 70 – 180oC; tốc độ tăng 14oC/phút. Giữ ở 180oC trong 3 phút; 180 – 290oC; tốc độ tăng 10oC/phút. Giữ ở 180oC trong 1 phút - Mẫu thử 1ml tinh dầu (nồng độ 0,2%). 2.1.2.Nghiên cứu động vật thí nghiệm - Tiến hành nuôi sâu quy với mục đích xác định vòng đời sâu quy, đồng thời có cung cấp nguồn động vật thí nghiệm. - Nuôi sâu trong điều kiện thường tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dược liệu-trường đại học Dược-Hà Nội. - Tiến hành: Nuôi sâu trong các thùng, hộp có đục lỗ nhỏ đủ để sâu thở nhưng không bò ra được; phía dưới có đặt các chậu nước để tránh kiến,chuột…Hàng ngày cho sâu ăn bỏng ngô,cám gà…Nuôi sâu quy cần chú ý: Ngoài thức ăn là cám gà, bỏng ngô… cần bổ sung nước uống qua rau củ quả tươi (táo, carot, xà lách). Khi cần hóa nhộng, cần bắt riêng sâu khỏe nhốt riêng vào hộp phim nhựa hay lọ nhỏ để sâu phải hóa nhộng.Theo dõi số ngày hoá nhộng, hoá con trưởng thành, sâu non và ghi lại kêt quả. 2.1.2.4. Nghiên cứu hiệu lực diệt sâu: 2.1.2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm: - Xác định ảnh hưởng của cây Dầu giun lên sâu quy ở các dạng sư dụng khác nhau: Nước no tinh dầu, hỗn dịch tinh dầu với nước không có chất phụ gia, hỗn dịch tinh dầu với nước có thêm chất phu gia, dùng dạng bột nghiền khô, nước ép cây Dầu giun tươi và có đối chứng (nước có chất phụ gia, nước không có chất phụ gia và thuốc trừ sâu đã được sử dụng trong thực tế). - Hỗn dịch tinh dầu trong nước ta phun ở các tỉ lệ khác nhau. Mỗi dạng hôn dịch phun lên 3 mẫu sâu quy (mỗi mẫu có 25 sâu) đạt quy định đã nêu, phun với lượng 20ml/0,25m2/mẫu. Ta thí nghiệm với hai loại tinh dầu, một loại vừa cất tháng 3/2009 và một loại cất vào tháng 3/2008. Nước bão hoà tinh dầu ta cũng tiến hành thí nghiệm tưong tự. Dịch ép cây Dầu giun ta pha loãng lần lượt với 100, 200, 300, 400 ml nước và tiến hành thí nghiệm tuơng tự - Riêng bột dược liệu ta rắc lên 3 mẫu sâu quy (25 sâu) với tỉ lệ 2,5g/0,5m2/mẫu. - Quan sát và ghi lại hiện tượng (nhữnn thay đổi về hành vi, màu sắc), tỉ lệ sâu chết sau những thời gian khác nhau. - Nhận xét các dạng sử dụng và tìm ra dạng sử dụng có hiệu quả cao nhất cả về hiệu lưc diệt sâu và kinh tế. 2.1.2.4.2. Điều tra, thu thập số liệu Điều tra tỷ lệ sâu, tuyến trùng chết và tính toán theo công thức: Tổng số cá thể chết Tỷ lệ sâu (Tuyến trùng) chết (%) = ------------------------------ x 100 Tổng số cá thể thí nghiệm Thời điểm điều tra: Tuỳ theo mỗi thí nghiệm, sau mỗi thời gian cụ thể ghi trong bảng. Ngoài trực tiếp tiến hành các nghiên cứu trong phòng, chúng tôi còn phối hợp với Bộ môn Bệnh cây Viện BVTV đánh giá hiệu lực trừ tuyến trùng của tinh dầu DG, và Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu thuộc Cục BVTV để khảo nghiệm khả năng sử dụng bột khô DG trừ mọt hại kho 2.1.2.4.3. Phương pháp đánh giá và xử lí số liệu Xử lý số liệu: Những số liệu thu được qua khảo nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê thích hợp theo các tài liêu hướng dẫn quy phạm khảo nghiệm của Cục BVTV và Bộ NN và PTNT. Trước khi xử lý số liệu, hiệu lực của thuốc được hiệu đính bằng công thức Henderson - Tilton. % cá thể chết = [1 – (Ta/Ca)x(Cb/Tb)]x100 với: T: công thức thí nghiệm; C; Đối chứng; a: sau thí nghiệm; b: trước thí nghiệm. Số liệu được xử lý bằng chương trình so sánh sai khác trên microsoft excel. 2.2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật 2.2.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật và kiểm tra tên khoa học Cây thu hái tại ven bờ sông Hồng vào thời điểm từ tháng 2 đến tháng 5/2009 (hình dưới). Có đặc điểm: Là loại cây thảo. Thân đứng, có khía dọc, phân nhánh nhiều, cao 50-70 cm thậm chí ở những nơi đất tốt, mầu mỡ có thể cao tới 1,50m hay hơn thế nữa, thân cây và cành mềm màu xanh, cũng có khi hơi tía. Lá màu ve nhạt, mọc so le, có cuống ngắn, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 5,5 - 7,5 cm, rộng 1,3-2,5 cm, có phiến mọc men theo cuống, không phẳng, khía thuỳ không đều, đầu thuỳ nhọn, hai mặt cùng màu lục nhạt, lá ở ngọn có phiến rất hẹp và gần như nguyên; trên mặt lá có lông, thường ở các gân lá, nhất là mặt dưới. Hoa mọc tập trung từng xim đơn ở kẽ lá. Giữa chùm là hoa đực hay lưỡng tính, xung quanh có hoa cái nhỏ và không có cuống. Bề ngang hoa độ 1,5mm. Cụm hoa là những chuỳ dày hợp thành bông kép mang lá ở ngọn thân; bao hoa có thuỳ hình trái xoan tù ở đầu, nhị 5, đôi khi tiêu giảm còn 3 hoặc 2 cái, bao phấn hình trái xoan. Quả bế, hình cầu, màu lục nhạt hoặc trắng, đường kính chừng 1,5 mm, cùi mỏng có lá đài không rụng; hạt nhỏ, hình mắt chim, màu đen bóng ( khi hạt đã già ).Vị hắc và mùi hăng đặc biệt. Toàn cây có lông mịn ( lông che chở và lòng tiết) và mùi hăng đặc biệt mùa hoa quả tháng 5-7. Cây mọc từ hạt xuất hiện vào tháng 3-4, sinh trưởng nhanh trong mùa hè. Hình 3.Hình ảnh cây dầu giun chụp tại thưc địa Qua đặc điểm thực vật của cây, đối chiếu với các tài liệu về thực vật[]. Xác đinh mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Chenopodium ambrosioides L. – Chenopodiaceae. 2.2.1.2. Đặc điểm vi học ¨ Quan sát vi phẫu lá dưới kính hiển vi (hình dưới) * Phần gân chính: cả hai mặt đều lồi, phía trên lồi it, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì trên và dưới (1) gồm một lớp tế bào hình tròn xếp đều đặn Phía ngoài biểu bì rải rác có lông che chở đa bào (2) và lông tiết (3). Sát biểu bì trên và dưới là mô dày (4) gồm nhữn tế bào hình tròn, thành dày, xếp lộn xộn. Mô mềm (5) gồm những tế bào thành mỏng hình tròn không đều. Bó libe-gỗ (6) tạo thành vòng tròn không liên tục ở giữa gân lá. Phần libe bao quanh phần gỗ phía trong. Phần gỗ gồm các mạch gỗ tụ tập với nhau thành tứng đám, mỗi đám cách nhau bởi tế bào mô mềm. * Phần phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới (7) giống gân lá nhưng nhỏ hơn. Mô giậu (8) gồm các tế bào hình chữ nhật. Mô khuyết (9) nằm ở phần thịt lá. Hình 4. Vi phẫu 1 phần lá dầu giun Quan sát vi phẫu thân dưới kính hiển vi: Mặt cắt ngang hình tròn, từ ngoài vào trong có: Biểu bì (1) gồm 1 hàng tế bào nhỏ, hình tròn xếp đều đặn, phía ngoài mang lông che chở đa bào (2) và lông tiết (3). Giao mô (4) gồm các tế bào hình tròn, nhỏ, thành dày xếp tụ tập ở khía thân. Mô mềm vỏ (5) gồm nhiều lớp tế bào hình tròn,thành mỏng. Libe thứ cấp (6) gồm các tế bào nhỏ xếp thành hinh cung. Gỗ thứ cấp (7). Tầng phát sinh libe-gỗ (8) gồm các mạch gỗ to tập trung thành đám lớn tạo thành vòng phía trên bó libe-gỗ. Bó libe-gỗ sơ cấp (9) gồm các tế bào hình tròn nhỏ, xếp thành các bó hình bầu dục. Mô mềm ruột (10) ở chính giữa thân, gồm các tế bào hình tròn kích thước không đều nhau. Hình 5. Vi phẫu một phần thân cây dầu giun 2.2.2. Nghiên cứu về hoá học 2.2.2.1 Xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu Cân 200g dược liệu đã được làm nhỏ. Cho dược liệu vào bình cầu cổ mài dung tích 500 ml. Thêm 200 ml nước cất. Lắp dụng cụ theo hình vẽ . Ðun trực tiếp trên bếp điện (qua lưới amiang) hoặc trong bếp cách dầu trong 2 giờ. Ngừng cất. Tháo dỡ dụng cụ. Lấy riêng phần ống hứng tinh dầu. Dùng ống xi phông đặt ở nhánh hồi lưu (nhánh nhỏ) điều chỉnh cho tinh dầu nằm ở phần chia vạch có thể đọc được một cách thuận lợi nhất. Ðọc lượng tinh dầu cất được. Làm liên tục như thế lặp lại trong 3 lần. Sau khi tiến hành theo quy trình trên, tổng lượng tinh dầu thu được là 0,3ml. 2.2.2.2. Định lượng Ascaridol Cân chính xác p gam TG (khoảng 2,5g), hoà tan trong dung dịch axit axetic 90% vừa đủ 50ml. Trong mộ bình có nút mài (bình nón) dung tích 60-100ml, cho vào 3ml dung dịch KI 83%, 5ml axit clohidric 32 % và 10ml axit axetic kết tinh được. Đặt bình vào một hỗn hợp làm lạnh cho đến khi nhiệt độ bên trong hạ xuống -30. Nhỏ đúng 5ml dd TG trong axit axetic bằng một pipet có vạch, lắc nhanh rồi đặt lại bình vào hỗn hợp làm lạnh trong 5 phút. Sau đó, lấy bình ra và định lượng iot giải phóng bằng dung dịch natri thiosulfat. 0,1N cho đến khi mất màu. Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện như trên, nhưng trước khi định lượng cho thêm 20ml nước. Phương trrình phản ứng: - O – O - + 2I- + 2H+ = - O - + I2 + H2O (1) I2 + 2Na2S2O3 = 2NaI + Na2S4O6 (2) Sau khi định lượng xac định được hàm lượng ascaridol như sau: (16,7 - 0,7)x 6,05/0,2503=38,67% 2.2.2.3. Sắc kí khí Bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp với khối phổ chúng tôi đã phân tích được các thành phần như sau: Mẫu 1 (cất cách vào tháng 3/2008) có 20 thành phần Mẫu 2 (cất vào tháng 3/2009) có 20 thành phần Như vậy có những thành phần không xác định được,có những thành phần có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu kia và có những thành phần tồn tại ở cả 2 mẫu như: Alpha-terpinen, p- Cymene, D- Limonene, ascaridol. Điều đáng chú ý là hàm lượng ascaridol ở 2 mẫu rất khac nhau và thấp hơn nhiều so với những tài liêu ghi lại trước đó. Kêt quả phân tích được đính cuối khoá luận. 2.2.3. Kết quả nghiên cứu động vật thí nghiệm Sau 6 tháng nuôi sâu và quan sát ta nắm được vòng đời của sâu quy như sau: - Giai đoạn từ sâu hoá nhộng mất thời gian khoảng 60-75 ngày - Giai đoạn từ nhộng chuyển thành con trưởng thành mất thời gian khoảng 8-11 ngày,trải qua 8 lần lột xác tương ứng với 8 tuổi. - Giai đoạn từ con trưởng thành đẻ ra sâu non mất thời gian khoảng 25-30 ngày. →Vòng đời sâu quy khoảng 90-115 ngày. Mỗi lần con trưởng thành đẻ được 400-500 sâu non. Ta nhận thấy vòng đời sâu quy khá dài và năng suất sinh sản khá cao. Bằng mắt thường ta không thể quan sát được trứng của sâu quy nên khó có thể xác định được thời gian sâu trưởng thành đẻ trứng và khoảng thời gian từ trứng nở thành sâu non. Ta có thể quan sát trứng dưới kính hiển vi. 2.2.4. Kết quả nghiên cứu về hiệu lực diệt sâu. 2.2.4.1. Đánh giá hiệu lực diệt sâu của nước bão hoà tinh dầu Ngày thực hịên: 26/03/2009. Ta lấy nước này phun theo 2 cách: phun trực tiếp lên sâu và phun qua thức ăncho sâu ăn. Sau khi quan sát ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 2.2.4.1 Kết quả xử lý sâu bằng nước bão hoà tinh dầu Thời gian quan sát sau (Xgiờ) PP phun 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ Phun trực tiếp lên sâu 12% 16% 28% TB: 18,67% 16% 16% 28% TB: 20% 28% 28% 48% TB: 34,67% 28% 28% 48% TB:34,67% Phun gián tiếp qua thức ăn 0% 0% 0% TB: 0% 4% 4% 4% TB: 4% 12% 8% 8% TB: 9,33% 12% 8% 8% TB: 9,33% → Nhận xét: Nước ngưng phun gián tiếp qua thức ăn hầu như không có hiệu lực với sâu quy, tỉ lệ chết trung bình sau 24 giờ là 9,67% trong khi phun đối chứng với nước ta thấy tỉ lệ chêt trung bình sau 24 giờ là 5,33%. Nước ngưng phun trực tiếp lên sâu quy có hiệu lực hơn, tỉ lệ sâu chết trung bình sau 1 ngày là 34,67% (phun đối chứng với nước có tỉ lệ sâu chết là 9,33 %) nhưng cũng chưa có hiệu lực diệt sâu tốt. 2.2.4.2. Đánh giá hiệu lực diệt sâu của nước cây dầu giun tươi nghiền nhỏ ( 1kg nguyên liệu/1lít nước ) Ngày thực hiên: 03/04/2009. Cách làm : 0.5kg cây dầu giun tươi vừa thu hái về, mang nghiền hoặc xay nhỏ ngay, bỏ bã ta sẽ thu được 250-300ml dịch ép cây Dầu giun (dịch ép gốc) . Sau đó lân lượt thêm lần lượt 100ml nước, 200ml nước, 300ml nước, 400 ml nước vào dịch ép gốc, sau đó phun trực tiếp lên sâu quy. Sau khi quan sát kết quả thu được như bảng sau: Bảng 2.2.4.2 Kết quả xử lí sâu bằng dịch ép cây Dầu giun tươi Thời gian quan sát sau (Xgiờ) Loại dịch ép 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ Dịch ép gốc + 100ml nước (dịch ép 1) 48% 48% 52% TB: 49,33% 96% 96% 100% TB: 97,33% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Dịch ép gốc + 200ml nước (dịch ép 2) 32% 32% 40% TB: 34,67% 88% 92% 92% TB: 90,67% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Dịch ép gốc + 300ml nước (dịch ép 3) 12% 20 % 20% TB: 17,33% 52% 68% 64% TB: 61,33% 80% 100% 84% TB: 88% 100% 100% 100% TB: 100% Dịch ép gốc + 400ml nước (dịch ép 4) 8% 12% 12% TB: 10,67% 60% 52% 56% TB: 56% 68% 52% 56% TB: 58,67% 68% 52% 56% TB: 58,67% →Nhận xét: Phun sâu quy bằng dịch ép 1, dịch ép 2, dịch ép 3 nhận thấy hiệu lực diệt sâu quy đều cao.Sau khi vừa phun, sâu co giật mạnh, màu da hơi đen, sau đó sâu gần như tê liệt. Dịch ép 1 và dịch ép 2 thì 8 giờ sau khi phun tỉ lệ sâu chết đều đạt 100%, so với dịch ép 2 thì dịch chiết 1 khi vừa phun làm sâu co giật mạnh hon và sâu bắt đầu chết lâu hơn nhưng hiệu quả về kinh tế lại không bằng. Dịch ép 3 sau 24 giờ tỉ lệ sâu chết đạt 100%. Như vậy, so với hai dịch ép đầu thì thời gian làm sâu chết của dịch chiết 3 sau khi phun lâu hơn, sâu co giật yếu hơn tuy nhiên hiệu quả về kinh tế là lớn nhất. Dịch ép 4 thì hiệu lực diệt sâu không cao, sau 24 giờ tỉ lệ sâu chết trung bình chỉ là 58,67%. Trong thí nghiêm phun bằng dịch chiết cây tươi này, ta thấy có thể sử dụng dịch chiết 3 để phun diết sâu trong thực tế để có hiệu quả cao nhất. 4 tấn dược liệu tươi cho ta khoảng 440-480 lít dịch chiết 3 và có thể phun cho khoảng 1ha. 2.2.4.3. Đánh giá hiệu lực diệt sâu quy của tinh dầu giun: ¨ Hỗn dịch tinh dầu giun trong nước(không có chất nhũ hoá): Ngày thực hiện: 10/04/2009. Làm thí nghiệm với hai mẫu tinh dầu giun được cất vào tháng 03/2008 và tháng 03/2009. Lắc tinh dầu trong nước theo những tỉ lệ khác nhau thu đươc loại hỗn dịch 1 (với tinh dầu giun cất vào tháng 03/2008) và hỗn dịch 2 (với tinh dầu cất vào tháng 04/2009). Sau khi quan sát kết qủa thu được như bảng sau: Bảng 2.2.4.3a Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 1: Thời gian quan sát (sau X giờ) Tỉ lệ TDG/H2O 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 0,5ml TDG/100ml H20 16% 20% 28% TB: 21,33% 20% 20% 28% TB: 22,67% 44% 44% 52% TB: 46,67% 44% 44% 52% TB: 46,67% 1ml TDG/100ml H20 20% 28% 28% TB: 25,33% 44% 44% 52% TB: 46,67% 60% 64% 72% TB: 65,33% 60% 64% 72% TB: 65,33% 1,5ml TDG/100ml H20 44% 52% 52% TB: 49,33% 72% 80% 80% TB: 77,33% 88% 80% 84% TB: 84% 100% 100% 100% TB: 100% 2ml TDG/100ml H20 80% 84% 84% TB: 82,67% 88% 92% 92% TB: 90,67% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Bảng 2.2.4.3b Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 2 Thời gian quan sát (sau X giờ) Tỉ lệ TDG/H2O 2giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 0,5ml TGD/100ml H20 16% 20% 24% TB: 20% 20% 24% 28% TB: 24% 44% 52% 52% TB: 49,33% 44% 52% 52% TB: 49,33% 1ml TGD/100ml H20 20% 28% 28% TB: 25,33% 44% 44% 52% TB: 46,67% 60% 64% 72% TB: 65,33% 60% 64% 72% TB: 65,33% 1,5ml TDG/100ml H2O 52% 52% 44% TB: 49,33% 80% 80% 76% TB: 78,67% 84% 88% 84% TB: 85,33% 100% 100% 100% TB: 100% 2ml TDG/100ml H20 80% 84% 84% TB: 82,67% 92% 92% 92% TB: 92% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Hiện tượng sau khi phun: Lúc đầu co giật mạnh sau đó tê liệt và màu sắc da hơi đen. Mức độ tăng dần khi tăng tỉ lệ nước trong dầu. Hiện tượng xảy ra với 2 loại hỗn dịch là như nhau. →Nhận xét: Dạng thuốc này hiệu quả không cao, tốn kém về kinh tế và sức người. Hỗn dịch ở tỉ lệ 0,5ml TDG/100ml H20 và 1ml TDG/H20 hiệu lực diệt sâu thấp. Tỉ lệ sâu chết sau 24 giờ lần lượt chỉ là 46,67% và 65,33%. ở nồng tỉ lệ 1,5ml TDG/100ml H20 và 2ml TDG/100 H20 hiệu lưc diệt sâu khá cao, tỉ lệ sâu chết trung bình sau 24 giờ đều là 100 % tuy nhiên lượng tinh dầu dùng quá cao. Dạng này không có ứng dụng thực tế. Ở cả loại hỗn dịch 1 và hai hiệu lực diệt sâu là như nhau do đó có thể thấy hoạt tính của tinh dầu giun không phụ thuộc vào hàm lượng ascaridol có trong tinh dầu. ¨ Tinh dầu giun trong nước(có chất làm nhũ hoá): Ngày thực hiện: 17/04/2009. Cách tiến hành: Làm thí nghiệm với 2 mẫu tinh dầu giun được cất vào tháng 03/2008 và tháng 03/2009. Tinh dầu giun được phân tán vào nước theo những tỉ lệ khác nhau, cho thêm 1 giọt chất phụ gia để làm chất nhũ hóa và 3 giọt chât bám dính. Hỗn dịch có tinh dầu giun cất vào tháng 03/2008 là hỗn dịch 1’ còn hỗn dịch có tinh dầu giun cất vào tháng 03/2009 là hỗn dịch 2’. Làm thí nghiệm với dạng thuốc này có đối chứng là dung dịch nước có hoà tan 1 giọt chất nhũ hoá và 3 giọt chất bám dính (đối chứng1). Sau khi quan sát kết qủa thu được như bảng sau: Bảng 2.2.4.3c: Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 1’ Thời gian quan sát (sau X giờ) Tỉ lệ TDG/H2O 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 0,125ml TDG/100ml H20 20% 24% 24% TB: 22,67% 44% 52% 52% TB: 49,33& 52% 60% 60% TB: 57,33% 52% 60% 60% TB: 57,33% 0,25 ml TDG/100ml H20 28% 28% 32% TB: 29,33% 48% 56% 56% TB: 51,33% 72% 76% 76% TB: 74,67% 96% 100% 100% TB: 98,67% 0,5 ml TDG/100ml H20 44% 56% 52% TB: 50,67% 68% 72% 72% TB: 69,33% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Bảng 2.2.4.3d: Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 2’ Thời gian quan sát (sau X giờ) Tỉ lệ TDG/H2O 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 0,125ml TDG/100ml H20 20% 24% 24% TB: 22,67% 48% 52% 52% TB: 49,33% 56% 56% 60% TB: 57,33% 56% 56% 60% TB; 57,33% 0,25ml TDG/100ml H20 28% 32% 32% TB: 30,67% 56% 56% 56% TB: 56% 72% 76% 76% TB: 74,67% 72% 76% 76% TB: 74,67% 0,5ml TDG/100ml H20 52% 56% 52% TB: 53,33% 68% 72% 72% TB: 70,67% 100% 100% 100% TB: 100% 100% 100% 100% TB: 100% Hiện tượng sau khi phun: Lúc đầu sâu quy co giật mạnh, sau đó tê liệt và màu sắc da hơi chuyển sang mau đen. Mức độ tăng dần khi tăng tỉ lệ tinh dầu trong hỗn dịch. Bảng 2.2.4.3e: Kết quả diệt sâu của dung dich đối chứng 1 Thời gian quan sát (sau X giờ) Lần nhắc lại 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 1 0% 0% 0% 0% 2 0% 4% 4% 4% 3 0% 4% 4% 4% Trung bình 0% 2,67% 2,67% 2,67% → Nhận xét: Dạng thuốc này hiệu quả, có thể sử dụng trong thực tế vì có hiệu lực cao lại có hiệu quả về kinh tế, ở tỉ lệ rất thấp 0,125ml TDG/100ml H20 có thể diệt được 57,33 sâu sau 24 giờ sau khi phun. Ở tỉ lệ 0,25ml TDG/100ml H20 và 0,5ml TGD/100ml H20 hiệu lực diệt sâu đều rất cao, 24 giờ sau khi phun đều diệt được 100% sâu. Mặt khác, dung dịch đối chứng lại gần như không có hiệu lực diệt sâu. Chất phụ gia chỉ có tác dụng làm tăng hiệu lực diệt sâu của hỗn dịch.Chọn tỉ lệ pha 0,25ml TDG/100ml H20 sử dụng trong thực tế. Cả hỗn dịch 1’ và 2’ cho kết quả xử lí sâu là tương đương nhau chứng tỏ hoạt tính của tinh dầu không phụ thuộc vào hàm lượng ascaridol trong tinh dầu. 2.2.4.4. Hiệu lực diệt sâu của đối chứng (thuốc trừ sâu sinh học BITADIN WP) Ngày thí nghiệm: 25/04/2009. Thuốc trừ sâu sinh học BITADIN WP là thuốc trừ sâu có thành phần gồm Bacilus thurigensis 16.000 IU và Granulosis 100.1000 PIB. Đây là loại thuốc trừ sâu được công nhận là an toàn đối với người và môi trường, được Bộ Nông nghiệp và PTNT cho phép sử dụng tại Việt Nam. Cách tiến hành: Pha 1g thuốc trong 1 lít nước. Sau đó cũng đem phun với 3 mẫu sâu quy (mỗi mẫu 25 sâu) với lượng 20ml/0,5m2/mẫu. Sau khi quan sát kết quả thu được như bảng sau: Bảng 2.2.4.4: Kết quả diệt sâu của thuốc trừ sâu BITANDIN WP Thời gian quan sát (sau X giờ) Lần nhắc lại 2 giờ 4 giờ 8 giờ 24 giờ 1 16% 40% 84% 100% 2 20% 36% 80% 100% 3 20% 40% 80% 100% Trung bình 18,67% 38,67% 81,33% 100% → Nhân xét: Thuốc trừ sâu này được bán trên thị trường với hiệu lực tốt sau 24 giờ. 400g-1000g thuốc pha trong 400-1000 lít nước có thể phun cho 1ha. So với thuốc trừ sâu này thì các dạng sử dụng của cây Dầu giun mà ta đã thí nghiệm với sâu quy ở trên có các dạng có hiệu lực tương đương (làm chết sâu 100% sau khi phun 24 giờ) mà dùng với lượng thấp nhất là: Dịch ép cây Dầu giun tươi (dịch ép gốc) + 300ml nước. Hỗn dịch 1’ và hỗn dịch 2’ ở tỉ lệ 0,25ml TGD/100ml nước. Hỗn dịch 1 và hỗn dịch 2 ở tỉ lệ 1,5ml TDG/100ml nước. 2.2.4.5. Hiệu lực diệt sâu của bột dược liệu Ngày thực hiện: 04/05/2009. Cách làm: Lấy dược liệu tươi đem phơi trong bóng râm, rải mỏng cho đến khô ( khoảng 4-5 ngày). Sau đó, đem nghiền nhỏ ta thu được bột dược liêu khô (tỉ lệ: 5kg cây tươi thu được 6 lạng bột ). Lấy khoảng 2,5g bột thu được ở trên rắc lên 25 con sâu quy/0,5m2.(vẫn cho sâu ăn bình thường.Theo dõi sâu quy trong 1 tuần kết quả thu được như bảng sau: Bảng 2.2.4.5: Kết qủa diệt sâu của bột dược liệu Thời gian quan sát (sau X giờ) Lần nhắc lại Sau 2 ngày Sau 4 ngày Sau 7 ngày 1 20% 44% 100% 2 20% 48% 100% 3 28% 48% 100% Trung bình 22,67% 46,67% 100% Cũng với 3 mẫu sâu quy như thế, nuôi trong điều kiện bình thường nhưng không rắc bột dược liệu.Sau 7 ngày quan sát thấy chỉ có 1/25 sâu chết,thâm chí có mẫu không có sâu nào chết. → Thí nghiệm này cho thấy dạng bột này cũng có hiệu quả. Tuy nhiên,cần phải nghiên cứu thêm. 2.2.4.6 Hiêu lực diêt tuyên trùng cua tinh dâu giun Thí nghiệm phòng trừ tuyến trùng trong đất trồng cà phê bằng tinh dầu cây dầu giun (thực hiện phối hợp với bộ môn Bệnh cây, Viện BVTV). Ngày thí nghiệm: 05/5/2009; Ngày theo dõi: 06/5/2009. Nồng độ tinh dầu nghiên cứu: 0,2%; 0,5% và 1% Kết quả thử nghiệm nhanh lần thứ nhất với nồng độ 0.1% cho thấy chế phẩm có hiệu lực kém. Do đó, chúng tôi đã chính thức thử nghiệm ở một số nồng độ cao hơn và thu được kết quả: Bảng 2.2.4.5 Kết quả xử lí tuyến trùng bằng hỗn dịch TGD (không có chất nhũ hoá) Nồng độ Lần nhắc Tổng số TT Số con chết Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ chết TB 0,2 1 47 32 68,08 64,89 2 68 42 61,76 3 91 59 64,83 0,5 1 38 32 84,21 81,93 2 53 42 79,25 3 51 42 82,35 1,0 1 56 50 89,28 90,02 2 57 51 89,47 3 69 63 91,30 → Nhận xét: Kết quả trên cho thấy ngay từ nồng độ 0.2, tỷ lệ tuyến trùng chết đã đạt 64.89% và nếu nâng lên 1%, tỷ lệ tuyến trùng chết đã tới trên 90%. Có hiệu lực tốt và cần nghiên cứu thêm. PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Chúng tôi đã đã tiên hành mô tả được đặc điểm và cắt được vi phẫu thân lá loài cây thu hái ở ven sông Hồng và kết luận đây chính là loài Dầu giun là loại cây thân thảo mọc phổ biến tại Việt Nam và có tên khoa học là Chenopodium ambrosioides L. đúng như mẫu lưu gữ tại bộ môn dược liệu và các tài liệu đã ghi lại. Xác định được hàm lượng tinh dầu có trong dược liệu là 0,3ml TGD/0,6 kg dược liệu tươi. Hàm lượng ascaridol đã xác định được là 38.67% thấp hơn so với một số nghiên cứu trước đây. Sử dụng dịch tươi ép trực tiếp từ thân lá cây dầu giun tươi pha trong 300ml nước là thấy có hiệu lực trừ sâu với mức 100% sau 24 giờ là tốt nhất có thể tuyên truyền để nông dân sử dụng nhằm giảm chi phí thuốc phòng trừ sâu. Nước no tinh dầu có hiệu lực trừ sâu kém. Hỗn hợp tinh dầu chưng cất có thành phần chủ yếu là ascaridol có thể sử dụng làm chế phẩm BVTV để trừ sâu. Hỗn dịch tinh dầu lắc với nuớc (không có chất nhũ hoá) có hiệu lực trừ sâu khi sử dụng với nồng độ dịch chiết 1,5ml TGD/100ml n ước với hiệu lực diệt sâu sau 1 ngày tới trên 100%. Nếu sử dụng thêm phụ gia để làm tăng tính tan trong nước sẽ giúp giảm nồng độ sử dụng xuống 0.25% mà vẫn bảo đảm hiệu lực diệt sâu.Ta làm thí nghiêm với hai mẫu cất ở những thời điểm khác nhau với hàm lượng ascariol trong tinh rất khác nhau tuy nhiên hiêu lưc diệt sâu vẫn tương đương chứng tỏ hoạt tính của tinh dầu giun không phụ thuộc vào hàm lượng ascaridol. Bột khô từ thân lá dầu giun cũng có tác dụng trừ sâu tốt với hiệu lực tới 100% số sâu chết sau 7 ngày ở nồng độ sử dụng là 2,5 g/0,5 m2 có thể là gợi ý tốt để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong bảo quản hạt giống sau này. Tinh dầu dầu giun có khả năng trừ tuyến trùng tốt ở nồng độ sử dụng là 0.5 % Đề nghị: - Cần lựa chon phương pháp xác định hoạt tính của tinh dầu giun thích hợp. - Do thời gian nghiên cứu ngắn, chỉ trong phạm vi luận văn tốt nghiệp đại học nên các kết luận ban đầu nêu trên cần được tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong thực tế để có thể nhanh chóng hình thành được một sản phẩm thuốc BVTV tốt cho sản xuất nông nghiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT: Bộ môn Dược liệu, Trường đại học Dược Hà Nội (2004), Bài giảng dược liệu, tập 1, trang 230-231, trang 200, Trung tâm thư viện Đại học Dược Hà Nội. Viện Dược liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Tập I, trang 620-624. Tào Duy Cần (1963), Cây dầu giun. Nguyễn Viết Thân (2007) Những cây thuốc vị thuốc thường dùng, NXB Y học, trang 69. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, Quyển I, trang 723-725. Dược điển Việt Nam I, trang 577. Dược điển Việt Nam II, Tập 3, trang 494. Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm Dược liệu bằng phương pháp hiển vi, NXB Hà Nôi. Trần Công Khánh (1987), Thực tập sinh thái giải phẫu thực vật, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp. Phạm Thanh Kỳ (chủ biên, 2007), Dược liệu học, tập II, NXB Y học. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu tập I, Trung tâm thông tin thư viện trường đại học Dược Hà Nội. TIẾNG ANH: Bộ Nông nghiệp Mỹ: Classification for Kingdom Plantae Down to Species Chenopodium ambrosioides L. Bộ NN và PTNT, 2001: Các quy phạm khảo nghiệm thuốc BVTV. Số 03/2001/QĐ-BNN/KHCN, ngày 18 tháng 1 năm 2001 Carolina Marangon Jardim et al.: Composition and antifungal activity of the essential oil of the Brazilian Chenopodium ambrosioides L. Chernaki-Leffer A.M. et al. 2007: Populational fluctuation and spatial distribution of Alphitobius diaperinus (Panzer) (Coleoptera; Tenebrionidae) in a poultry house, Cascavel, Parana state, Brazil. Braz. J. Biol. vol.67 no.2 São Carlos. May  Corbet A.S and Tams, W.H.T 1943: Key for the identification of Lepidoptera infesting Stored Food Products. Proc.Zoo.Soc.Series, p.55-148. Dembitsky V. et al. 2008: Ascaridole and related peroxides from the genus Chenopodium. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 152 (2): 209-15. DESPINS, J. L., AXTELL, R. C. 1995, Feeding behavior and growth of broiler chicks fedlarvae of the darkling beetle, Alphitobius diaperinus. Poult. Sci., 74: 331-336. Dobie, P.Haines, C.P.Hodges; R.J and Prevett, P.E 1985: Insect and Arachnids of Tropical stored their biology and Identification, Tropical development and research Institute, UK. Dembitsky V. et al 2008: ASCARIDOLE AND RELATED PEROXIDES FROM THE GENUS CHENOPODIUM. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 152(2): 209–215. Đệ, Văn Đình: Sản xuất chất thơm thiên nhiên tổng hợp. NXB KHKT Hà Nội 2002. 91 Tr. E.K. Asaniyan, E.A.O.; Laseinde and J.O. Agbede: Prevalence of Darkling Beetles (Alphitobius diaperinus) Enviromental Protection Agency US 2008: Biopesticides registration action document 2008: Extract of Chenopodium ambrosioides near ambrosioides (PC Code 599995). EPA United States; Envirometal Protection Agency, April FRANCISCO O. et al. 2001: Characterization of the larval stages of Alphitobius diaperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae) using head capsule width. Revista Brasileira de Biologia vol.61 no.1 São Carlos Feb. Hiển, Bùi Công 1995: Côn trùng hại kho. NXB KHKT. 216 Tr. Hương, Hà Thanh và cs. 2004: Thành phần côn trùng, nhện trong kho và tần suất xuất hiện quần thể mọt bột đỏ (Tribolium castaneum Herbst.) tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam (2000-2001). Tạp chí KHKT Nông nghiệp Tập 2 số 1. James C. Dunford and Phillip E. Kaufman 2006: Lesser Mealworm, Little Beetle, Alphitobius diaperinus (Panzer) (Insecta: Coleoptera: Tenebrionidae). James C. Dunford and Phillip E. Kaufman: Lesser Mealworm, Litter Beetle, Alphitobius diaperinus (Panzer) (Insecta: Coleoptera: Tenebrionidae). Lộ, Vũ Ngọc và CS 1996: Những cây tinh dầu Việt Nam (Khai thác, Chế biến, Ứng dụng). NXB KHKT Hà Nội, 180 Tr. Lợi, Đỗ Tất 2004: Những Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội. p 153-5. Mỡi, Lã Đình và cs 2002: Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam. NXBNN (Cây dầu giun Tr. 58-65) 439 Tr. Moore M. 1995: Herb/Medical Contraindications: Chenopodium ambrosioides. Albuquerque, New Mexico. www.swsbm.com Mozaffa Hosen; Ataur Rahman Khan; Mossarrof Hossain 2004: Growth and Development of Lesser Mealworm, Alphitobius diaperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae) on Cereal Flours. Pakistan Journal of Biological Sciences 7 (9): 1505-8 Mozote L. et al. 2007: Combine effect of the essential oil from Chenopodium ambrosioides and Antileishmanial Drugs on promastigotes of Leishmania amazonensis. Rev. Inst. Med. Trop S. Paulo 49(4): 257-60, July-August. Nancy C. Coile; Carlos R. Artaud 1997: Chenopodium ambrosioides L. (Chenopodiaceae) Mexican-tea, wanted weed? Botany Circular No. 33. 6p. Peter Golob et al. 1999: THE USE OF SPICES AND MEDICINALS AS BIOACTIVE PROTECTANTS FOR GRAINS. FAO AGRICULTURAL SERVICES BULLETIN No. 137, . Peter Golob et al.: THE USE OF SPICES AND MEDICINALS AS BIOACTIVE PROTECTANTS FOR GRAINS. FAO AGRICULTURAL SERVICES BULLETIN No. 137, Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome. 1999 Potawale S.E. et al. 2008: Chenopodium ambrosioides: An Ethnopharmcological Review. Pharmcologyonline 2: 272-86. Puntener W. 1992: Manual for field trials in Plant protection. Documenta of CibaGeigy, Switzerland. 205 pages. Ronda L.H. et al. 2006: Resistance to cyfluthrin and tetrachlovinphos in the lesser mealworm, Alphitobius diaperinus, collected from the Eastern United State. Pest Management Science 62: 673-7 TAPONDJOU L. A. et al. 2002: Efficacy of powder and essential oil from Chenopodium ambrosioides leaves as post-harvest grain protectants against six-stored product beetles. Journal of Stored Products Research, vol. 38, no4, pp. 395-402    Trung Hoàng 1999, Nghiên cứu thành phần côn trùng kho 9 tỉnh miền Bắc Việt Nam và mức độ kháng thuốc phosphine, DDVP của 3 loài gây hại chính, Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp, Viện KHKTNN Việt Nam. Trung Vũ Quốc 1981, Sâu hại nông sản trong kho và phòng trừ, NXB Nông nghiệp. Viện bảo vệ thực vật. Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật Nhà xuất bản nông nghiệp 1997. tập 1. WHO: Medicinal Plants in Vietnam. WHO Regional publications; Institute of Materia Medica, Hanoi 1989: 220 p. MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật SK: Sắc ký Bộ NN và PTNN: Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1.3 SỐ LOÀI THUỘC CHI CHENOPODIUM 4 Bảng 2.2.4.1 Kết quả xử lý sâu bằng nước bão hoà tinh dầu 30 Bảng 2.2.4.2 Kết quả xử lí sâu bằng dịch ép cây Dầu giun tươi 31 Bảng 2.2.4.3a Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 1: 33 Bảng 2.2.4.3b Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 2 34 Bảng 2.2.4.3c: Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 1’ 36 Bảng 2.2.4.3d: Kết quả xử lí sâu bằng hỗn dịch 2’ 37 Bảng 2.2.4.3e: Kết quả diệt sâu của dung dich đối chứng 1 38 Bảng 2.2.4.4: Kết quả diệt sâu của thuốc trừ sâu BITANDIN WP 39 Bảng 2.2.4.5: Kết qủa diệt sâu của bột dược liệu 40 Bảng 2.2.4.5 Kết quả xử lí tuyến trùng bằng hỗn dịch TGD (không có chất nhũ hoá) 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình vẽ 2: Bộ dụng cụ cất tinh dầu (dược điển Việt Nam III) 20 Hình 3.Hình ảnh cây dầu giun chụp tại thưc địa 25 Hình 4. Vi phẫu lá dầu giun 26 Hình 5. Vi phẫu thân cây dầu giun 27