Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá và hạ cholesterol của cao toàn phần chiết xuất từ lá đinh lăng Polyscias Frusticosa L, Harms

96 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ VÀ HẠ CHOLESTEROL CỦA CAO TOÀN PHẦN CHIẾT XUẤT TỪ LÁ ĐINH LĂNG POLYSCIAS FRUSTICOSA L, HARMS Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh∗ TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Cây Đinh lăng mang nhiều tác dụng tiêu biểu của họ Nhân Sâm. Trong ñó lá Đinh lăng có thể thu hái quanh năm. Do ñó cần nghiên cứu các tác dụng dược lý ñể tăng giá trị sử dụng của nó. Đề tài này tiến hành nhằn xác ñịnh tác dụng chống oxy hóa và hạ cholesterol của dịch chiết lá Đinh lăng trên chuột nhắt trắng. Phương pháp - Phương tiện: Nghiên cứu thực nghiệm ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Y Học Cổ Truyền-Đại học Y Dược TP.HCM trên chuột nhắt trắng nhằm khảo sát tác dụng chống oxy hóa trên mô hình gây tăng hàm lượng MDA ở não và gan chuột nhắt trắng bằng CCl4. , ñồng thời ñánh giá tác dụng hạ cholesterol trên ñộng vật gây tăng cholesterol máu bằng ñường uống.. Kết quả: Cao lá Đinh lăng ở liều 200mg/kg và 500mg/kg làm giảm hàm lượng MDA trong não và gan chuột nhắt sau khi ñược gây tăng bằng CCl4. Và làm giảm nồng ñộ cholesterol trong máu so với lô không ñiều trị. Đạt ý nghĩa thống kê ở mức 95% so với nhóm chứng. Trong ñó liều 200mg/kg thể hiện tác dụng cao hơn. Kết luận: Cao lá Đinh lăng ở liều 200mg/kg có tác dụng chống oxy hóa và hạ cholesterol ở chuột nhắt cao hơn so với liều 500mg/kg. Từ khóa: Đinh lăng, chống oxy hóa, hạ cholesterol. ABSTRACT STUDIES ON ANTIOXIDANT AND LOWERING CHOLESTEROL EFFECTS OF EXTRACT FROM POLYSCIAS FRUCTICOSA L. HARMS LEAVES ON MICE. Nguyen Tran Chau Đo Mai Anh Background:Based on the specific effects of Polyscias Fructicosa which is equivalent to the species of Araliaceae family as well as its leaf easy to use whole the year, the present study was designed to evaluate the antioxidant activity and lowering cholesterol effects of extract from Polyscias fructicosa leaves on mice in oder to increase its usable value of Polyscias fructicosa. Method: This experimental study was carried out in Pharmacological Laboratory of Faculty of Traditional Medicine-University of Medicine and Pharmacy in HCM city on mice in order to evaluate antioxidant effect based on the level of malonyl dialdehycle (MDA) in mouse’s brain and liver as well as lowering cholesterol effects on the mice were given 150mg cholesterol/kg in ten days. Results: The Polyscias fructicosa extracts with dose of 200mg/kg and 500mg/kg decreased the level of mouse’s brain and liver as well as cholesterolemia which was caused by CCl4 and cholesterol administration.There were the stastitically significant difference between the study and control group as well as the effect between the dose of 200mg/kg and dose of 500mg/kg. Conclusion: The extracts from Polyscias fructicosa leaves with dose of 200mg/kg has antioxidant and the lowering cholesterol activity on mice much more than dose of 500mg/kg. Key words: Polyscias fructicosa, antioxidant activity, lowering cholesterol ĐẶT VẤN ĐỀ Gốc tự do là nguyên nhân liên quan ñến nhiều chứng bệnh như lão hóa sớm, các chứng bệnh về tim mạch, các chứng viêm[7], Trong Y học Cổ truyền Việt Nam, nhiều thảo dược có chứa flavonoid, anthocyanosid, tanin dùng làm thức ăn nước uống hàng ngày, có thể có khả năng chống oxy hóa, Đinh lăng là cây thuốc có nhiều tác dung tiêu biểu của họ Nhân Sâm [3],[4],[9]), Có ñặc ñiểm dễ trồng, dễ sử dụng, Lá Đinh lăng có thể thu hái quanh năm, Cần nghiên cứu các tác dụng dược lý ñể nâng cao giá trị sử dụng của lá Đinh lăng, MỤC TIÊU Khảo sát tác dụng chống oxy hóa và hạ cholesterol của cao toàn phần chiết xuất từ lá Đinh lăng trên chuột nhắt trắng, PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương tiện Nguyên liệu: Lá thu hái từ cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa) trồng tại vườn của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM Súc vật thử nghiệm: chuột nhắt trắng 20 ± 2g, mua tại Viện Pasteur Tp.HCM, nuôi trong ñiều kiện ổn ñịnh về dinh dưỡng Phương tiện nghiên cứu: sử dụng trang thiết bị của Phòng thí nghiệm Y Dược học cổ truyền - Khoa YHCT – ĐH Y Dược Tp.HCM, Hóa chất – thuốc thử: - Đệm phosphate (pH 7,2) - Dung dịch NaCl 0,9% - Kali clorua (KCl) - Acid Thiobarbituric (Merk, Germany) - Acid Tricloacetic - Đệm Tris HCl (Merk, Germany) - Dầu oliu - Cholesterol, U,S,P(Wilson Laboratories) Phương pháp nghiên cứu: Chiết xuất cao băng phương pháp ngấm kiệt Khảo sát tác dụng chống oxy hóa [8]: ∗ Khoa Y học Cổ Truyền – ĐH Y Dược Tp. HCM Địa chỉ liên hệ: ThS. Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh ĐT: 083.9077818 Email: maianh_3380@yahoo.com.vn 97 Súc vật thử nghiệm ñược chia làm 2 nhóm: * Nhóm bình thường (không tiêm CCl4): - Lô ñối chứng: cho chuột uống nước cất hàng ngày trong 6 ngày, sau ñó tiêm phúc mô dung dịch dầu, Sau khi tiêm 24 giờ, tiến hành mổ lấy gan và não ñể ñịnh lượng MDA, - Lô thử: chuột ñược uống các cao thử nghiệm hàng ngày với liều 200mg/kg trong 6 ngày, sau ñó tiêm phúc mô dung dịch dầu, Sau khi tiêm 24 giờ, tiến hành mổ lấy gan và não ñể ñịnh lượng MDA, - Lô ñối chiếu: cho chuột uống Vitamin E hàng ngày với liều 1g/kg trong 6 ngày, sau ñó tiêm phúc mô dung dịch dầu, Sau khi tiêm 24 giờ, tiến hành mổ lấy gan và não ñể ñịnh lượng MDA, * Nhóm bệnh lý (tiêm CCl4): - Lô ñối chứng: cho chuột uống nước cất hàng ngày trong 6 ngày, sau ñó tiêm phúc mô dung dịch CCl4 5% pha trong dầu (0,5g/kg thể trọng), Sau khi tiêm 24 giờ, tiến hành mổ lấy gan và não ñể ñịnh lượng MDA, - Lô thử: chuột ñược uống các cao thử nghiệm hàng ngày với liều 200mg/kg trong 6 ngày, sau ñó tiêm phúc mô dung dịch CCl4 5% pha trong dầu, Sau khi tiêm 24 giờ, tiến hành mổ lấy gan và não ñể ñịnh lượng MDA, - Lô ñối chiếu: cho chuột uống Vitamin E hàng ngày với liều 1g/kg trong 6 ngày, sau ñó tiêm phúc mô dung dịch CCl4 5% pha trong dầu, Sau khi tiêm 24 giờ, tiến hành mổ lấy gan và não ñể ñịnh lượng MDA, * Số chuột mỗi lô: n = 10 Xác ñịnh hàm lượng MDA trong tổ chức gan hay não: - Xác ñịnh hàm lượng MDA trong não: Tách não chuột và nghiền ñồng thể trong dung dịch ñệm Phosphate theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt ñộ 0-50C, Lấy 1ml dung dịch ñồng thể trên thêm 1ml dung dịch ñệm Phosphate và ủ ở 370C trong 15 phút, Sau ñó, thêm vào 1ml acid Tricloacetic 10%, ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid Thiobarbituric 0,8% ở 1000C trong 15 phút và ño màu ở bước sóng 532nm, - Xác ñịnh hàm lượng MDA trong gan: Tách gan chuột và nghiền ñồng thể trong dung dịch KCl 1,15% theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt ñộ 0-50C, Lấy 2ml dung dịch ñồng thể trên thêm 1ml ñệm Tris 25mM và ủ ở 370C trong 60 phút, Sau ñó, thêm vào 1ml acid Tricloacetic 10%, ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid Thiobarbituric 0,8% ở 1000C trong 15 phút và ño màu ở bước sóng 532nm, Tính toán kết quả: - Hàm lượng MDA trong các mẫu thử (nmol/ml) ñược tính theo công thức: Cthử = (ODthử / ODchuẩn) ×Cchuẩn Trong ñó: OD: mật ñộ quang C:hàm lượng MDA (nmol/ml) - Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) ñược tính theo công thức: HTCO (%) = [(CMDAchứng - CMDAthử ) / CMDAchứng] ×100, Khảo sát tác dụng hạ cholesterol [8]: Định lượng cholesterol trong máu chuột trước thí nghiệm, Cho chuột uống cholesterol 150mg/kg trong 10 ngày, Sau ñó ñịnh lượng lại cholesterol, Chia chuột thành 3 lô: + Lô ñối chứng: uống nước cất, + Lô thử 1: uống cao lá Đinh lăng liều 200mg/kg, + Lô thử 2: uống cao lá Đinh lăng liều 500mg/kg, Cho chuột uống thuốc liên tục trong 2 tháng, sau ñó lấy máu ñịnh lượng lại cholesterol So sánh mức ñộ tăng cholesterol giữa các lô, Nếu thuốc có tác dụng hạ cholesterol thì mức ñộ tăng cholesterol của lô thử thuốc sẽ thấp hơn lô ñối chứng, Xác ñịnh hàm lượng cholesterol trong huyết thanh chuột: máy xét nghiệm sinh hóa Bravo Plus tại Phòng thí nghiệm Y Dược học cổ truyền – ĐH Y Dược Tp. HCM, Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm [1]: Dùng chương trình MS-Excel trên máy tính ñể: Loại các giá trị bất thường; Xác ñịnh các giá trị thống kê mô tả M và S; Phân tích Anova 1 yếu tố; So sánh giá trị trung bình có dữ liệu tương ứng từng cặp “t-Test: Paired Two Sample for Mean”; So sánh giá trị trung bình có phương sai khác nhau “t-Test: Two Sample Assuming Unequal Variances”, Ký hiệu thống kê dùng trong các bảng biểu: *, # :khác biệt có ý nghĩa thống kê với ñộ tin cậy 95%, KẾT QUẢ Tác dụng chống oxy hóa của các mẫu dựa trên hàm lượng MDA trong não chuột Bảng 1: Tác dụng chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu dựa trên hàm lượng MDA trong não chuột, Lô Liều uống (mg/kg) Hàm lượng MDA (nmol/ml) HTCO(% ) Đối chứng 0 20,75 ± 2,41 Cao lá 200 20,1 ± 0,625 CCl4 - Cao lá 500 20,52 ± 0,925 Đối chứng 0 25,75 ± 1,41# CCl4 + Cao lá 200 20,88 ± 0,39 * 18,91 98 Cao lá 500 23,5 ± 1,37 * 8,74 Đối chứng 0 20,75 ± 2,41 CCl4 - Vitamin E 1g/kg 19,5 ± 0,8 6,02 Đối chứng 0 25,75 ± 1,41# CCl4 + Vitamin E 1g/kg 19,9 ± 0,55 * 25,82 * P<0,05: so sánh giữa lô thử với lô ñối chứng tương ứng, # P< 0,05: so sánh giữa lô ñối chứng bệnh lý với lô ñối chứng bình thường, 0 5 10 15 20 25 30 Ñoái chöùng Cao laù 200mg/kg Cao laù 500mg/kg Vitamin E 1g/kg Haøm löôïng MDA (nM/ml) ôû naõo chuoät CCL4 - CCL4 + Hình 1: Tác dụng chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu dựa trên hàm lượng MDA trong não chuột, - Kết quả cho thấy có sự tăng ñạt ý nghĩa thống kê hàm lượng MDA trong não ở lô ñối chứng bệnh lý so với lô ñối chứng bình thường, Điều này cho thấy CCl4 có thể ñã tác ñộng như một stress oxy hóa lên não thể hiện qua việc làm tăng quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào não, - Cao lá Đinh lăng ở liều 200mg/kg duy trì ở mức bình thường hàm lượng MDA trong não các chuột bị gây tăng hàm lượng MDA, Hình 2: Hoạt tính chống oxy hóa ở não của các mẫu nghiên cứu, Nhận xét: - Hoạt tính chống oxy hóa ở não của mẫu cao liều 200mg/kg có tác dụng cao hơn so với liều 500mg/kg, - Tác dụng các mẫu cao này vẫn còn thấp hơn so với Vitamin E, một chất chống oxy hóa ñiển hình, Tác dung chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu dựa trên hàm lượng MDA trong gan chuột Bảng 2: Tác dụng chống oxy hóa của các mẫu dựa trên hàm lượng MDA trong gan chuột. Lô Liều uống (mg/kg) Hàm lượng MDA (nmol/ml) HTCO (%) Đối chứng 0 13,72 ± 0,04 Cao lá 200 13,7 ± 0,7 CCl4 - Cao lá 500 13,7 ± 0,325 Đối chứng 0 16,9 ± 0,18# Cao lá 200 14,1 ± 0,17 * 16,56 CCl4 + Cao lá 500 15,8 ± 0,3 6,5 Đối chứng 0 13,72 ± 0,04 CCl4 - Vitamin E 1g/kg 13,4 ± 0,7 2,33 CCl4 + Đối chứng 0 16,9 ± 0,18 * P<0,05: so sánh giữa lô thử với lô ñối chứng tương ứng, # P< 0,05: so sánh giữa lô ñối chứng bệnh lý với lô ñối chứng bình thường, Hoạt tính chống oxy hóa ở não chuột (%) 0 5 10 15 20 25 30 Cao lá 200mg/kg Cao lá 500mg/kg Vitamin E 99 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ñoái chöùng Cao laù 200mg/kg Cao laù 500mg/kg Vitamin E 1g/kg Haøm löôïng MDA (nM/ml) ôû gan chuoät CCL4 - CCL4 + Hình 3: Tác dụng chống oxy hóa của các mẫu dựa trên hàm lương MDA trong gan chuột. - Kết quả cho thấy có sự tăng ñạt ý nghĩa thống kê hàm lượng MDA trong gan ở lô ñối chứng bệnh lý so với lô ñối chứng bình thường - Cao lá ở liều 200mg/kg duy trì ở mức bình thường hàm lượng MDA trong gan các chuột bị gây tăng hàm lượng MDA, Hình 4: Hoạt tính chống oxy hóa ở gan của các mẫu nghiên cứu, Nhận xét: - Hoạt tính chống oxy hóa ở gan của mẫu cao ở liều 200mg/kg cũng thể hiện tác dụng cao hơn so với liều 500mg/kg, - Tác dụng các mẫu cao này vẫn còn thấp hơn so với Vitamin E, Tác dụng hạ cholesterol của các mẫu nghiên cứu Bảng 3: Hàm lượng cholesterol của các mẫu nghiên cứu Nồng ñộ cholesterol (mmol/L) Lô Trước TN Sau mô hình Sau ñiều trị Chứng 4,19 ± 0,17 7,8 ± 0,72 7,67 ± 1,21 Cao lá (200mg/kg) 3,95 ± 0,52 7,76 ± 1,02 6,28 ± 1,025# Cao lá (500mg/kg) 4,21 ± 0,49 7,84 ± 1,04 7,11 ± 1,27# # P< 0,05: so sánh giữa các lô với lô ñối chứng trước và sau ñiều trị 2 tháng 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Chứng Cao lá 200mg/kg Cao lá 500mg/kg Hàm lượng cholesterol (mmol/L) trước TN Sau gây MH Sau ñiều trị 2 tháng Hình 5: So sánh hàm lượng cholesterol giữa các mẫu. Bảng 4: Tỷ lệ giảm hàm lượng cholesterol của các mẫu sau ñiều trị, Lô Số súc vật (n) % giảm cholesterol (sau - trước ñiều trị) Chứng 10 1,66 Cao lá liều 200mg/kg 10 17,36 Cao lá liều 500mg/kg 10 9,31 Hoạt tính chống oxy hóa ở gan chuột (%) 0 5 10 15 20 25 Cao lá 200mg/kg Cao lá 500mg/kg Vitamin E 100 Hình 6: Tỷ lệ giảm hàm lượng cholesterol của các mẫu sau ñiều trị. Nhận xét: - So với lô chứng trong cùng ñiều kiện các mẫu cao lá Đinh lăng ở liều 200mg/kg, 500mg/kg làm giảm nồng ñộ cholesterol trong máu chuột có ý nghĩa thống kê với p<0,05, - Mẫu cao ở liều 200mg/kg có khả năng giảm hàm lượng cholesterol cao hơn so với liều 500mg/kg, KẾT LUẬN - Mẫu cao lá Đinh lăng ở liều 200mg/kg có tác dụng chống oxy hóa cũng như tác dụng hạ cholesterol chuột nhắt ñược gây bệnh lý ñạt ý nghĩa thống kê ở mức 95%, Và ñều có tác dụng cao hơn so với liều 500mg/kg, - Một trong những cơ chế của tác dụng chống oxy hóa là do cấu trúc steroid ức chế sự tạo thành MDA trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, Hợp chất saponin của cây Đinh lăng cũng có cấu trúc steroid thuộc nhóm acid oleanoid nên cũng có thể có cùng cơ chế tác dụng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS-Excel, NXB Giáo dục, tr. 29-63. 2. Đỗ Tất Lợi (1986), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội, tr. 268. 3. Nguyeãn Thò Thu Höông, Löông Kim Bích, Nguyeãn Thôùi Nhaâm (2001), Taùc duïng döôïc lyù cao toaøn phaàn chieát xuaát töø reãõ vaø laù Ñinh laêng( Polyscía fruticosa L,Harms, Araliacea), Coâng trình nghieân cöùu khoa hoïc 1987-2000, Vieän Döôïc Lieäu, NXB Khoa Hoïc vaø Kyõ Thuaät, tr. 241-244. 4. Nguyeãn Thò Thu Höông, Nguyeãn Thò AÙnh Nhö (2004), “Nghieân cöùu taùc duïng baûo veä gan cuûa Ñinh laêng döïa treân cô cheá taùc duïng choáng oxy hoaù”, Taïp chí Döôïc lieäu, 6(1), tr 25 -27. 5. Nguyeãn Lieâm, Trieäu Duy Vieät, Ñoã Vaên Bình (1999), “ Böôùc ñaàu nghieân cöùu taùc duïng choáng oxy hoùa in-vitro cuûa moät soá caây thuoác Vieät Nam”, Taïp chí Döôïc lieäu, taäp 4, soá 3/1999, tr 83-87. 6. Nguyeãn Thu Haèng, Phaïm Thanh Kyø, Traàn Vaân Hieàn, (1998), “Thaêm doø taùc duïng choáng oxy hoùa cuûa flavonoid chieát töø tieáp coát thaûo Sambucus Chinensis Lind L,”, Taïp chí döôïc lieäu, taäp 3, soá 4/1998. 7. Leâ Ngoïc Kính, Löông Vaên Duõng (2008),”Taùc duïng haï cholesterol cuûa dòch chieát töø thaân reã caây raùy”, Taäp san thoâng tin Y Döôïc – ÑH Y Döôïc Hueá, 03/2008. 8. Vieän Döôïc lieäu (2006), Phöông phaùp nghieân cöùu taùc duïng döôïc lyù cuûa thuoác töø Döôïc thaûo, Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät Haø noäi, tr. 286-293. 9. Võ Xuân Minh và các cộng sự, (1991), Góp phần nghiên cứu về thành phần hóa học và các dạng bào chế cây Đinh lăng, Tạp chí Dược học, Bộ Y tế, số 3. Tỷ lệ giảm cholesterol sau ñiều trị (%) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Chứng Cao lá 200mg/kg Cao lá 500mg/kg