Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và độc tính của cao chiết khổ qua - Đậu bắp trên chuột nhắt trắng

91 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT VÀ ĐỘC TÍNH CỦACAO CHIẾT KHỔ QUA - ĐẬU BẮP TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyễn Thị Nguyên Sinh∗, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mục tiêu: Đánh giá khả năng hạ ñường huyết của cao chiết Khổ qua – Đậu bắp trên thực nghiệm. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện trên chuột nhắt trắng, trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 phái, trọng lượng trung bình 20 ± 2g, ñược gây tăng tăng ñường huyết bởi Alloxan. Kết quả: Cao chiết Khổ qua – Đậu bắp (liều uống 60g/kg/ngày) giảm khoảng 40% glucose (P<0,01) so với lô không ñiều trị. LD50 ñường uống của cao chiết Khổ qua-Đậu bắp trên chuột nhắt trắng là 120,2 g/kg thể trọng. Sau 2 tháng sử dụng theo ñường uống trên chuột nhắt, cao chiết Khổ qua-Đậu bắp làm giảm 50% số lượng bạch cầu và chỉ số creatinin. Kết luận: Cao chiết Khổ qua – Đậu bắp (liều uống 60g/kg/ngày) có tác dụng giảm khoảng 40% glucose trên chuột nhắt trắng tăng ñường huyết do Alloxan và cho tác dụng gần như tương ñương so với Daonil. Từ khóa: Khổ qua, Đậu bắp, Alloxan, tiểu ñường, chuột nhắt. ABSTRACT RESEARCH ON THE HYPOGLYCEMIA EFFECT AND THE TOXICITY OF MOMORDICA CHARANTIA - ABELMOSCHUS ESCULENTUS EXTRACT ON MICE Nguyen Thi Nguyen Sinh, Nguyen Phuong Dung Objectives: This study in order to investigate the acute and sub-chronic toxicity of Momordica charantia- Abelmoschus esculentus extracts on mice as well as the hypoglycemic effect on diabetic mice - induced Alloxan. Methods: This study was carried out on Albino swiss mice were given Daonil and Momordica charantia- Abelmoschus esculentus extracts on Alloxan- induced diabetic mice Results: The LD50 of Momordica charantia- Abelmoschus esculentus extracts is 120.2 g/kg body weight of mice. Amount of leucocyte and serum creatinine of mice were decreased about 50% after 2 months of administration. Momordica charantia- Abelmoschus esculentus extracts (60g/kg per day) reduced glycemia of mice about 40%. Conclusions: Momordica charantia- Abelmoschus esculentus extract (60g/kg per day) reduced glycemia of mice about 40%, and this effect is similar to Daonil. The LD50 of Momordica charantia- Abelmoschus esculentus extract is 120.2 g/kg body weight of mice. Amount of leucocyte and level serum creatinine of mice were decreased about 50% after 2 months of administration. Key words: Momordica charantia, Abelmoschus esculentus, Alloxan, diabetes, mice. ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo ñường týp 2 ñang có khuynh hướng gia tăng trong xã hội phát triển. Cùng với việc áp dụng chế ñộ ăn hợp lý, sử dụng thuốc ñể kiểm soát ñường huyết là việc mà bệnh nhân ñái tháo ñường phải áp dụng gần như suốt ñời. Các thuốc ñiều trị bệnh này càng ngày càng phong phú mà thuốc nguồn gốc thảo dược ñang ñược quan tâm do ít gây tác dụng so với các hóa dược. Giới chuyên môn vẫn không ngừng tìm kiếm những chế phẩm ñiều trị bệnh ñái tháo ñường có nguồn gốc thiên nhiên từ nguồn nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền, dạng sử dụng tiện lợi ñể người bệnh có thêm nhiều chọn lựa phù hợp với tình hình bệnh tật và khả năng kinh tế. Trong ñó, Khổ qua và Đậu bắp là 2 dược liệu dược ñã ñược nhiều công trình khoa học nghiên cứu và về tác dụng hạ ñường huyết [4], [5], [6], [7], [8], [11], [12], [14]. Tuy nhiên trong thí nghiệm trên súc vật, ñộc tố và liều chết ñã ñược báo cáo khi cao chiết Khổ qua ñược tiêm bằng dường tĩnh mạch và qua màng bụng (cao chiết từ quả và hạt Khổ qua ñược chứng minh có ñộc tố cao hơn trong lá và phần cây trên mặt ñất) [6], [13]. Ngoài ra, chưa ghi nhận ñược trường hợp ngộ ñộc do dùng Đậu bắp, Đậu bắp hoàn toàn không ñộc, không phải kiêng, không gây tác dụng phụ [9], [10], [13].Với mục ñích tìm kiếm những chế phẩm thiên nhiên an toàn, rẻ tiền, có hiệu quả ñiều trị bệnh ñái tháo ñường, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một chế phẩm có tác dụng hạ ñường huyết từ cao chiết kết hợp thân lá Khổ qua và Đậu bắp ñể ñánh giá khả năng hạ ñường huyết trên chuột nhắt trắng tăng ñường huyết bởi Alloxan so với lô chuột chỉ uống cao chiết Khổ qua, hoặc Đậu bắp, ñồng thời khảo sát ñộc tính cấp và bán trường diễn của cao chiết trên chuột nhắt trắng. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ∗ Khoa Y học Cổ truyền Tp. HCM Địa chỉ liên hệ: DS. Nguyễn Thị Nguyên Sinh ĐT: 01672893050 Email: ntnsinh@yahoo.com 92 Nguyên liệu: - Thân và lá Khổ qua (K): mua của cơ sở Vĩnh Sanh - Thân và lá Đậu bắp (Đ): thu hái ở xã Quy ñức, huyện Bình chánh, Tp. HCM Quá trình chuẩn bị cao chiết: - 2 kg thân lá Khổ qua ñược làm ẩm và chiết kiệt với 18L cồn 70°, cô dịch chiết thu hồi dung môi ñến khi chỉ còn 2L, cao chiết cuối cùng thu ñược là cao chiết Khổ qua 1: 1 (1ml cao chứa chất chiết ñược từ 1g nguyên liệu ban ñầu) - 2 kg thân lá Đậu bắp ñược làm ẩm và chiết kiệt với 18L cồn 70°, cô dịch chiết thu hồi dung môi ñến khi chỉ còn 2L, cao chiết cuối cùng thu ñược là cao chiết Đậu bắp 1:1 (1ml cao chứa chất chiết ñược từ 1g nguyên liệu ban ñầu) - Kết hợp cao chiết Khổ qua (1:1) và cao chiết Đậu bắp (1:1) ñồng thể tích ñể có ñược cao chiết KĐ. Thuốc ñối chứng: Daonil (Glibenclamid) Hóa chất gây mô hình tăng ñường huyết thực nghiệm: Alloxan tetrahydrat (Sigma) Súc vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng, trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 phái, trọng lượng trung bình 20 ± 2g, mua tại Viện Pasteur TPHCM, nuôi trong ñiều kiện ổn ñịnh về dinh dưỡng. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ ñường huyết trên chuột nhiễm Alloxan [1],[2],[15] - Chuột nhắt ñược ổn ñịnh 3 ngày trước khi thử nghiệm. Cho chuột nhịn ñói 12 giờ trước khi thử nghiệm. Xác ñịnh hàm lượng glucose huyết trước thử nghiệm - Chia ngẫu nhiên chuột thử nghiệm thành 3 lô, mỗi lô 10 chuột - Lô C (chuột bình thường): tiêm tĩnh mạch ñuôi dung dịch NaCl 0,9%, thể tích 0,1ml/10g thể trọng. - 20 chuột còn lại: tiêm tĩnh mạch ñuôi dung dịch Alloxan nồng ñộ 2% trong NaCl 0,9%, thể tích 0,1ml/10g thể trọng - 2 giờ sau khi tiêm Alloxan, lấy máu, xác ñịnh hàm lượng glucose, chọn những chuột có kết quả xét nghiệm glucose trên 220mg%, chia ngẫu nhiên thành 3 lô: - Lô BL: cho uống nước cất 0,2ml/10g thể trọng, 2 lần mỗi ngày - Lô Daonil: cho uống Daonil (Glibenclamid) pha trong nước cất, liều 0,3mg/kg/ngày,2 lần mỗi ngày. - Lô KĐ: cho uống cao chiết Khổ qua – Đậu bắp pha trong nước cất, liều dự kiến 60g/kg/ngày, 2 lần mỗi ngày - Cho chuột uống thuốc liên tục 3 tuần, ñồng thời với lô chuột C (bình thường) uống nước cất. - Chỉ tiêu theo dõi (mỗi tuần): thể trọng, glucose máu, glucose niệu, ceton niệu, số chuột chết trong thời gian thử nghiệm Nghiên cứu ñộc tính cấp của cao chiết KĐ [2],[3],[15] - Chuẩn bị cao thuốc: Cô cao chiết KĐ (1:1) thành cao KĐ (5:1) - Súc vật thử nghiệm: Chuột nhắt trắng, trưởng thành, khỏe mạnh, cả 2 phái, trọng lượng trung bình 20 ± 2g, mua tại Viện Pasteur Tp. HCM, nuôi trong ñiều kiện ổn ñịnh về dinh dưỡng. - Chuột nhắt ñược ổn ñịnh 3 ngày trước khi thử nghiệm. Cho chuột nhịn ñói 12 giờ trước khi thử nghiệm. - Nghiên cứu sơ khởi: Khởi ñầu từ liều cao nhất có thể qua ñược kim cho uống. Xác ñịnh LD0 (liều tối ña không gây chết súc vật thử nghiệm nào) và liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100% súc vật thử nghiệm) - Nghiên cứu xác ñịnh: chuột ñược chia thành 6 lô, mỗi lô ít nhất 6 con, cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0 và LD100. Ở những liều gần LD50 tăng số lượng chuột ñể có ñược kết quả chính xác hơn. Quan sát chuột trong 24 giờ sau khi dùng thuốc, ghi nhận các phản ứng xảy ra trên chuột và số lượng chuột sống, chết ở mỗi lô. Theo dõi chuột còn sống sàu 14 ngày kể từ ngày dùng thuốc. Giải phẫu ñại thể những chuột còn sống và những chuột chết sau khi cho uống thuốc. Tính LD50 (nếu có) bằng công thức của Karber- Behrens. Nghiên cứu ñộc tính bán trường của cao chiết KĐ [2] - Chuột ñược chia ngẫu nhiên thành 2 lô: Lô chứng và lô thử, mỗi lô 10 con, có trọng lượng ban ñầu tương ñương nhau (20 ± 2g). Mỗi ngày vào giờ nhất ñịnh (8:00 sáng) cho mỗi chuột uống thuốc thử nghiệm liên tục trong 60 ngày: - Chuột lô chứng (C): uống nước cất 0,2ml/ 10g thể trọng - Chuột lô thử (KĐ): uống cao chiết KĐ (1:1) liều 0,375g/ kg thể trọng, thể tích 0,2ml/ 10g thể trọng - Chuột ở cả 2 lô chứng và thử ñược nuôi trong cùng ñiều kiện và theo dõi trọng lượng mỗi tuần. Thử nghiệm ñược tiến hành trong 2 tháng. Sau thử nghiệm chuột ñược lấy máu ñể xét nghiệm các chỉ tiêu: 93 - Huyết học: số lượng hồng cầu, bạch cầu, Hemoglobin, Hematocrit, thời gian ñông máu, thời gian chảy máu. - Sinh hóa: GOT, GPT, Glucose, Creatinin, BUN - Chức năng gan, thận. KẾT QUẢ Tác dụng hạ ñường huyết của dịch chiết Khổ qua – Đậu bắp trên chuột tăng ñường huyết bởi Alloxan Trước thử nghiệm: Dựa vào kết quả phân tích thống kê Anova, glucose máu của các lô trước thử nghiệm khác nhau không có ý nghĩa. Cho thấy tính tương ñối ñồng nhất của các lô chuột thí nghiệm. Sau khi gây mô hình chuột bị tiểu ñường bằng Alloxan Bảng 1: Sự thay ñổi Glucose máu của chuột ở các lô trong 3 tuần thử nghiệm Sau gây tiểu ñường bằng Alloxan Lô Trước TN Ngày 1 Ngày 8 Ngày 15 Ngày 22 C 114 ± 11,53 100% 114 ± 11,53 100% 88,5 ± 32,9 77,63% 117,8±10,63 103,3% 96,5 ± 13,63 84,65% BL 117 ± 16,15 100% 160,5 ± 17,3 137,12% 139 ± 4,61 118,80% 148 ± 18,45 126,50% 144 ± 6,91 123,08% Daonil 107,5±44,98100% 143 ± 13,84 133,02% 128,5±10,38 119,53% 99,5 ± 38,05 92,56% 94,5 ± 17,3 87,91% KĐ 96 ± 39,20 100% 144,5 ± 21,91 150,52% 124,5 ± 3,46 129,69% 110 ± 4,62 114,58% 92 ± 9,23 95,83% Hình 1: Sự thay ñổi glucose máu của chuột ở các lô trong 3 tuần thử nghiệm Sự thay ñổi Glucose máu của lô chứng sau 3 tuần thử nghiệm khác nhau không có ý nghĩa, (p<0,01). Như vậy, ñiều kiện môi trường và chế ñộ nuôi dưỡng không ảnh hưởng ñến lượng glucose máu của chuột thí nghiệm. Glucose máu trong ngày thử nghiệm ñầu tiên của các lô bệnh lý, uống Daonil, KĐ, cao hơn so với glucose máu của lô chứng có ý nghĩa thống kê, (p<0,01), chứng tỏ chuột ñáp ứng tốt với tác nhân gây tăng ñường huyết là Alloxan. Glucose máu của lô chuột uống Daonil bắt ñầu giảm vào ngày thứ 8 và trở về giới hạn bình thường vào ngày thứ 15 và duy trì ở mức này ñến ngày 22. Chứng tỏ hiệu quả của thuốc ñối với mô hình tăng ñường huyết do Alloxan trên chuột nhắt trắng. Glucose máu của chuột ở 3 lô uống dịch chiết KĐ và Daonil giảm ñáng kể (có ý nghĩa thống kê) sau 3 tuần thử nghiệm. Ngoài ra, tại từng thời ñiểm sau 8 ngày, 15 ngày và 22 ngày thử nghiệm, glucose máu của chuột ở các lô uống Daonil, KĐ, giảm có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (P<0,05). Nghiên cứu ñộc tính cấp: Kết quả quan sát: trong vòng 24 giờ sau khi uống thuốc, các biểu hiện ở chuột: Chuột gãi mõm, co giật hoặc ñứng im sau vài phút. Chuột chết trong thời gian 20 – 180 phút. 94 Theo công thức Karber-Behrens, tính ñược LD50 của cao chiết KĐ (5:1) ñường uống trên chuột nhắt trắng là 120,2 g/kg thể trọng. Nghiên cứu ñộc tính bán trường diễn: Thời gian máu chảy- máu ñông giữa lô chứng và lô thử khác nhau có ý nghĩa, (P<0,01). Như vậy KĐ rút ngắn khoảng 50% thời gian máu chảy và khoảng 20% thời gian máu ñông. Công thức máu ñược phân tích bằng máy xét nghiệm sinh hóa Eos Bravo Plus tại Phòng thí nghiệm khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. Các chỉ số hồng cầu, Hemoglobin và tiểu cầu giữa 2 lô khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê. Số bạch cầu ở lô thử giảm ñáng kể (khoảng 50%) so với lô chứng, (P<0,05). Glucose máu giữa lô chứng và lô thử khác nhau không có ý nghĩa. Các chỉ số sinh hóa gan (GOT và GPT) và chỉ số BUN giữa 2 lô khác nhau không có ý nghĩa. Chỉ số Creatinin huyết thanh của lô thử giảm 50% so với lô chứng, khác nhau có ý nghĩa, (P<0,01). Cuối thí nghiệm, mổ lấy toàn bộ gan, thận cố ñịnh trong formol 10%, gửi làm xét nghiệm mô học tại Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh. Theo kết quả phân tích mô học, hình ảnh tế bào gan của lô thử không khác biệt so với lô chứng. Tuy nhiên, hình ảnh tế bào thận của lô thử có bất thường (viêm thận kẽ, sung huyết) là 2/4 so với lô C (1/4). Bảng 2: So sánh các chỉ số huyết học và xét nghiệm sinh hóa gan, thận giữa lô chứng và lô uống cao chiết KĐ sau 2 tháng thử nghiệm Các chỉ số huyết học Sinh hóa gan Sinh hóa thận Chỉ số Lô Bạch cầu (× 103/mm3) Hồng cầu (× 106/mm3) Hemoglobin (g/dl) Tiểu cầu (× 103/mm3) Glucose máu (mg/dl) SGOT (U/L) SGPT (U/L) BUN (mg/dl) Creatinin huyết thanh (mg/dl) C (n =5) 21,06 ± 10,09 100% 7,36 ± 1,73 100% 10,94 ± 2,38 100% 395,8 ± 78,82 100% 154,2 ± 50,36 100% 49,06 ± 13,06 100% 45,52 ± 7,90 100% 42,88 ± 8,25 100% 0,98 ± 0,20 100% KĐ (n =5) 11,26 ± 5,03 53,47% 9,09 ± 1,04 123,51% 12,96 ± 1,91 118,46% 472,4 ± 62,38 119,35% 148,8 ± 14,31 96,50% 40,84 ± 6,65 83,25% 51,42 ± 5,65 112,96% 34,22 ± 6,03 79,80% 0,49 ± 0,06 50% KẾT LUẬN Trên mô hình chuột nhắt trắng tăng ñường huyết bởi Alloxan, cao chiết KĐ ở liều 60g/kg/ngày uống trong 21 ngày có tác dụng giảm khoảng 40% glucose huyết có ý nghĩa thống kê (P<0,01) và có hiệu quả hạ ñường huyết tương ñương với thuốc Daonil liều 0,3mg/kg/ngày. Đã xác ñịnh LD50 ñường uống của cao chiết KĐ là 120,2 g/kg thể trọng. Khi sử dụng dài ngày, cao chiết KĐ không ảnh hưởng ñến một số chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, hemoglobin, tiểu cầu), ngoại trừ chỉ số bạch cầu (giảm 50%). Thời gian máu chảy giảm khoảng 50%, thời gian máu ñông giảm khoảng 20%. Glucose huyết, GOT, GPT, BUN không khác biệt so với lô chứng, riêng chỉ số creatinin giảm 50%, P<0,01). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bo Ahren, Goran Sundkvist (1995), Long-Term Effects of Alloxan In Mice, International Journal of Pancreatology, vol.17, n02, pp.197-201. 2. Bộ Y tế (1996), Quy chế ñánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc cổ truyền, (Ban hành kèm theo quyết ñịnh số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 của Bộ trưởng Bộ Y tế) Tạp chí Dược học số 241, tr 3 – 9. 3. Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác ñịnh ñộc tính cấp của thuốc, NXB Y học Hà nội, trang 50- 51. 4. Grover J. K. and Yadav S. P.(2004), Pharmacological actions and potential uses of Momordica charantia: a review, Journal of Ethnopharmacology, Volume 93, Issue 1, July 2004, pp. 123-132. 5. John S A, Mini C (Olericulture Dep, Coll of Agric KeralaAgric Univ, Kau P.O., Thrissur-680 656), Biological efficiency ofintercropping in okra (Abelmoschus esculentus (L.) Moench). J tropAgric 2005, 43(1-2), pp. 33-36. 6. Liu I Min, Shorong Shii Liou, Ting Wei Lan, Feng Lin Hsu, Juci Tang Cheng (2005), Myricetin as the active principle ofAbelmoschus moschatus to lower plasma glucose in Streptozotocin-induced diabetic rats, Planta Med, 71 (7),pp.617-621. 95 7. Liu IM, Tzeng TF, Liou SS, Lan TW(2007), Improvement of insulin sensitivity in obese Zucker rats by myricetin extracted from Abelmoschus moschatus, Planta Med. 2007 Aug;73(10):pp.1054- 60. 8. Nguyễn Phương Dung (2001), Thăm dò tác dụng hạ ñường huyết của cây Đậu bắp trên thực nghiệm, Y học Tp.HCM, Hội nghị KHKT Khoa YHCT, trường ĐH Y Dược Tp. HCM, 4(5), tr. 19- 21. 9. Nguyễn Phương Dung, (2002), Nghiên cứu ñộc tính cấp và trường diễn của trà Đậu bắp, Y học Tp. HCM, Hội nghị KHKT Khoa YHCT, trường ĐH Y Dược Tp.HCM, 4(6), tr. 5-7. 10. Nguyễn Thị Hạnh, Mai Phương Mai, (2008), Đánh giá tác ñộng hạ Glucose huyết và ñộc tính của cây Đậu bắp Abelmoschus esculentus L. Malvaceae trên mô hình thực nghiệm, Tạp chí Y học Tp.HCM, tập 12, phụ bản 1, tr.126-129. 11. Reyes B.A.S., Bautista N.D., Tanquilut N.C., Anunciado R.V., Leung A.B., Sanchez G.C., Magtoto R.L.,Castronuevo P., Tsukamura H.and Maeda K.-I.(2006), Anti-diabetic potentials of Momordica charantia and Andrographis paniculata and their effects on estrous cyclicity of alloxan-induced diabetic rats, Journal of Ethnopharmacology, Volume 105, Issues 1-2, 21 April 2006, pp. 196-200. 12. Rekha K B, Reddy M G, Mahavishnan K (Agron Dep, AcharyaNG Ranga Agric Univ, Rajendranagar, Hyderabad-500 030), Nitrogen and water use efficiency ofbhendi (Abelmoschus esculentus L. Moench) as influenced by dripfertigation. J trop Agric 2005, 43(1-2), pp. 43-46. 13. Singh V B.(2005). Genetics of resistance of leaf curl virusand some yield components in Okra (Abelmoschus esculentus (L.)Moench).(Prof S P Singh) Horticulture Dep, Banaras Hindu University, Varanasi. 14. Sridhar M. G.a1 c1, Vinayagamoorthi R.a1, Arul Suyambunathan V. a1, Bobby Z. a1 and Selvaraj N.a1, (2008), Bitter gourd (Momordica charantia) improves insulin sensitivity by increasing skeletal muscle insulin-stimulated IRS-1 tyrosine phosphorylation in high-fat-fed rats, British Journal of Nutrition, 99: pp. 806-812 Cambridge University Press. 15. Viện Dược liệu, (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà nội, tr. 286-293.