Nghiên cứu tác dụng kháng virus Herpes Simplex (HSV)của các Diterpen Lacton từ xuyên tâm liên

142 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV)CỦA CÁC DITERPEN LACTON TỪ XUYÊN TÂM LIÊN Hứa Thị Như Cẩm∗, Trần Công Luận*, Huỳnh Thị Kim Loan∗∗, Trần Thu Hoa∗∗∗ TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát khả năng kháng HSV của các diterpen lacton chiết xuất từ cây Xuyên tâm liên nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược có khả năng kháng HSV. Phương pháp: Nhuộm xanh methylen và ño mật ñộ quang ở bước sóng 620 nm ñược dùng ñể xác ñịnh tính ñộc tế bào của chất thử ñối với tế bào Vero và khảo sát khả năng kháng virus bằng cách so sánh tế bào Vero không nhiễm virus và tế bào Vero nhiễm virus. Hoạt tính kháng virus biểu hiện theo hệ số chọn lọc SI là giá trị CC50/ IC50, với SI >10 là có ý nghĩa trong trị liệu. Kết quả và kết luận: Andrographolid, neoandrographolid và dehydroandrographolid ñều có khả năng sử dụng làm thuốc trị liệu; với hệ số SI ñối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong khoảng từ 12,8 ñến 63, ngoại trừ dehydroandrographolid trên HSV-2. Từ khoá: Diterpen lacton, andrographolid, neoandrographolid, dehydrographolid, HSV, CPE ABSTRACT STUDY ON ANTI-HERPES SIMPLEX VIRUS ACTIVITY OF DITERPEN LACTONES ISOLATED FROM ANDROGRAPHIS PANICULATA (BURM.F.) WALL. EX NEES IN VITRO Hua Thi Nhu Cam, Tran Cong Luan, Huynh Thi Kim Loan, Tran Thu Hoa Background and aims:In order to study antiherpetic activity of diterpenlacton extracted from Andrographis paniculata in vitro to replace the currently antiviral agents that cause the adverse side effects associated with long- term therapy as well as and restrict the sources of resistant virus. Methods:Methylene blue staining method for CPE inhibition assay and for evaluation the effects of samples on untreated Vero cells or Vero cells infected with HSV-1 or HSV-2. Antiviral activity was finally expressed as a selectivity index (SI), the value of CC50 divided by 50% inhibitory concentration (EC50). Results and conclusion:Andrographolid, neoandrographolid and dehydroandrographolid exhibit a potent antiherpetic activity with the SI of more than 12 to 63, except dehydroandrographolid on HSV-2. Key words: Diterpen lacton, andrographolid, neoandrographolid, dehydrographolid, HSV, CPE ĐẶT VẤN ĐỀ Virus Herpes simplex (HSV) là tác nhân gây bệnh rất thường gặp, gây các bệnh khác nhau từ nhẹ ñến nặng, trong một số trường hợp chúng có thể gây tử vong, ñặc biệt ở những bệnh nhân tổn thương miễn dịch. Sau nhiễm trùng ban ñầu, HSV sẽ tồn tại trong ký chủ suốt toàn bộ thời gian sống sau ñó. Các ñồng ñẳng nucleosid như acyclovir, penciclovir v.vlà các thuốc duy nhất ñược chính thức phê chuẩn cho ñiều trị nhiễm HSV. Các thuốc này thường có hiệu quả trong ñiều trị nhiễm HSV ban ñầu hoặc là tái nhiễm. Tuy nhiên việc sử dụng tràn lan các thuốc nucleosid ñã làm nảy sinh các chủng HSV ñề kháng với các thuốc tương ñồng, ñặc biệt là ở các bệnh nhân tổn thương miễn dịch. Nhiều quốc gia có chương trình tìm kiếm thuốc mới từ nguồn gốc tự nhiên có tác dụng kháng virus mà ít ñộc. Các nhóm hợp chất tự nhiên có tác dụng trên HSV týp 1 và HSV týp 2 khá ña dạng trong ñó có nhóm diterpen lacton từ Xuyên tâm liên[8]. Hợp chất diterpen lacton có trong Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Wall. ex Nees) ñược chứng minh là có rất nhiều tác dụng chữa bệnh như kháng viêm, giảm ñau, hạ huyết áp, bảo vệ gan, ngừa ñái tháo ñường, kháng virus và chống ung thư,[1, 3, 7 8]. Nhiều chế phẩm chứa hoạt chất từ Xuyên tâm liên ñã ñược sản xuất nhằm phục vụ cho người bệnh. Tuy nhiên nghiên cứu về khả năng kháng HSV của Xuyên tâm liên chưa nhiều, chỉ có một công bố ngắn về khả năng ức chế HSV-1 của các diterpen lacton, bao gồm andrographolid, neoandrographolid, dehydroandrographolid từ Xuyên tâm liên[5]. Đề tài này ñược tiến hành nhằm góp phần tìm ra những loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược ở Việt Nam có khả năng kháng HSV. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu - Cao chiết methanol từ lá Xuyên tâm liên, ñược loại màu (chlorophill) bằng than hoạt tính (Cao loại màu) và 3 diterpen lacton từ Xuyên tâm liên gồm andrographolid (AP), neoandrographolid (NP), dehydroandrographolid (DP) có ñộ tinh khiết > 98% do Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM cung cấp. - HSV týp 1 và týp 2 từ bệnh phẩm ñược phân lập, ñịnh danh và lưu trữ tại Viện Pasteur Tp.HCM. - Nuôi cấy tế bào [2],[6]. Sử dụng dòng tế bào Vero CCL-81 (ATCC). Nuôi cấy tế bào trong môi trường CMRL 5% huyết thanh bào thai bê. Tế bào ñược nhân ñịnh kỳ trong 7 ngày. Tế bào dùng gây nhiễm virus ñược nhân theo tỷ lệ 2 x 105 tế bào/ml và tạo thành một lớp sau 2-3 ngày nhân. ∗ Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM ∗∗ Viện Pasteur Tp. HCM, ∗∗∗ Đại học Y Dược Tp. HCM Địa chỉ liên hệ: TS. Trần Công Luận ĐT: 0903671323 Email: cong luan53@Gamail.com 143 Tạo nguồn HSV chuẩn[6]. HSV ñược gây nhiễm vào tế bào Vero sau khi nhân 2-3 ngày, ủ tế bào ở 370C, quan sát tế bào mỗi ngày, khi tế bào có hiện tượng CPE hoàn toàn, ñem ñông tan băng 3 lần, ly tâm lấy nước nổi, bổ sung huyết thanh bào thai bê 20%, phân chia lượng nhỏ, bảo quản -700C cho ñến khi làm phản ứng. Xác ñịnh TCID50 (Tissue Culture Infective Dose 50%) của hỗn dịch virus [6]. Dựa vào hiện tượng CPE, Xác ñịnh nồng ñộ virus gây chết 50% tế bào theo công thức Karber. Chuẩn bị dịch thử. Cao chiết loại chlorophill (250mg/ml), andrographolid (20mg/ml), dehydroandrographolid (10mg/ml), neoandrographolid (10mg/ml), acyclovir chuẩn (1000µg). Từ các dung dịch trên pha loãng trong môi trường CMRL 5% huyết thanh bào thai bê thành nhiều nồng ñộ ñể khảo sát. Phương pháp nhuộm tế bào bằng xanh methylen [5] Dựa vào sự bắt màu xanh methylen của màng tế bào cho các giá trị OD xác ñịnh. Sau khi tiếp xúc với virus và dịch thử, tế bào trong phiến 96 giếng ñược nhuộm bằng xanh methylen và ño mật ñộ tế bào bằng máy ño mật ñộ quang ở bước sóng 620 nm. Xác ñịnh tính ñộc tế bào của chất thử ñối với tế bào Vero. Cho vô mỗi giếng 100 µl chất thử, mỗi nồng ñộ lặp lại ba lần trên phiến 96 giếng có tế bào Vero ñã phủ kín thành một lớp, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 48 giờ, ñổ bỏ chất không hấp phụ, nhuộm màu bằng xanh methylen và ño mật ñộ quang ở 620nm. Tính nồng ñộ gây ñộc (CC) theo công thức CC = (A – B)/A x 100. Trong ñó A là giá trị OD của chứng tế bào (tế bào không tiếp xúc với chất thử), B là giá trị OD của tế bào ñã ñược tiếp xúc với chất thử. Xác ñịnh nồng ñộ chất thử gây ñộc 50% tế bào (CC50) từ phương trình tuyến tính biểu diễn phần trăm gây ñộc tế bào CC theo nồng ñộ chất thử. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng virus. Cho chất thử tiếp xúc với virus, sau ñó cho xâm nhiễm vào tế bào [4] . Nồng ñộ virus sử dụng ñể khảo sát HSV-1 là 10-2,6 và 10-3,6; HSV-2 là 10-2,7 và 10-3,7. Tính phần trăm ức chế virus của dịch thử theo công thức IC = (C – D)/(A – D) x 100. Trong ñó C là giá trị OD của tế bào tiếp xúc với virus và dược chất, D là giá trị OD của tế bào chỉ tiếp xúc với virus (chứng dương virus), A là giá trị OD của tế bào không tiếp xúc với virus và dịch thử (chứng tế bào). Xác ñịnh nồng ñộ dược liệu ức chế 50% (IC50) sự xâm nhiễm của virus từ phương trình tuyến tính biểu diễn IC ở nồng ñộ virus ñáp ứng tốt nhất với chất thử. Chỉ số chọn lọc (hay Hệ số trị liệu) ñược tính theo công thức SI = CC50/ IC50[6]. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Xác ñịnh hiệu giá virus theo TCID50 Chỉ số TCID50 của virus ñược khảo sát ñể xác ñịnh liều virus gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy trước khi sử dụng virus trong thử nghiệm ñánh giá hoạt tính kháng virus. Kết quả Bảng 1 cho thấy trong 0,1 ml huyền dịch virus HSV-1 và HSV-2 ban ñầu chưa pha loãng chứa lần lượt 104,6 và 104,7 liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50 ñược tính là 10-4,6 và 10-4,7) hay ñộ pha loãng cho CPE 50% của HSV-1 và HSV-2 là 10-4,6 và 10-4,7. Như vậy có thể tiến hành khảo sát khả năng ức chế virus của chất thử với nồng ñộ virus từ 10-2 ñến 10-5 . Bảng 1. Kết quả hiệu giá của chủng virus HSV-1 và HSV-2 TCID50= log [ L- d(S- 0,5)] Virus HSV-1 (S6) HSV-2(S8) L -1 -1 d 1 1 S TCID50 10-4,6/0,1ml 10-4,7/0,1ml Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero của cao chiết (CLM) Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của CLM ñược trình bày trong Bảng 2 và Bảng 3. Hệ số SI trên HSV-1 và HSV-2 của CLM lần lượt là 2,5 và 5,6, cho thấy CLM thể hiện khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2, nhưng chưa có khả năng dùng trong ñiều trị. Bảng 2. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của CLM Nồng ñộ cao loại màu (µg/ml) 97,7 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 CC 0,51 2,4 5,87 7,81 40,06 96,9 IC (10-3,6) 5,4 16,6 33,3 51,3 -454 PT biểu diễn CC y = 0,0323x - 7,5539 R2 = 0,9782 PT biểu diễn IC y = 0,0649x + 2,8691 R2 = 0,9612 2 , 4 10 3 10 9 10 10 10 10 10 10 =+ ++ + 1, 4 10 1 10 10 10 10 10 10 10 10 = ++ ++ 144 CC50 1781,8 IC50 726,2 Hệ số chọn lọc (SI) 2,5 Bảng 3. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của CLM Nồng ñộ cao loại màu (µg/ml) 97,7 195,3 390,6 781,3 1562,5 CC 0,4 2,4 3,9 5,3 40,1 IC (10-3,7) 29,3 36,5 57,4 62,3 -311,1 PT biểu diễn CC y = 0,0326x - 8,615 R2 = 0,9717 PT biểu diễn IC y = 0,0977x + 18,815 R2 = 0,993 CC50 1798 IC50 319,2 Hệ số chọn lọc (SI) 5,6 Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero của andrographolid (AP) Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của AP lần lượt ñược trình bày trong Bảng 4 và Bảng 5. Hệ số SI trên HSV-1 và HSV-2 của AP lần lượt là 2,8 và 12,8, chứng tỏ AP có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2, nhưng chỉ có thể dùng AP trong trị liệu HSV-2. Bảng 4. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của AP Nồng ñộ AP (µg/ml) 7,81 15,62 31,25 62,5 125 250 500 CC 6,96 5,53 3,42 5,75 22,88 96,79 96,91 IC (10-2,6) 12,35 23,23 37,23 52,88 -120,84 -541,96 -542,64 PT biểu diễn CC y = 0,4426x – 19,652 R2 = 0,9503 PT biểu diễn IC y = 0,7098x + 10,63 R2 = 0,9558 CC50 157,4 IC50 55,5 Hệ số chọn lọc (SI) 2,8 Bảng 5. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của AP Nồng ñộ AP (µg/ml) 15,625 31,25 62,5 125 250 CC 6,18 8,39 9,7 10,11 49,23 IC (10-3,7) 43,6 56,6 71,4 91,1 -141,3 PT biểu diễn CC y = 0,3895x – 1,8251 R2 = 0,9696 PT biểu diễn IC y = 0,8281x + 41,395 R2 = 0,9641 CC50 133,1 IC50 10,4 Hệ số chọn lọc (SI) 12,8 Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero của neoandrographolid (NP) Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của NP lần lượt ñược trình bày trong Bảng 6 và Bảng 7. Hệ số SI trên HSV-1 và HSV-2 của AP lần lượt là 22,6 và 63,4 chứng tỏ NP có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2, có thể dùng NP trong trị liệu cả hai loại virus này. Bảng 6. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của NP 145 Nồng ñộ NP (µg/ml) 15,625 31,25 62,5 125 250 CC 0,7 1,6 2,8 6,7 14,8 IC (10-2,6) 62,2 48,5 34,2 12,8 -24,9 PT biểu diễn CC y = 0,0681x – 2,408 R 2 = 0,9594 PT biểu diễn IC y = -0,4297x + 64,603 R 2 = 0,9689 CC50 769,6 IC50 34,0 Hệ số chọn lọc (SI) 22,6 Bảng 7. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của NP Nồng ñộ NP (µg/ml) 15,625 31,25 62,5 125 250 CC 16,5 13,8 17,4 19,7 30,2 IC (10-3,7) 55,8 22,2 14,0 - 35,2 - 78,3 PT biểu diễn CC y = 0,0521x + 13,6 R2 = 0,9638 PT biểu diễn IC y = - 0,7536x +58,351 R2 = 0,9407 CC50 698,7 IC50 11,08 Hệ số chọn lọc (SI) 63,04 Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero của dehydroandrographolid (DP) Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của DP ñược trình bày trong Bảng 8 và Bảng 9. Hệ số SI trên HSV-1 và HSV-2 của DP lần lượt là 22,76 và -54,3, chứng tỏ DP chỉ có khả năng ức chế HSV-1 và có thể dùng DP trong trị liệu virus này. Bảng 8. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của DP Nồng ñộ DP (µg/ml) 7,81 15,62 31,25 62,5 125 CC 6,43 11,32 15,16 27,18 96,82 IC (10-2,6) 40,2 28,7 - 40,1 - 94,3 - 562,1 PT biểu diễn CC y = 0,7599x – 5,4251 R2 = 0,9386 PT biểu diễn IC y = - 2,5446x + 58,155 R2 = 0,9576 CC50 72,94 IC50 3,2 Hệ số chọn lọc (SI) 22,76 Bảng 9. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của DP Nồng ñộ DP (µg/ml) 7,81 15,62 31,25 62,5 125 CC 4,48 10,54 14,58 33,03 96,8 IC (10-3,7) 29,5 18,4 -17,3 -141,1 -715,6 PT biểu diễn CC y = 0,7816x – 5,968 R2 = 0,9694 PT biểu diễn IC y = - 2,035x + 47,315 R 2 = 0,9889 CC50 71,6 IC50 -1,3 Hệ số chọn lọc (SI) -54,3 Khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero của acyclorvir (ACV) 146 Khảo sát khả năng kháng HSV-1 và HSV-2 của ACV ñể làm ñối chiếu cho khảo sát các mẫu thử. Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2 của ACV ñược trình bày trong Bảng 10 và Bảng 11. ACV cho hệ số SI trên HSV-1 và HSV-2 lần lượt là 46,9 và 52,3, phù hợp với hiệu quả ñiều trị HSV-1 và HSV-2 của ACV. Bảng 10. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-1 của ACV Nồng ñộ ACV (µg/ml) 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 CC 0,46 3,66 3,41 7,88 8,25 IC (10-3,6) 62,14 46,46 -1,85 -3,17 - 49,74 PT biểu diễn CC y = 0,0033x - 0,4291 R2 = 0,9677 PT biểu diễn IC y = - 0,1113x + 86,295 R2 = 0,9908 CC50 15281,5 IC50 326,1 Hệ số chọn lọc (SI) 46,9 Bảng 11. Kết quả thể hiện khả năng ức chế HSV-2 của ACV Nồng ñộ ACV (µg/ml) 195,3 390,6 781,3 1562,5 3125 CC 0,3 3,6 7,7 11,8 15,1 IC (10-3,7) 53,31 42 27,93 26,81 -71,36 PT biểu diễn CC y = 0,0037x + 2,6855 R2 = 0,976 PT biểu diễn IC y = - 0,0423x + 60,345 R 2 = 0,9839 CC50 12787,7 IC50 244,6 Hệ số chọn lọc (SI) 52,3 KẾT LUẬN Cao Xuyên tâm liên có khả năng ức chế HSV-1 và HSV-2, nhưng không có ý nghĩa trong ñiều trị vì hệ số SI trên HSV-1 và HSV-2 của cao này lần lượt là 2,5 và 5,6. Andrographolid, neoandrographolid và dehydroandrographolid ñều có khả năng sử dụng làm thuốc trị liệu; với hệ số SI ñối với HSV-1 và HSV-2 nằm trong khoảng từ 12,8 ñến 63, ngoại trừ dehydroandrographolid trên HSV-2 . Chú thích chữ viết tắt: ACV acyclovir, CC50 50% cytotoxic concentration (liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy), HSV Herpes simplex, CPE cytopathic effect (bệnh tích tế bào), HSV herpes simplex virus, HSV-1 herpes simplex virus type 1, HSV-2 herpes simplex virus type 2, IC50: 50%Inhibitory concentration, PT: phương trình, SI: selectivity index (hệ số chọn lọc), TCID50: 50% Tissue Culture Infectious Dose (liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy). Lời cảm ơn Đề tài ñược thực hiện với kinh phí do Bộ Y tế hỗ trợ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Calabrese, C., Berman, S.G., Babish, J.G., Ma, X., Shinto, L. M., Door, et al (2000) “A phase I trail of andrographolide in HIV positive patients and normal volunteer”, Phytother Research 14, pp. 333-338. 2. Freshney, R.I. (2005), Culture of animal cells: A manual of Basic Technique, Fith Edition, John Wiley & Sons, Inc, pp. 199-216. 3. Jain, D.C., Gupta, M.M., Saxena, S., Kumar, S. (2000), "LC analysis of hepatoprotective diterpenoids from Andrographis paniculata", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, pp. 22, 705-709. 4. Li, Z., Liu, J., Zhao, Y. (2004), “Possible Mechanism Underlying the Antiherpetic Activity of a Proteoglycan Isolated from the Mycella of Ganoderma lucidum in vitro”, Journal Biochemistry and Molecular Biology, 38 (1), pp. 34- 40. 5. Piret J., (2002), “Comparative Study of Mechanisms of Herpes Simplex Virus Inactivation by Sodium Lauryl Sulfate and n- Lauroylsarcosine”, Antimicrob Agents Chemother, 46(9), pp. 2933- 2942. 6. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và ñộng vật làm thuốc ở Việt Nam, 3, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1138-1143. 7. Wiart, C., Kumar, K., Yusof, M.Y., Hamimah, H., Fauzi Z.M. and Sulaiman, M. (2005), Antiviral Properties of Ent-labdene Diterpenes of Andrographis paniculata Nees, Inhibitors of Herpes Simplex Virus Type 1. Phytother. Res. pp. 19, 1069–1070. 8. World Health Organization (2004), Polio Laboratory Manual, Immunization, Vaccines and Biological, 4.