Nghiên cứu tạo củ in vitro cây địa hoàng (rehmannia glutinosa (gaertn) libosch)

Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(3): 507-516, 2020 507 NGHIÊN CỨU TẠO CỦ IN VITRO CÂY ĐỊA HOÀNG (REHMANNIA GLUTINOSA (GAERTN.) LIBOSCH.) Vũ Hoài Sâm1,, Nguyễn Thị Xuyên1, Nguyễn Thị Hương1, Dương Thị Ngọc Anh1, Nguyễn Minh Tuyên1, Nguyễn Duy Phương2, Phan Thúy Hiền1 1Viện Dược liệu, Bộ Y tế 2Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Người chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail: samthavn@yahoo.com Ngày nhận bài: 23.10.2019 Ngày nhận đăng: 10.02.2020 TÓM TẮT Địa hoàng là một loại thảo dược thuộc họ Hoa Mõm chó, chứa các dược chất chính là catalpol và verbacoside trong rễ củ. Trong y học cổ truyền, rễ củ Địa hoàng được sử dụng dưới dạng tươi, khô hoặc được chế biến thành thục địa. Chúng có tác dụng toàn diện đối với hệ thống máu, hệ thống nội tiết, lợi tiểu, chống viêm, tăng cường miễn dịch, chống ung thư và chữa tiểu đường... Địa hoàng có phân bố tự nhiên ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản. Cây được nhập nội vào Việt Nam từ năm 1958, thích hợp trồng ở các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ. Ở Việt Nam, cây có ra hoa nhưng hầu như không kết hạt, nhân giống chủ yếu bằng lát cắt củ. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo củ trong điều kiện in vitro trên nền khoáng 1/4 MS có bổ sung 50 g/L đường sucrose, phục vụ công tác nhân nhanh giống Địa hoàng chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy, auxin (IBA và NAA) không có tác dụng tạo củ in vitro. Các đơn chất BAP và PP333 cho hiệu quả tạo củ kém. Tỷ lệ tạo củ đạt cao nhất (83,33%) trên môi trường có bổ sung tổ hợp BAP (1,0 mg/L) và PP333 (0,3 mg/L) và số củ/cây là 5,58. Nồng độ đường sucrose tối ưu để tăng đường kính và trọng lượng củ là 70g/L. 100% cây có bộ rễ củ sống sót ngoài vườn ươm, sinh trưởng và phát triển tốt trên đồng ruộng. Từ khóa: auxin, Địa hoàng, in vitro, PP333, Rehmannia glutinosa, tạo củ ĐẶT VẤN ĐỀ Địa hoàng (Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.) thuộc họ Hoa Mõm chó (Scrophulariaceae) là cây thuốc quý được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền. Cây được nhập nội vào Việt Nam năm 1958 và được trồng phổ biến ở một số tỉnh thuộc đồng bằng và trung du Bắc bộ nhiều năm sau đó (Đỗ Huy Bích, 2004). Rễ củ Địa hoàng là bộ phận được sử dụng làm thuốc dưới dạng tươi, khô hoặc chế thành thục địa (cửu chưng, cửu sái). Tác dụng chủ yếu của Địa hoàng là được dùng làm thuốc bổ, tăng cường sinh lực, chống viêm, chống thiếu máu và chữa bệnh tiểu đường... (Zhang, 2008). Diện tích trồng Địa hoàng ngày càng được mở rộng. Nhân giống vô tính bằng cách cắt củ là biện pháp nhân giống phổ biến đối với Địa hoàng. Vì cây nhân vô tính nhanh được thu hoạch và hơn nữa ở Việt Nam cây Địa hoàng có ra hoa nhưng không kết hạt (Viện Dược liệu, 2004). Củ Địa hoàng không có thời gian ngủ nghỉ, thường nảy mầm ngay cả khi đang trồng trên đồng ruộng nếu gặp ẩm (Phạm Văn Hiển, 1994). Ngoài ra, do hàm lượng đường trong củ tương đối cao nên việc bảo quản trong kho lạnh hoặc trong cát ẩm dễ gây thối hỏng. Người dân thường phải trồng thêm 1 vụ xuân hè để giữ giống. Tuy nhiên, vụ này năng suất kém hoặc thậm chí là mất trắng nếu thời tiết không thuận lợi (Phạm Văn Hiển, 1994). Gần đây, nhiều công trình trong nước và Vũ Hoài Sâm et al. 508 quốc tế về nhân giống Địa hoàng bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được công bố. Hầu hết các nghiên cứu đều tiến hành tái sinh in vitro qua callus từ lá và từ rễ (Park, 2009). Hình thức tái sinh này dễ gây ra các biến dị di truyền. Vi nhân giống từ ngọn chồi cũng đã được nghiên cứu bởi Ewelina với kết quả là 8,2 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy (Eweilia, 2015). Kết quả nghiên cứu của Vũ Hoài Sâm và đồng tác giả (2018) đã xác định được môi trường MS + 1,0 mg/L BAP + 50 g/L sucrose là tối ưu để nhân nhanh Địa hoàng bằng phương pháp nuôi cấy mô cho hệ số nhân nhanh đạt 31,53 lần từ một lát cắt ban đầu sau 2 tháng nuôi cấy (Vũ Hoài Sâm, 2018). Hiệu quả của quá trình nhân giống in vitro ở Việt Nam đối với hầu hết các đối tượng cây trồng đều chưa được đánh giá cao là do tỷ lệ sống của cây khi đưa ra ngoài đồng ruộng thường thấp. Tạo củ in vitro đối với những cây thân rễ là kỹ thuật khá phổ biến. Mục đích tạo củ nhằm nâng cao khả năng sống sót của cây khi đưa ra điều kiện ex vitro, vì cây đã được tích lũy chất dinh dưỡng trong củ tạo được nên khả năng thích nghi với điều kiện bên ngoài thuận lợi hơn. Địa hoàng thuộc dạng cây có rễ củ, do vậy, mục đích thực hiện nghiên cứu nhân giống Địa hoàng thông qua tạo củ in vitro một mặt nhằm thăm dò khả năng cung ứng giống Địa hoàng dưới dạng củ nhỏ (tương tự như đối với khoai tây bi), mặt khác nhằm nâng cao tỷ lệ sống của cây khi đưa ra đồng ruộng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Ngọn chồi và đốt thân, có chiều dài 0,5 - 1,0 cm chứa ít nhất một chồi ngủ của giống Địa hoàng tuyển chọn (Rehmannia glutinosa (Gaernt) Libosch.) (Vũ Hoài Sâm, 2018). Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng Mẫu cấy được nuôi trên nền môi trường 1/4MS + 50 g/L đường sucrose có bổ sung auxin (IBA hoặc NAA) ở nồng độ 0 mg/L, 0,5 mg/L, 1,0 mg/L; PP333 hoặc BAP ở các nồng độ 0 mg/L, 0,5 mg/L, 1 mg/L, 1,5 mg/L, 2 mg/L và tổ hợp BAP với auxin/ PP333, tùy từng thí nghiệm để xác định được nồng độ và loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp nhất đến khả năng tạo củ in vitro đối với Địa hoàng. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose Mẫu được cấy trên nền môi trường chứa 1/4 MS + chất điều hòa sinh trưởng tốt nhất từ kết quả thí nghiệm trên với các mức nồng độ đường là 50 g/L, 70 g/L và 90 g/L. Đánh giá hiệu quả của việc tạo củ in vitro Hiệu quả tạo củ được đánh giá thông qua các chỉ tiêu đường kính củ (mm), khối lượng củ (mg), tỷ lệ nảy mầm của củ (%) và tỷ lệ sống của cây có rễ củ (%) ở vườn ươm. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH đến 5,8, hấp trong bình tam giác 250 mL, có đậy nút bông, ở 1210C trong 20 phút. Phòng nuôi được duy trì ở điều kiện nhiệt độ trung bình là 25 ± 20C, thời gian chiếu sáng 16h/ngày bằng đèn huỳnh quang với cường độ ánh sáng khoảng 2000 lux, độ ẩm trung bình từ 75 - 80%. Xử lý số liệu Số liệu được phân tích sau 60 ngày nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 30 mẫu. Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS và được trình bày trong bảng kết quả dưới dạng (Mean ± SD và Duncan’s Test). KẾT QUẢ Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng tạo củ Địa hoàng in vitro Ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) Auxin có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái rễ của cây in vitro. Củ Địa hoàng là một loại rễ bên đã biến đổi thành, vì thế chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng hình thành củ nhỏ trên nền môi trường. Kết quả theo dõi sau 8 tuần được thể hiện ở Bảng 1. Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(3): 507-516, 2020 509 Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến tạo củ nhỏ in vitro. Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa (α = 0,05) Kết quả cho thấy, rễ ở công thức đối chứng (ĐC) dài nhưng mảnh và yếu. Cả IBA và NAA ở các nồng độ 0,5 mg/L và 1,0 mg/L không hiệu quả trong việc tạo củ in vitro cây Địa hoàng. Sau 8 tuần nuôi cấy, ở tất cả các công thức trong thí nghiệm 100% mẫu cấy đều phát sinh rễ. Tuy nhiên, rễ hình thành đều là rễ chùm và không công thức nào có sự hình thành củ (Hình 1). Ảnh hưởng của PP333 Do cây Địa hoàng nuôi trong môi trường in vitro phát sinh hình thái phân đốt, khác so với bên ngoài (lá mọc xít nhau quanh gốc), nên chúng tôi sử dụng PP333 để ức chế sự phát triển của thân, lá và rễ cây trong ống nghiệm. Để tiến hành thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện 5 công thức với các nồng độ khác nhau trong khoảng 0 - 2 mg/L. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện ở Bảng 2. Kết quả cho thấy, không giống kết quả thử nghiệm với auxin, tỷ lệ tạo rễ và trạng thái rễ khi được nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung PP333 có sự khác biệt rõ rệt. Trong thí nghiệm này, lóng thân có xu hướng mập chắc và ngắn lại. Rễ tạo thành ở các công thức PP1-PP3 có dạng rễ củ có màu vàng, rễ chắc khỏe, chóp rễ tròn, đường kính lớn (Hình 2b, 2c và 2d). Nhưng tỷ lệ tạo rễ dạng này có xu hướng giảm khi nồng độ PP333 tăng từ 0,5 mg/L đến 1,5 mg/L. Kết quả Bảng 2 cho thấy, ở công thức có bổ sung 0,5 mg/L PP333 tỷ lệ tạo rễ củ đạt cao nhất (73,33%). Ở nồng độ PP333 cao hơn (công thức PP4), rễ hình thành tuy mập chắc hơn so với đối chứng, nhưng lại có dạng sợi dài, chóp nhọn, màu trắng như dạng rễ thông thường, không phải dạng củ (Hình 2e). Như vậy, công thức PP1 chứa 1/4 MS + 50g/L sucrose + 0,5 mg/L PP333 là công thức tốt nhất trong thí nghiệm này, đem lại tỷ lệ tạo củ là 73,77%, chiều dài củ là 1,05 cm. Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ PP333 tới khả năng hình thành củ nhỏ. Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa (α = 0,05). Công thức NAA (mg/L) IBA (mg/L) Tỷ lệ tạo củ (%) Tỷ lệ tạo rễ (%) Chiều dài rễ/củ (cm) Trạng thái rễ/củ ĐC 0 0 0 100 2,34 ± 0,12d Rễ chùm, rễ mảnh AX1 0,5 - 0 100 3,62 ± 0,11a Rễ chùm, không rõ số rễ AX2 1 - 0 100 2,86 ± 0,17c Rễ chùm, không rõ số rễ AX3 - 0,5 0 100 3,26 ± 0,17b Rễ chùm, không rõ số rễ AX4 - 1 0 100 2,65 ± 0,08c Rễ chùm, không rõ số rễ STT PP333 (mg/L) Tỷ lệ tạo rễ (%) Tỷ lệ tạo củ (%) Chiều dài rễ/củ (cm) Trạng thái rễ/củ ĐC 0 100 - 2,34 ± 0,12b Rễ mảnh, dài, dạng chùm PP1 0,5 26,67 73,33 1,05±0,07c Rễ củ, dạng chùm PP2 1,0 46,67 53,33 0,97±0,98c Rễ củ, dạng chùm PP3 1,5 70,00 30,00 0,46±0,04d Rễ củ, dạng chùm PP4 2,0 100 - 2,72±0,09a Rễ chùm, sợi rễ mập chắc Vũ Hoài Sâm et al. 510 Ảnh hưởng của BAP BAP là một loại cytokinin có khả năng kích thích chồi rất mạnh. Tuy nhiên, bên cạnh đó, nhiều kết quả nghiên cứu đã chứng minh với nồng độ thích hợp BAP dùng đơn lẻ hay kết hợp có tác động tích cực đến quá trình hình thành củ trong điều kiện in vitro. Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm về ảnh hưởng của BAP trên các dải nồng độ 0 - 2 mg/L. Kết quả nghiên cứu sau 8 tuần được trình bày ở Bảng 3. Kết quả Bảng 3 cho thấy, mẫu vừa tạo rễ vừa tạo củ sau 8 tuần nuôi cấy tùy theo nồng độ BAP. Khi nồng độ BAP là 0 - 0,5 mg/L, mẫu cấy không tạo củ. Với nồng độ BAP là 1 mg/L, 23,33% mẫu cấy có xuất hiện củ ở gốc (Hình 3c). Khi nồng độ BAP tăng lên mức 1,5 mg/L thì tỷ lệ tạo củ giống như vậy giảm xuống, chỉ còn 6,67%. Kết quả cho thấy, khi nồng độ BAP bổ sung vào môi trường nuôi cấy vượt quá ngưỡng 1,0 mg/L, mẫu cấy không còn xuất hiện rễ sợi. Theo nhận định của chúng tôi, mẫu cấy Địa hoàng khá nhạy cảm với mức nồng độ BAP trong môi trường nuôi cấy. Ở mỗi mức nồng độ, mẫu cấy có sự phát sinh hình thái khác nhau. Trong thí nghiệm này, nồng độ BAP từ 1,5 mg/L - 2,0 mg/L, mẫu cấy phát sinh dạng cụm chồi (Hình 3d, 3e). Như vậy, công thức tốt nhất trong thí nghiệm này để tạo củ Địa hoàng in vitro là 1/4 MS + 50 g/L sucrose + 1 mg/L BAP. Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng hình thành củ nhỏ. Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa (α = 0,05) Ảnh hưởng của tổ hợp BAP + PP333 PP333 và BAP đơn chất có tác động rõ rệt đến hệ rễ in vitro cây Địa hoàng, tuy nhiên hiệu quả tạo củ chưa cao. Vì vậy, để xác định môi trường tối ưu tạo củ nhỏ Địa hoàng in vitro, chúng tôi tiếp tục bố trí trên môi trường 1/4 MS có bổ sung 1 mg/L BAP, kết hợp với PP333 với các nồng độ thay đổi trong khoảng 0 - 1 mg/L. Sau 8 tuần theo dõi, kết quả được thể hiện ở Bảng 4. Kết quả Bảng 4 cho thấy, các nồng độ PP333 khác nhau thì các chỉ số các chỉ tiêu theo dõi về khả năng tạo củ nhỏ Địa hoàng in vitro cũng khác nhau. Tỷ lệ tạo củ tăng dần khi nồng độ PP333 tăng từ 0 - 0,3 mg/L, mức cao nhất đạt 83,33% ở công thức BP2 (1,0 mg/L BAP + 0,3 mg/L PP333). Khi nồng độ PP333 cao trên mức 0,3 mg/L, tỷ lệ tạo củ có xu hướng giảm và ở công thức BP4 (1 mg/L PP333) bộ rễ của mẫu cấy không hình thành củ (Hình 4e). Công thức BP2 và BP3 là 2 công thức có hình thái củ tốt nhất (dạng củ đơn, mập) (Hình 4c, 4d). Từ kết quả trên đây, chúng tôi kết luận, tổ hợp BAP (1,0 mg/L) và PP333 (0,3 mg/L) là tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng tốt nhất để tạo củ in vitro cây Địa hoàng do thu được tỷ lệ tạo củ cao nhất (83,33%). Ảnh hưởng của nồng độ sucrose tới khả năng tạo củ Địa hoàng in vitro Để nâng cao chất lượng củ tạo thành, thí nghiệm nghiên cứu hàm lượng sucrose với các nồng độ đường 50 g/L, 70 g/L, 90 g/L, 120 g/L được thực hiện. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả được thể hiện ở Bảng 5. STT Nồng độ BAP (mg/l) Tỷ lệ tạo củ (%) Tỷ lệ tạo rễ (%) Chiều dài rễ/củ (cm) Số củ/cây (củ) Trạng thái rễ/củ ĐC 0 - 100 2,34 ± 0,12a - Rễ mảnh, dài BA1 0,5 - 46,67 2,05 ± 0,10b - Rễ chùm, chắc BA2 1 23,33 - 0,97 ± 0,03c 2,02 ± 0,03a Rễ dạng củ, nhỏ BA3 1,5 6,67 - 0,53 ± 0,08d 1,13 ± 0,13b Rễ dạng củ, nhỏ BA4 2 - - - - Không tạo rễ Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(3): 507-516, 2020 511 Hình 1. Rễ Địa hoàng in vitro trên các công thức auxin. Trên công thức đối chứng ĐC (a); Công thức AX1(b); Công thức AX2(c); Công thức AX3 (d); Công thức AX4(e) Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ PP333 tới khả năng hình thành củ nhỏ. Trên công thức đối chứng ĐC (a); Công thức PP1 (b); Công thức PP2 (c); Công thức PP3 (d); Công thức PP4 (e). Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới khả năng hình thành củ nhỏ. Trên công thức đối chứng ĐC (a); Công thức BA1 (b); Công thức BA2 (c); Công thức BA3 (d) Công thức BA4 (e). Hình 4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và PP33 đến khả năng tạo củ nhỏ. Trên công thức đối chứng ĐC (a); Công thức BP1 (b); Công thức BP2 (b); Công thức BP3 (c); Công thức BP4 (d); Công thức BP5 (e). Vũ Hoài Sâm et al. 512 Bảng 4. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và PP333 đến khả năng tạo củ nhỏ. Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa (α = 0,05) Bảng 5. Ảnh hưởng của hàm lượng sucrose đến tạo củ Địa hoàng in vitro. Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa (α = 0,05). Kết quả Bảng 5 cho thấy hàm lượng sucrose trong môi trường nuôi cấy không những có tác động đến tỷ lệ tạo củ Địa hoàng in vitro mà nó còn tác động mạnh đến chỉ số số củ/cây và chất lượng củ tạo thành. Số củ trên cây tỷ lệ nghịch với nồng độ đường sucrose trong môi trường nuôi cấy, hàm lượng đường sucrose trong môi trường càng cao thì số củ/cây càng giảm. Số củ/cây cao nhất là 5,52 củ thu được ở công thức SR1 chứa 50 g/L đường sucrose và giảm mạnh chỉ còn 2,76 củ ở công thức SR4 chứa 120 g/L sucrose. Tỷ lệ hình thành củ, đường kính củ và khối lượng củ ở công thức SR2 (70 g/L sucrose) tỏ ra vượt trội hơn so với các công thức khác trong thí nghiệm, với các chỉ số tương ứng 93,33%, 3,78 mm và 0,225 mg củ/cây. Tỷ lệ tạo củ ở các nồng độ đường sucrose cao hơn (90 g/L và 120 g/L) có xu hướng giảm. Ở 2 mức hàm lượng này, chiều dài củ có xu hướng dài ra và đường kính củ thì nhỏ lại (Hình 6c, 6d). Như vậy, hàm lượng sucrose tốt nhất để tạo củ in vitro Địa hoàng là 70 g/L. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Xue (2012), trong đó tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo thành rễ củ in vitro và đưa ra kết luận về nồng độ đường tối ưu là 7%. Đánh giá hiệu qua tạo củ in vitro ngoài vườn ươm Theo dõi khả năng sống sót của 2 loại sản phẩm từ quá trình tạo củ in vitro là cây con có bộ rễ củ và củ nhỏ tạo thành. Đánh giá tỷ lệ sống của củ tạo thành trong in vitro trên giá thể cát: Tribat (3:1, v/v) cho thấy tỷ lệ nẩy mầm còn rất thấp và thời gian lâu (5 tuần sau ươm mới bật mầm) (Hình 6). STT BAP (mg/L) PP333 (mg/L) Tỷ lệ tạo củ (%) Chiều dài rễ/củ (cm) Số củ/cây (củ) Trạng thái rễ/củ ĐC 1 0 23,33 0,72 ± 0,17c 2,52 ± 0,28c Dạng củ, nhỏ BP1 1 0,1 33,33 1,02 ± 0,02b 2,39 ± 0,14c Dạng củ, nhỏ BP2 1 0,3 83,33 1,21 ± 0,14b 5,58 ± 0,33b Dạng củ, mập BP3 1 0,5 46,67 1,27 ± 0,19b 7,52 ± 0,25a Dạng củ, mập BP4 1 1 - 2,22 ± 0,19a - Dạng rễ chùm, sợi rễ mập STT Hàm lượng sucrose (g/L) Tỷ lệ tạo củ (%) Chiều dài rễ/củ (cm) Số củ/cây (củ) Đường kính củ (mm) Khối lượng củ/cây (g) Trạng thái rễ/củ SR1 50 83,33 1,29 ± 0,09a 5,52 ± 0,26a 3,18 ± 0,21b 0,172 ± 0,01b Củ TB SR2 70 93,33 1,25 ± 0,06a 4,94 ± 0,17b 3,78 ± 0,18a 0,225 ± 0,01a Củ mập, chắc SR3 90 66,67 0,87 ± 0,18b 4,02 ± 0,11c 2,89 ± 0,13c 0,139 ± 0,02c Củ nhỏ, không đồng đều SR4 120 26,67 0,54 ± 0,05c 2,76 ± 0,10d 2,14 ± 0,02d 0,079 ± 0,00d Củ nhỏ, nhiều rễ Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(3): 507-516, 2020 513 Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng hình thành củ nhỏ. Cây và củ trên công thức SR1 (a); Cây và củ trên công thức SR2 (b); Cây và củ trên công thức SR3 (c); Cây và củ trên công thức SR4 (d). Hình 6. Củ Địa hoàng in vitro ngoài vườn ươm. Hình 7. Cây Địa hoàng có bộ rễ dạng củ ngoài vườn ươm. A: Cây mới giâm; B, C: Sau 2 tháng giâm; D: Phát sinh củ sau 2 tháng trong vườn ươm. Vũ Hoài Sâm et al. 514 Tuy vậy, theo đánh giá của chúng tôi, tỷ lệ sống ngoài vườn ươm của cây con có bộ rễ dạng củ tăng vượt trội so với cây con in vitro có bộ rễ thông thường. Cây đưa ra ngoài có bộ rễ dạng củ không cần chăm sóc tỉ mỉ, cầu kì mà vẫn có tỷ lệ sống đạt xấp xỉ 100%, cây sinh trưởng và phát triển tốt, bộ rễ củ phát triển thành củ sau 2 tháng ở vườn ươm (Hình 7). THẢO LUẬN Trong sự phát triển và tăng trưởng của thực vật, nitrogen có vai trò chung là nguyên liệu để tổng hợp nên các amino acid, nucleotide, hormone và coenzyme. Tuy nhiên, trong sự hình thành và phát triển củ, nitrogen lại có tác động như một chất ức chế quá trình tạo củ và tăng trưởng củ. Ở giai đoạn tạo củ, nếu nitrogen hiện diện ở hàm lượng cao sẽ làm tăng nồng độ GA nội sinh trong thực vật vì GA ức chế quá trình tạo củ (Xue, 2002). Hơn nữa, khi nitrogen hiện diện ở nồng độ cao sẽ tạo thành nhiều NH3 trong lá, từ đó tổng hợp nên các amino acid là những hợp chất rất cần cho sự tăng trưởng của các cơ quan sinh dưỡng hơn là tạo củ (Hoàng Xuân Chiến, 2011). Nồng độ các chất khoáng trong môi trường MS cũng đóng vai trò quan trọng đến sinh trưởng của cây trong điều kiện in vitro, cũng như quá trình sinh tổng hợp và tích lũy các chất chuyển hóa do nó tác động đến sự thay đổi cường độ ion và áp suất thẩm thấu của môi trường. Vì vậy, môi trường giảm hàm lượng khoáng luôn tỏ ra thích hợp ở giai đoạn tạo rễ hoặc tạo củ đối với nhiều loại cây trồng. Từ các kết quả nghiên cứu trước đây, chúng tôi tiến hành tạo củ trên nền môi trường môi trường 1/4 MS (Vũ Hoài Sâm, 2018). Sau giai đoạn cảm ứng củ, cơ quan tiền tạo củ thực vật bắt đầu phân chia và gia tăng kích thước tế bào đồng thời tích trữ chất dự trữ. Lúc này, thông thường auxin có vai trò rất quan trọng trong việc kích thích sự phân chia và tăng rộng của các tế bào vùng tượng tầng, tạo không gian tích trữ chất dự trữ. Đồng thời, auxin còn giúp cho tế bào tập trung chất dinh dưỡng, thu hút chất dinh dưỡng và gia tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào. Trong nghiên cứu này, tác động của auxin (NAA và IBA) ở các nồng độ thí nghiệm đã không theo quy luật trên, không có sự phát sinh hình thái dạng rễ củ đối với Địa hoàng. Nhiều kết quả nghiên cứu tạo củ in vitro trước đây cho thấy cytokinin có hoạt tính kích thích tạo củ mạnh hơn auxin và có vai trò quan trọng trong tạo củ ở các loài thực vật có củ (Hoàng Xuân Chiến, 2011). Điều này được giải thích là do cytokinin kích thích tổng hợp enzyme tổng hợp tinh bột (starch synthase) hay UDPG- udophosphoglyco, đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme phân giải tinh bột. PP333 (Paclobutrazole) là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng hạn chế tăng trưởng mầm lá, đẩy nhanh quá trình hình thành và phân hóa mầm hoa, là một chất đối kháng với gibberellin, vì vậy có tác dụng ức chế chiều cao của cây. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khi bổ sung paclobutrazol vào môi trường nuôi cấy, có thể có ảnh hưởng đến tác động của các phytohormone khác như ABA, ethylene, cytokinin và auxin. PP333 cũng đã được chứng minh là có tác dụng tạo củ in vitro ở nhiều loại cây trồng. Theo Simko, nồng độ PP333 từ 0,01 -1,0 mg/L là tối ưu để tạo củ khoai tây in vitro (Simko, 1994); PP333 cũng là nhân tố chính và quan trọng (chỉ sau đường sucrose) tác động đến sự tạo củ gừng trong điều kiện in vitro theo công bố của Xue và đồng tác giả (2007). Môi trường có bổ sung 0,1mg/L PP333 cũng được xác định là môi trường thích hợp để tạo củ Hoài sơn (Li, 2014). Đối với Địa hoàng, Tao Xue (2012) đã chứng minh vai trò quan trọng của PP333 trong việc cảm ứng củ in vitro, nồng độ thích hợp để bổ sung vào môi trường nuôi cấy là 1,0 mg/L. Trong nghiên cứu này, nuôi cấy tạo củ trên môi trường có chứa BAP hay PP333 đơn chất có hiện tượng phát sinh hình thái dạng rễ củ, nhưng không rõ ràng hoặc tỷ lệ còn thấp. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và PP333, chúng tôi đã xác định được tổ hợp 1,0 mg/L BAP + 0,3 mg/L PP333 là thích hợp nhất để tạo củ in vitro cây Địa hoàng. Trong chu trình tăng trưởng và phát triển của thực vật, quá trình quang hợp tạo các sản phẩm Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(3): 507-516, 2020 515 đồng hóa. Một phần tham gia vào cấu trúc tăng trưởng thực vật, một phần được tích lũy trong các cơ quan dự trữ như trái, hột, thân hoặc củ (do tự tích lũy chất đồng hóa) (Nguyễn Du Sanh, 1998). Những cấu trúc củ đặc biệt này mang một hoặc hai chức năng sinh học. Trước hết, chúng là cơ quan dự trữ carbon và nitrogen, cung cấp dinh dưỡng cho cây khi cần thiết. Chức năng thứ hai, chúng đóng vai trò là cơ quan sinh sản. Với vai trò là cơ quan sinh sản, củ sẽ tích trữ đầy đủ lượng sinh dưỡng cần thiết cho nhu cầu sống độc lập của cây sau này. Vai trò của đường đối với sự hình thành củ đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng cây trồng. Kết quả cho thấy, đường là nguồn carbon cần thiết trong môi trường nuôi cấy và đồng thời là nguồn nguyên liệu quan trọng trong việc tích lũy tinh bột dẫn đến sự tạo củ và sự phình to của củ in vitro. Đường sucrose được hấp thụ nhanh hơn và tập trung ở rễ nhiều hơn, thích hợp cho sự tạo củ hơn các loại đường khác. Sucrose có vai trò điều chỉnh lượng GA nội sinh trong cây thân củ (Xu, 1998). Hàm lượng đường cao có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành và sinh trưởng phát triển của củ (Staikidou, 2005). Hàm lượng thích hợp cho phản ứng tạo củ in vitro đối với nhiều loại cây trồng thường dao động từ 9 - 12%. Tuy nhiên, đối với Địa hoàng hàm lượng sucrose thích hợp để tạo củ in vitro trong nghiên cứu này được xác định là 70 g/L. Đây cũng là nồng độ đường tối ưu theo kết quả nghiên cứu của Xue và đồng tác giả (2012) đối với Địa hoàng. Kết quả nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình tạo củ Địa hoàng in vitro. Cây có bộ rễ củ có tỷ lệ sống 100% khi đưa ra vườn ươm và cây sinh trưởng và phát triển tốt ngoài đồng ruộng. KẾT LUẬN Đã xác định được môi trường thích hợp để tạo củ in vitro cây Địa hoàng là 1/4MS + 1,0 mg/L BAP + 0,3 mg/L PP333. Nồng độ đường sucrose tối ưu để tạo củ Địa hoàng in vitro là 70 g/L, cho hệ số tạo củ đạt 4,94 lần. Cây được tạo củ trong in vitro cho tỷ lệ sống đạt 100% khi đưa ra vườn ươm và sinh trưởng, phát triển tốt. Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cơ sở Viện Dược liệu: “Tuyển chọn và nhân nhanh giống Địa hoàng cho năng suất và hàm lượng catalpol cao”. Nhóm thực hiện xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc và Hội đồng Khoa học Viện Dược liệu đã phê duyệt nội dung, cấp kinh phí thực hiện. TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Xuân Chiến, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xuân Tỉnh, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận, Dương Tấn Nhựt (2011) Nghiên cứu một số yếu tố tạo củ Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro và xác định hàm lượng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm ở núi Ngọc Linh. Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(3): 317-331. Phạm Văn Hiển (1994) Nghiên cứu một số biện pháp nâng cao chất lượng và số lượng giống cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa Libosch.) ở dồng bằng và trung du Bắc bộ. Luận án Phó tiến sĩ, Trường Đại học Nông nghiệp I. Viện Dược liệu (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật. Tập 1: 774-781. Vũ Hoài Sâm, Nguyễn Thị Xuyên, Dương Thị Ngọc Anh, Hoàng Thị Như Nụ, Nguyễn Thị Hương, Lê Xuân Thảo, Ngô Thị Mai Anh, Phan Thúy Hiền (2018) Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Địa hoàng (Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch.). Tạp chí Dược liệu 23(6): 374-380. Ewelina P, Łukasz K, Przemysław S, Halina W (2015) Shoot organogenesis, molecular analysis and secondary metabolite production of micropropagated Rehmannia glutinosa Libosch. Plant Cell Tis Org Cult 120(2): 539-549. Li M., Li J, Liu W, Liu L, Lu J, Niu J, Liu X, Yang Q (2014) A protocol for in vitro production of microtubers in Chinese yam (Dioscorea opposita). Biosci Biotechnol Biochem 78(6): 1005-1009. Park SU, Kim YK, Lee SY (2009) Improved in vitro plant regeneration and micro propagation of Rehmannia glutinosa L. J Med Plant Res 3(1): 031-034. Xue JP, Huang YQ, Zhang AM (2007) Study on technique of inducing microrhizome in Zingiber officinale. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32(16): 1621-4. Xue JP, Xue T, Guo L, hu YF, Lu HD, Zhang AM, Vũ Hoài Sâm et al. 516 Sheng W (2012) Study on optimization of induction system of test-tube tuberous roots from leaves of Rehmannia glutinosa. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 37(24): 3812-4. Xue JP, Shi LY, Zhang AM (2002) Microtuber induction in vitro from Rehmannia glutinosa. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 27(11):824-7 Zhang RX, Li MX, Jia ZP (2008) Rehmannia glutinosa: review of botany, chemistry and pharmacology. J Ethnopharmacol 117:199–214 STUDY ON TUBERIZATION OF REHMANNIA GLUTINOSA (GAERTN.) LIBOSCH. Vu Hoai Sam1, Nguyen Thi Xuyen1, Nguyen Thi Huong1, Nguyen Minh Tuyen1, Nguyen Duy Phuong2, Phan Thuy Hien1 1National Institute of Medicinal Materials, Ministry of Health 2Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences SUMMARY Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. is an herbal plant, which belongs to the Srcophulariaceae family, containing the main active ingredients such as catalpol and verbacoside in its root tubers. In traditional medicine, R. glutinosa tubers have been used in the fresh or dried tuber root or the prepared rehamannia root. They not only possess the comprehensive pharmacological actions in the blood system, endocrine system but also used mainly for anti-tumor treament, immune-enhancement, anti- diabetes, treament for concretion in the urinary tract, etc. R. glutinosa is naturally distributed in China, Korea and Japan. This species was introduced into Viet Nam since 1958 and then planted widely in many the Northern plain and midland provinces. In Vietnam, R. glutinosa produces flowers without seeds, therefore the plant has been mainly propagated by slicing tubers. In this work, we investigated the effect of some plant hormones and sucrose contents on the ability to producing microtubers of R. glutinosa. Experiments were establishmented on the 1/4 MS medium supplemented with 50g/L sucrose. Results showed that auxin (IBA, NAA) had no effect on the in vitro tuber formation of R. glutinosa. The efficiency of using the single BAP or PP333 was low. The highest in vitro tuberization rate of R. glutinosa obtained on the medium supplemented with the combination of BAP (1.0 mg/L) and PP333 (0.3 mg/L), reached 83.33% and the number of tubers/plant was 5.58. The optimal sucrose concentration for increasing the diameter and weight of microtubers was 70 g/L. 100% of plants with tuber-roots survived in the nursery and thrived on the field. Keywords: Rehmannia glutinosa, auxin, in vitro, microtuber, PP333, tuberization.