Nghiên cứu tạo dòng Trichoderma sinh Cellulase cao bằng xử lý chiếu xạ Gamma

THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN 34 Số 65 - Tháng 12/2020 1. MỞ ĐẦU Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ các gốc β-D-glucose bằng cầu nối β-1-4-glucosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng mặt trời; do vậy, cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên [1, 2]. Để quá trình thủy phân cellulose nhanh chóng và triệt để phải có sự tham gia của phức hệ đa enzyme (cel- lulosome) gồm ba loại enzyme cellulase là endo- glucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Cellu- losome có khả năng tác động hiệp đồng giúp việc phân cắt đồng thời và triệt để cả vùng vô định hình và vùng tinh thể của phân tử cellulose trong khoảng thời gian ngắn hơn so với tác động của từng loại enzyme riêng rẽ [3, 4, 5]. Trichoderma spp. là loại nấm sợi hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong nhiều môi trường sống khác. Nhờ việc nuôi cấy dễ dàng, không tốn kém cùng với khả năng tiết enzyme cellulase hoạt tính cao gấp vài trăm lần so với vi khuẩn mà các chủng Trichoderma đã thu hút được sự quan tâm đặc biệt. Cellulase ngoại bào từ một số chủng Trichoderma thường tồn tại dưới dạng cellulosome nhờ vậy theo thống kê của Hiệp hội Hóa Học (Current Opinion Green and Sus- tainable Chemical) hiện nay, Trichoderma được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất cellulase công nghiệp [6]. Các tia X, g, tia notron có bước sóng ngắn nên có khả năng ion hóa và khả năng xuyên sâu cao. Các tia phóng xạ có thể gây đột biến bằng cách làm đứt gãy ADN, thay đổi cấu trúc của ADN hoặc hình thành các hợp chất có hoạt tính không ổn định làm biến đổi ADN. Bức xạ ion hóa có thể tạo ra đột biến tại những vị trí xác định nhờ đó hoạt tính của vi sinh vật được cải thiện. Ngoài ra, gây đột biến bằng bức xạ có nhiều ưu điểm như phổ đột biến rộng, tần suất đột biến cao do đó sẽ làm tăng khả năng chọn được đột biến mong NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG Trichoderma SINH CELLULASE CAO BẰNG XỬ LÝ CHIẾU XẠ GAMMA Cellulase là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống. Vi sinh vật, đặc biệt là chủng nấm Trichoderma là nguồn cung cấp cellulase chủ yếu. Nghiên cứu này tạo dòng Trichoderma có khả năng sinh cellulase cao bằng xử lí chiếu xạ. Sau chiếu xạ, tỷ lệ sống sót của Trichoderma và dải liều tối ưu tạo đột biến sinh cellulase cao được xác định. Hoạt tính enzyme của chủng thuần và chủng sau chiếu xạ cũng được đánh giá bán định lượng bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và định lượng bằng phương pháp xác định hoạt độ cel- lulase dựa vào lượng đường khử được tạo thành (DNS.) Kết quả cho thấy tỷ lệ đột biến cao nhất đạt 12,33-14,25% ở khoảng liều 700-1500 Gy. Năm (05) khuẩn lạc sau chiếu xạ sàng lọc được có khả năng sinh cellulase cao vượt trội và ổn định ít nhất sau 4 thế hệ, hoạt độ - CMCase (thủy phân cơ chất CMC) và hoạt độ enzyme tổng số-FPase (thủy phân giấy lọc Whatman số 1) của các khuẩn lạc này cao hơn chủng thuần tương ứng là 1,51-2,48 lần và 1,2-1,87 lần. Như vậy, xử lý chiếu xạ gamma là phương pháp gây đột biến hiệu quả trong nâng cao khả năng sinh cellulase của chủng Trichoderma. THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN 35Số 65 - Tháng 12/2020 muốn và rút ngắn thời gian sàng lọc [7]. Để cải thiện khả năng sinh cellulase của Tricho- derma nhiều nghiên cứu gây đột biến chủng nấm này bởi bức xạ tia gamma đã được thực hiện. Trong nghiên cứu của Shahbazi và cộng sự, hoạt tính cellulase của Trichoderma reesei đã được cải thiện tăng 1,5-1,99 lần nhờ tác nhân gamma [8]. Trên cơ chất là bã mía, chủng Trichoderma viride được xử lý chiếu xạ liều 20 krad 2 lần liên tiếp có hoạt tính sinh cellulase tăng 253,5% thay vì chỉ tăng 134,5% khi xử lý 1 lần ở cùng liều chiếu [9]. Tamada và cộng sự khi đánh giá ảnh hưởng của bức xạ gamma lên chủng Trichoderma reesei nhận thấy tỷ lệ sống sót của chủng nấm giảm dần theo sự tăng dần của liều chiếu. Đồng thời, chủng đột biến thu được ở liều chiếu 2000 Gy có khả năng sinh cellulase cao hơn chủng thuần 1,8 lần [7]. Với mục đích sử dụng bức xạ gamma tạo dòng Trichoderma biến dị có khả năng sinh cellu- lase cao, nghiên cứu này bước đầu khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma tới tỷ lệ sống sót và khả năng sinh cellulase của chủng nấm Trichoderma koningiopsis. 2. NỘI DUNG 2.1. Đối tượng và phương pháp 2.1.1. Vật liệu Chủng Trichoderma koningiopsis VTCC 31435 có khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào cao được cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: PDA (Potato Dextrose Agar) do hãng Diffco cung cấp. Các hóa chất: CMC (carboxymethyl cellulose) (Sigma), Congo Red (Sigma), Agar (Việt Nam) đều đảm bảo độ sạch phân tích. Môi trường nuôi cấy lỏng được sử dụng gồm các thành phần sau: CMC 2g, KH2PO4 4g; (NH4)2SO4 13,6g; CaCl2 0,8g; MgSO4 0,6g; pepton; yeast ex- tract 0,1g; FeSO4.H2O 1mg; MnSO4.2H2O 0,32 mg; ZnSO4.7H2O 0,28mg; CoCl2.6H2O 0,4mg; CuSO4.5H2O 0,25mg, nước cất vừa đủ 1000 mL. 2.1.2. Phương pháp 2.1.2.1. Bảo quản và giữ giống Chủng giống thuần T. koningiopsis VTCC 31435 được bảo quản theo phương pháp cấy truyền trên ống thạch nghiêng chứa môi trường PDA, nuôi trong tủ ấm ở 28oC trong 72 giờ và được bảo quản tối đa 30 ngày ở 4oC trước khi cấy truyền đợt tiếp theo. 2.1.2.2. Xử lý chiếu xạ Chủng T. koningiopsis VTCC 31435 được nuôi cấy điểm trên đĩa petri chứa môi trường PDA ở 28oC. Sau 7 ngày, tiến hành gạt toàn bộ số bào tử mọc trên bề mặt đĩa vào 100 mL dung dịch NaCl 0,9% có bổ sung Tween 80 theo tỷ lệ thể tích 1/99. Dung dịch bào tử được pha loãng sao cho mật độ tế bào khoảng 108-109 CFU/ mL. Các ống nghiệm vô trùng có chứa 10 mL dung dịch bào tử T. koningiopsis VTCC 31435 được đem xử lý chiếu xạ trên nguồn gamma Co-60 ở dải liều 0-2500 Gy (3 ống nghiệm lặp lại cho mỗi liều). Liều kế Gammachrome YR được sử dụng để đo liều hấp thụ. 2.1.2.3. Xác định số lượng bào tử Dung dịch bào tử (trước và sau chiếu xạ) được pha loãng theo dãy thập phân 0,1 mL mẫu ở các độ pha loãng thích hợp được cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA (3 đĩa petri/độ pha loãng). Sử dụng que gạt vô trùng dàn đều dịch cấy trên bề mặt thạch. Tiến hành đếm số khuẩn lạc sau 72 giờ nuôi cấy ở 28oC và tính số lượng bào tử (Mi) trong 1 mL mẫu theo công thức [7]: THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN 36 Số 65 - Tháng 12/2020 Mi (CFU/ mL) = Ai x Di/V Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình/đĩa; Di là độ pha loãng và V là thể tích dịch bào tử cấy vào mỗi đĩa (mL) 2.1.2.4. Sàng lọc các đột biến sinh cellulase cao Khả năng phân hủy cellulose của chủng T. kon- ingiopsis được xác định định tính bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch PDA có chứa cơ chất CMC và chất chỉ thị Congo đỏ. Sau khi chiếu xạ, dung dịch bào tử T. koningiop- sis ở các liều khác nhau ngay lập tức được cấy trải lên môi trường PDA có bổ sung CMC và congo đỏ. Đĩa sau khi cấy được ủ ở 28oC trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuôi cấy, nhiệt độ ủ sẽ được nâng lên 37oC trong 3 đến 5 ngày nhằm hạn chế sự lan rộng của khuẩn lạc và thu vòng phân giải CMC tối đa. Khả năng thủy phân cellulose được đánh giá thông qua chỉ số HC (Hydrolysis Capacity) theo công thức [10]: HC = Đường kính vòng phân giải/ Đường kính khuẩn lạc Những khuẩn lạc có chỉ số HC lớn hơn 10% so với chỉ số HC của chủng thuần đều được coi là các khuẩn lạc đột biến có khả năng sinh cellulase cao. 2.1.2.5. Phương pháp DNS (axit 3,5 dinitrosali- cylic) Hoạt độ cellulase do các chủng Trichoderma sinh ra trong quá trình nuôi cấy được định lượng theo TCVN 12104:2018 [11] bằng phương pháp DNS. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá hai loại hoạt độ enzyme endoglucanase - CMCase (thủy phân cơ chất CMC) và hoạt độ enzyme tổng số- FPase (thủy phân giấy lọc Whatman số 1). Xác định hoạt độ thủy phân CMC và giấy lọc (Whatman số 1) bằng cách xác định lượng đường khử được tạo thành khi cho 0,1 mL cellulase tác dụng với cơ chất CMC và giấy lọc ở pH 4,8 và nhiệt độ 50oC trong 20 phút đối với CMC và 60 phút với giấy lọc. Lượng đường khử sinh ra phản ứng với thuốc thử DNS, cường độ màu (màu lục) của hợp chất tạo thành sau phản ứng được đo bằng máy quang phổ UV-2450 Shimadzu ở bước sóng 540 nm. Một đơn vị hoạt độ của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa 1 µmol glucose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [11]. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Ảnh hưởng của chiếu xạ lên sống sót của chủng nấm T. koningiopsis VTCC 31435 Tác động của bức xạ gamma tới sự phát triển của chủng T. koningiopsis VTCC 31435 được chúng tôi xác định thông qua số khuẩn lạc sống sót sau xử lí chiếu xạ liều từ 100 đến 2500 Gy. Hình 1 biểu diễn mối tương quan giữa Logarit số lượng bào tử nấm sống sót (CFU/ mL) và liều xạ. Kết quả cho thấy, số lượng bào tử sống sót phụ thuộc vào liều chiếu. Số lượng bào tử giảm mạnh trong khoảng liều từ 100 đến 1200 Gy, ở các liều cao hơn số lượng bào tử ít có sự chênh lệch hơn. Hình 1. Mối tương quan giữa số lượng bào tử T. koningiopsis VTCC 31435 sống sót trong dịch bào tử và liều xạ THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN 37Số 65 - Tháng 12/2020 Sau các lần chiếu xạ, tính toán tỉ lệ sống sót chủng T. koningiopsis VTCC 31435, chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào sống sót còn khoảng 10% khi xử lý chiếu xạ dung dịch bào tử ở khoảng liều 400 Gy. Giá trị D10 trong nghiên cứu Trandafir và cộng sự trên T. viride trong khoảng từ 450 đến 500 Gy [12]. Nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ gamma tới đặc điểm hình thái và tính đối kháng của T. viride với nấm gây bệnh M. phaseona, Baharvand và cộng sự nhận thấy, tỷ lệ sống sót của T. viride là 9,7% ở liều chiếu 400 Gy và nhóm tác giả đã không quan sát được bất cứ sự nảy mầm nào của các bào tử nấm ở liều 450 Gy [13]. Những khác biệt trong các kết quả nghiên cứu nêu trên có thể được giải thích khi cho rằng các yếu tố như chủng giống, giai đoạn sinh trưởng, nhiệt độ, bản chất của môi trường dạng khí, thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy cũng như điều kiện sinh lý và khả năng tự sửa chữa của tế bào nấm đã ảnh hưởng đến sự tồn tại của chúng sau chiếu xạ. 3.2. Ảnh hưởng chiếu xạ tới khả năng sinh cel- lulase của chủng T. koningiopsis VTCC 31435 Các khuẩn lạc đơn kháng xạ sẽ được lựa chọn ngẫu nhiên (50 khuẩn lạc cho mỗi liều chiếu) để đánh giá khả năng thủy phân cellulose thông qua chỉ số HC. Những khuẩn lạc có chỉ số HC lớn hơn 10% so với chỉ số HC của chủng thuần đều được coi là các khuẩn lạc kháng xạ và có khả năng sinh cellulase cao. Bảng 1. Khả năng thủy phân cellulose ở các khuẩn lạc T. koningiopsis xử lý chiếu xạ liều khác nhau Kết quả trong Bảng 1 cho thấy, khuẩn lạc sinh cel- lulase xuất hiện ở tất cả các liều chiếu xạ với vòng phân giải CMC bao quanh các khuẩn lạc trên môi trường sàng lọc có chỉ thị Congo đỏ. Tuy nhiên, số lượng khuẩn lạc có chỉ số HC cao hơn chủng thuần là khác nhau ở mỗi liều chiếu xạ. Kết quả trong Bảng 1 cũng cho thấy khoảng liều chiếu từ 700 đến 1500 Gy thu được nhiều hơn các khuẩn lạc T. koningiopsis có chỉ số HC cao hoặc có chỉ số HC cao vượt trội so với các liều xử lý còn lại. Điều này được thể hiện rõ ở giá trị HC trung bình, giá trị này là 2,05; 2,21; 2,17 và 2,06 tương ứng với các liều 700, 1000, 1200 và 1500 Gy. Tại các liều chiếu xạ này, chúng tôi cũng thu được các khuẩn lạc có giá trị HC lớn nhất là 2,48; 2,38; 2,41 và 2,62, trong khi đó giá trị này ở chủng thuần là 1,74. So sánh giá trị HC trong nghiên cứu của chúng tôi với các nghiên cứu trên thế giới, nhận thấy: Damaso và cộng sự đặt ngưỡng cho giá trị HC là 1,0 [14], giá trị HC do Florencio và cộng sự đề xuất là 1,5 [15], trong khi giá trị HC trong nghiên cứu của Sazci và cộng sự lên tới đến 2,5 [16]. Như vậy giá trị HC trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với các nghiên cứu khác trên thế giới. Tỷ lệ đột biến thường liên quan tới liều chiếu xạ [17]. Kết quả cho thấy đột biến sinh cellulase cao xuất hiện ở tất cả các liều xạ, tỷ lệ đột biến dường như cao hơn trong khoảng liều từ 700 đến 1500 Gy so với các liều khảo sát còn lại. Dựa vào đường cong sống sót phụ thuộc liều chiếu xạ của chủng T. koningiopsis VTCC 31435 (Hình 1), chúng tôi nhận thấy đột biến sinh cellulase cao hơn chủng thuần thu được nhiều hơn khi số lượng TB sống sau chiếu xạ giảm từ 103 đến 105 lần (3-5 đơn vị Log) so với dạng thuần không chiếu xạ. Sau quá trình sàng lọc này, 05 khuẩn lạc tiềm năng nhất đã được lựa chọn. Giá trị HC của 05 khuẩn lạc sau sàng lọc được trình bày trong Bảng 2, vòng phân giải CMC của một số khuẩn lạc tiềm năng sau chiếu xạ được biểu diễn ở Hình 2. THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN 38 Số 65 - Tháng 12/2020 Bảng 2. Giá trị HC của 05 khuẩn lạc T. koningi- opsis có khả năng sinh cellulase cao nhờ chiếu xạ Hình 2. Vòng phân giải CMC của một số khuẩn lạc T. koningiopsis sau nuôi cấy 28oC trong 24 giờ và ủ ở 37oC trong 5 ngày 3.3. Hoạt độ cellulase của các khuẩn lạc tiềm năng Để chọn các khuẩn lạc có hoạt tính cellulase cao nhất, 05 khuẩn lạc tiềm năng có giá trị HC cao nhất (được liệt kê trong Bảng 2) được định lượng hoạt độ CMCase và FPase bằng phương pháp DNS. Hoạt độ CMCase và FPase của chủng thuần T. koningiopsis VTCC 31435 và 05 khuẩn lạc tiềm năng sinh ra trong quá trình nuôi cấy được biểu diễn trên Hình 3. Hình 3. Hoạt độ CMCase và FPase của 05 khuẩn lạc T. koningiopsis có khả năng sinh cellulase cao tạo được bằng chiếu xạ. Các kết quả của chúng tôi cho thấy cả 05 khuẩn lạc (tạo được trong khoảng liều chiếu từ 700-1500 Gy) đều có hoạt độ CMCase và FPase cao hơn chủng thuần. Hoạt độ CMCase ở các khuẩn lạc tiềm năng cao hơn chủng thuần 1,51-2,48 lần. Trong khi đó, hoạt độ FPase của chúng cao hơn chủng thuần 1,20-1,87 lần. Khuẩn lạc VTCCI-1 tạo được ở liều chiếu 1500 Gy có hoạt độ CM- Case đạt 2,753 U/ mL, cao hơn chủng gốc tới 2,48 lần và hoạt độ FPase đạt 0,365 U/mL, cao hơn chủng gốc 1,87 lần. Khuẩn lạc VTCC I-3 tạo được ở liều 700 Gy có hoạt độ CMCase và FPase tương ứng là 1,987 U/mL và 0,284 U/mL, lần lượt cao hơn chủng thuần là 1,78 và 1,45 lần. Kết quả mà chúng tôi thu được tương đồng với với nghiên cứu của Florencio và cộng sự khi đánh giá mối tương gian giữa phương pháp bán định lượng (trên môi trường PDA có bổ sung chỉ thị Con- go đỏ) và định lượng hoạt độ cellulase (phương pháp DNS) của chủng nấm Trichoderma. Nhóm nghiên cứu cũng khẳng định cả hai phương pháp này là phù hợp để đánh giá và sàng lọc các chủng VSV có khả năng sinh cellulase cao [15]. Đánh giá tính bền chủng sau chiếu xạ hai chủng VTCC-I-1 và VTCC-I-3, nhận thấy hai chủng này ổn định ít nhất sau 4 thế hệ liên tiếp (4 lần cấy truyền, mỗi lần cách nhau 01 tháng) (số liệu không được trình bày trong báo cáo này). Hoạt độ CMCase của chủng VTCC I-1 và VTCC I-3 ở thế hệ đầu tiên và thế hệ thứ 4 cũng đã được kiểm tra và xác nhận bởi Trung tâm Hóa sinh Công nghiệp và Môi trường, Viện Công nghiệp Thực phẩm. 4. KẾT LUẬN Tỷ lệ sống sót của chủng nấm sợi Trichoderma koningiopsis VTCC 31435 giảm dần theo sự tăng dần liều chiếu. Liều D10 khoảng 400 Gy và khoảng liều 700-1500 Gy là phù hợp để sàng lọc THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN 39Số 65 - Tháng 12/2020 các chủng sau chiếu xạ có khả năng sinh cellulase cao. Sau chiếu xạ, đã sàng lọc được 05 khuẩn lạc có khả năng sinh cellulase cao vượt trội, hoạt độ CMCase và FPase của các khuẩn lạc này cao hơn chủng thuần tương ứng là 1,51-2,48 lần và 1,2- 1,87 lần; trong đó 2 chủng VTCC-I-1 và VTCC- I-3 có hoạt tính cellulase ổn định ít nhất sau 4 thế hệ. Các kết quả nghiên cứu đã chứng minh bức xạ gamma là tác nhân hiệu quả trong việc nâng cao khả năng sinh cellulase của chủng nấm T. konin- giopsis. Nguyễn Thị Thơm, Hoàng Đăng Sáng, Trần Xuân An, Nguyễn Văn Bính, Trần Băng Diệp Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Gardner K.H., Blackwell J., The structure of native cellulose. Biopolymers, 13: 1975-2001, 1974. [2] Jarvis M., 2003, Cellulose stacks up, Nature, 426(6967), pp. 611–612, 2003. [3] Gupta P., Samant K., Sahu A., Isolation of cellu- lose- degrading bacteria and determination of their cellulolytic potential. International Journal of Micro- biology, 6, pp. 1-5, 2012. [4] Bayer E.A., Belaich J.-P., Shoham Y., Lamed R., The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides, Annu Rev Micro- biol, 58, pp. 521–554,2004. [5] Miklaszewska B., Macko D., Kłosowski G., Mi- kulski D., Application of semi-quantitative and quantitative methods for the selection of cellulolytic filamentous fungi isolated from pulp mill materials, BioTechnologia, 3, pp. 169–178, 2016. [6] Xu, F., Wang, J., Chen, S., Qin, W., Yu, Z., Zhao, H., Xing, X., Li, H, Strain Improvement for enhanced production of cellulose in Trichoderma viride. Ap- plied Biochemistry and Microbiology, Vol. 47, 1, 2011. [7] Tamada M., Kasai N., and Kaetsu I., Effects of gam- ma-ray irradiation on cellulase secretion of Tricho- derma reesei, J Ferment Technol 65(6), pp. 703–705, 1987. [8] Shahbazi S., Ispareh K., Karimi M., Askari H., Ebrahimi M. A., Gamma and UV radiation induced mutagenesis in Trichoderma reesei to enhance cellu- lases enzyme activity. International Journal of Farm- ing and Allied Sciences. 3 (5): 543-554, 2014. [9] El-Zawahry, Y.A., Mostafa, I.Y., Effect of gamma irradiation on the production of cellulase enzyme by some fungal isolates. Isotope and Radiation Research, Vol. 19, 1, 43-50, 1991. [10] Pratima, G., Kalpana S., Avinash S., Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their cellulolytic potential. International Journal of Microbiology, Vol. 2012, Article ID 578925, 2011. [11] TCVN 12104: 2018, Xác định hoạt độ xenlulaza trong vi sinh vật phân giải xenlulo, 2018. [12] Blakely W.F., Introduction: Chromosome aberra- tion induced by radiation, Lecture of regoninal train- ing course on biological radiation dosimetry, Seoul, Korea, 2007. [13] Trandafir T., Florina L.Z., Mioara A., Mihaele E., Mihai C., Alexandru A., Ovidiu I., oRdica I.S., Radi- oresistance of biodegradation in estabshing the de- contamination dose, ICAMS 2014 – 5 th International Conference on Advanced Materials and Systems, 2012. [14] Damaso M.C.T., Terzi S.D.C, Farias A.X., Oveira A.C.P.D, Fraga M.E, Couri S., Selection of cellulolytic fungi isolated from diverse substrates, Braz. Arch. Biol. Technol, 55(4), pp. 513-520, 2012. [15] Florencio C., Couri S., Farinas C.S., Correlation between agar plate screening and sod-state fermen- tation for the prediction of cellulase production by Trichoderma strains. Enzyme Res, pp.1-7, 2012. [16] Sazci A., Radford A., Erenle K., Detection of cel- lulolytic fungi by using Congo red as an indicator a comparative study with the dinitrosalicylic acid rea- gent method, Journal of Apped Bacteriology 61, pp. 559-562, 1986. [17] Satoh K., Oono Y., Studies on application of ion beam breeding to industrial microorganisms at TI- ARA, Quantum Beam Sci, 3(2), pp. 1-16, 2019.