Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở cây lúa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------------------------------- ĐÀO XUÂN THANH NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN, NĂM 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------------------------------------------------- ĐÀO XUÂN THANH NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA CHUYÊN NGÀNH: TRỒNG TRỌT MÃ SỐ: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS.TRẦN NGỌC NGOẠN PGS.TS.NGÔ XUÂN BÌNH THÁI NGUYÊN, NĂM 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Lêi c¶m ¬n Để hoàn thành khóa học và thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận đƣợc sự giúp đỡ, chỉ dẫn của các thầy cô giáo Khoa Nông học, tập thể cán bộ công nhân Trung tâm Thực hành Thực nghiệm - Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên, bạn bè cùng gia đình. Nhân dịp này tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy, cô giáo và cán bộ nhân viên: Bộ môn công nghệ sinh học - Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên Bộ môn Giống cây trồng - Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên Đặc biệt cho phép tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS.TS.Trần Ngọc Ngoạn – Phó Hiệu Trƣởng - Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên PGS.TS. Ngô Xuân Bình - Phó trƣởng khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên ThS. Phạm Văn Ngọc - Bộ môn cây trồng - Khoa Nông học - Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua Xin kính chúc thầy cô, các anh chị cán bộ cùng bạn bè và gia đình luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và công tác tốt. Thái Nguyên, ngày 16 tháng 10 năm 2009 Học viên Đào Xuân Thanh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza sativa L) là cây lƣơng thực giữ vai trò quan trọng hàng đầu. Mỗi năm, khoảng 1/2 dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm lƣơng thực chính. Lúa đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc Châu á, Châu Phi, Châu Mĩ La Tinh. Đối với các nƣớc Châu nhƣ: Ấn Độ, Trung Quốc, Inđônêxia, Băngladesh, Miến Điện, Thái Lan và Việt Nam thì lúa gạo là cây lƣơng thực đặc biệt quan trọng trong đời sống con ngƣời. Trong những năm gần đây, cùng với đà tăng dân số, sự phát triển mạnh mẽ của nền công nghiệp và đô thị hoá nông thôn làm cho diện tích đất trồng trọt ngày càng thu hẹp lại. Nếu mở rộng diện tích sẽ gặp rất nhiều khó khăn và tốn kém. Để đáp ứng đủ nhu cầu lúa gạo của ngƣời tiêu dùng và an ninh lƣơng thực quốc gia, các nhà tạo giống phải tìm cách làm tăng năng suất, sản lƣợng lúa trên diện tích đất trồng không thể mở rộng. Phƣơng án sử dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh trên những giống lúa cao sản, chịu thâm canh là thích hợp nhất. Bằng các phƣơng pháp lai hữu tính, phƣơng pháp chuyển gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ vào các giống lúa thuần, phƣơng pháp xử lý đột biến v.v…các nhà tạo giống đã có nhiều thành công với những giống mới có năng suất và sản lƣợng cao. Song việc sử dụng các phƣơng pháp tạo giống nhƣ đã nói ở trên tuy có tạo ra những tổ hợp lai năng suất cao nhƣng độ thuần chƣa ổn định. Mặt khác, nếu áp dụng phƣơng pháp chuyển gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ vào các giống lúa thuần rồi chọn thuần nhƣ các giống lúa thuần thì phải mất khoảng 10 vụ bởi vì giống bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ chỉ kết hạt trong điều kiện nhiệt độ < 240C. Nhƣ vậy, thời gian từ tạo đƣợc giống đến khi phổ biến sản xuất thực tiễn đại trà phải mất 10 năm. Trong những năm gần đây, việc ứng dụng biện pháp nuôi cấy bao phấn tạo các dòng nhị Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 bội, nhanh chóng tạo các giống lúa thuần có năng suất cao, chống chịu tốt, đã thu đƣợc nhiều kết quả. Đó là phƣơng pháp tạo dòng thuần nhanh và hiệu quả nhất. Tuy nhiên, mỗi dòng lúa với những tính trạng di truyền khác nhau, sẽ có hàm lƣợng Auxin trong cây khác nhau do đó sẽ có những phản ứng khác nhau với điều kiện nuôi cấy. Để thành công trong việc tạo các dòng thuần bằng kỹ thuật nuôi cấy đó thì phải xác định đƣợc những yêu cầu về vật liệu cấy, môi trƣờng dinh dƣỡng, các tác nhân vật lý, hoá học…của các dòng lúa và đánh giá đƣợc khả năng thích ứng của chúng trên đồng ruộng. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở cây lúa” 2. Mục đích của đề tài - Xác định đƣợc mức ảnh hƣởng của các nhân tố: vật lý, môi trƣờng nuôi cấy, nồng độ hormon kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo, tái sinh chồi và ra rễ trong quá trình tạo cây lúa hoàn chỉnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn. - Tạo đƣợc dòng thuần trong quá trình nuôi cấy - Bƣớc đầu đánh giá đƣợc dòng có triển vọng cho năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái đồng ruộng ở Thái Nguyên, có khả năng làm vật liệu khởi đầu trong công tác tạo giống lúa ƣu thế lai. 3. Yêu cầu của đề tài - Xác định đƣợc thời gian xử lý lạnh thích hợp nhất đối với nuôi cấy bao phấn lúa - Xác định đƣợc nồng độ chất khử trùng hypocloratnatri thích hợp nhất cho xử lý mẫu cấy. - Xác định đƣợc ảnh hƣởng của môi trƣờng MS và môi trƣờng N6 đến khả năng tạo mô sẹo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 - Xác định đƣợc nồng độ các chất 2,4 D; NAA thích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo của mẫu cấy. - Xác định đƣợc nồng độ các chất Kinetin và BAP thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ mô sẹo. - Xác định đƣợc nồng độ chất NAA thích hợp nhất cho quá trình ra rễ từ chồi xanh. - Xác định ảnh hƣởng của các loại môi trƣờng thuần dƣỡng đến quá trình sinh trƣởng của cây lúa. - Đánh giá sơ bộ năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và một số đặc điểm sinh trƣởng phát triển, khả năng kháng bệnh của 20 dòng lúa đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn. 4. Ý nghĩa của đề tài * Ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học: - Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật tạo cây lúa thuần đồng hợp tử bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn. Từ đó làm cơ sở cho việc chọn các dòng tế bào nhƣ: + Chọn dòng kháng sâu bệnh. + Chọn dòng chịu thâm canh… - Lựa chọn sơ bộ đƣợc một số dòng thuần, làm vật liệu khởi đầu cho công tác tạo giống ƣu thế lai. - Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần định hƣớng, làm tăng tính khả thi cho những đề tài nghiên cứu về bao phấn lúa tiếp theo. * Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất: Rút ngắn thời gian tạo giống, do đó giảm giá thành sản xuất giống lúa mới đồng thời nhanh chóng đƣa đƣợc nhiều giống lúa mới vào sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật 1.1.1. Lịch sử phát triển Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đƣợc các nhà khoa học tiến hành vào cuối thế kỷ XIX. Quá trình phát triển đó có thể tạm chia thành 4 giai đoạn. [12] 1.1.1.1. Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930) Phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã đƣợc nhà Bác học ngƣời Đức Grottied Haberlandt đề xƣớng năm 1898. Ông đã tìm cách nuôi cấy các tế bào thực vật phân lập nhƣng không thành công. Các công trình về nuôi cấy mô tế bào của các nhà khoa học khác nhƣ Winker (1902), Thielman (1924), Kuster (1929), cũng không đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu. Năm 1929 Schmacker đã bƣớc đầu thành công trong lĩnh vực này. Sau đó có Schitterer (1931), Pfeiffer (1931), Lanrue (1933) cũng đã có những thành công bƣớc đầu trong nuôi cấy đầu rễ phân lập trong môi trƣờng nhân tạo. Điều đó giúp cho các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng khác nhau. 1.1.1.2. Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950) Giai đoạn này đƣợc bắt đầu bằng công trình nuôi cấy đầu rễ cây cà chua trong môi trƣờng nhân tạo, đƣợc thực hiện bởi nhà bác học White (1934). Bằng thí nghiệm này ông là ngƣời đầu tiên đã chứng minh đƣợc rằng mô phân sinh có thể duy trì thời gian sinh trƣởng hơn nữa nếu chúng tiếp tục đƣợc nuôi cấy bằng môi trƣờng dinh dƣỡng mới. Cũng trong thời gian này, Gautherets đã thành công trong nuôi cấy mô tƣợng tầng và tìm đƣợc môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp cho nhiều loại cây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Năm 1935 Went và Thisnamn đã khám phá ra auxin IAA có khả năng kích thích sự hình thành mô sẹo. Năm 1941, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Overbeek và Steward với thí nghiệm nuôi cấy họ cà Datura, đã chỉ ra rằng auxin kích thích sinh trƣởng có trong nƣớc dừa. Cũng trong thời gian này hai ông đã phát hiện ra tác dụng chất kích thích sinh trƣởng nhân tạo thuộc nhóm auxin, đã đƣợc nghiên cứu và tổng hợp thành công nhƣ NAA, 2,4 D có ảnh hƣởng tích cực trong việc tạo mô sẹo và gây phân chia tế bào. Nhiều nhà khoa học đã bổ sung các Auxin và các Vitamin vào môi trƣờng nuôi cấy và đã khẳng định vai trò của chúng trong môi trƣờng nuôi cấy mô. Năm 1955 Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã xác định đƣợc vai trò của Kinetin tới việc kích thích sự phát triển của mô. Những phát hiện mới mẻ về vai trò của các chất kích thích sinh trƣởng 2,4D, IAA, NAA, kinetin, các vitamin trong giai đoạn này là bƣớc tiến quan trọng trong lịch sử của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 1.1.1.3. Giai đoạn phát sinh hình thái (1950 - 1960) Năm 1956 Miller và Skoog đã thành công trong thí nghiệm tạo chồi từ mô thuốc lá nuôi cấy. Chính Skoog đã phát hiện ra vai trò của kinetin trong sự phân hoá các cơ quan của cây thuốc lá. Những năm 1958-1959 Reinert (Đức) và Steward (Mỹ) đã nuôi cấy tế bào cây cà rôt và thu đƣợc phôi soma từ mô của chúng. Năm 1956 Nickell đã nuôi cấy thành công tế bào đơn Phaseolus vulgais trong dung dịch lỏng. Năm 1960, bằng kỹ thuật gieo tế bào, Bergman đã tái sinh thành công tế bào đơn của cây thuốc lá. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 1.1.1.4. Giai đoạn nghiên cứu di truyền (1960 đến nay) Các thành tựu của giai đoạn này đã chính thức ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật invitro vào công tác giống và nghiên cứu di truyền. Năm 1960 Cooking (Anh) đã dùng men Cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và thu đƣợc các tế bào không có vỏ, còn gọi là các tế bào trần (protoplast). Nitsch (1967), Nakata và Tanaka (1968) là những ngƣời thành công đầu tiên trong việc tạo cây thuốc lá đơn bội bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn. Takabe (1971) tái sinh đƣợc cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast. Melchers(1977) dung hợp protoplast thành công giữa khoai tây và cà chua tạo cây “Pomate” Năm 1985, cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên đƣợc công bố. Khái niệm chuyển gen trở thành phổ cập trong thuật ngữ công nghệ sinh học thực vật. Ledoux cho rằng có thể gây ra biến dị di truyền ở biến dị tế bào, thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai.[20] Từ năm 1980 đến nay, hàng loạt thành công mới trong lĩnh vực công nghệ đƣợc công bố. Nuôi cấy mô tế bào đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong công nghệ tạo giống và nhân giống hiện đại. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã mang lại những cơ sở lý luận mới mẻ cho sinh học hiện đại. 1.1.2. Tình hình nuôi cấy bao phấn lúa trên thế giới Năm 1968 Nishi và cộng sự là những tác giả đầu tiên thành công trong lĩnh vực nuôi cấy bao phấn trên những cây một lá mầm sau khi công bố kết quả tái sinh cây lúa hoàn chỉnh từ mô sẹo. Sau đó, hàng loạt các tác giả cũng công bố những kết quả khả quan nhƣ: Chu et. al (1975), Chen (1977), Chalyf anh Stalanrl (1981), Wang et.al (1982), Mich et.al (1985). Kết quả tạo cây đơn bội và lƣỡng bội thuần thu đƣợc chủ yếu ở loài phụ Japonica, đối với loài phụ Indica thì kết quả chƣa cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Các giống lúa có nguồn gốc họ phụ Indica là những giống lúa khó tính trong việc nuôi cấy bao phấn. Để tiến tới thành công, các nhà khoa học đã và đang tìm cách xác định sự ảnh hƣởng của các yếu tố có tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình nuôi cấy. Các yếu tố đó là: Kiểu gen của cây cho phấn, giai đoạn phát triển của cây trong thời điểm lấy mẫu, thành phần môi trƣờng nuôi cấy, các yếu tố vật lý nhƣ nhiệt độ, ánh sáng... * Ảnh hưởng của kiểu gen cây cho bao phấn: Sự thay đổi của tần số tạo mô sẹo và khả năng tái sinh của mô sẹo ở phấn hoa phụ thuộc phần lớn vào kiểu gen của cây. Kết quả quan sát của Oono (1968), Chu (1982), Hu (1985), Zapata (1990) cho thấy sự khác biệt của các kiểu gen kéo theo sự khác biệt trong khả năng nuôi cấy lúa. Kiểu gen loài phụ Indica phát triển và tạo mô sẹo kém so với loài phụ Japonica. Theo Mathias và Fukki (1986) khả năng tái sinh của cây lúa trong nuôi cấy tế bào bị chi phối bởi sự tƣơng tác tế bào chất, nhân của chính nó. * Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của cây trong thời điểm lấy mẫu Các tác giả Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thấy: mẫu bao phấn đƣợc lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai đoạn đơn bào muộn là tốt nhất. Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả năng phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy invitro, Bao phấn ở giai đoạn đơn bào sớm phát triển kém. Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi tứ tử (giai đoạn đơn bào giữa đến đơn bào muộn). *Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đòng Kêt quả nghiên cứu của Zhou và Cs (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn lúa. Điều kiện lạnh làm tăng khả năng tạo cây xanh. + Chaleff và Cs (1975) xử lý đòng ở 60C trong 5 ngày Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 + Hu và Cs (1978) đã xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 100C trong thời gian 4 - 8 ngày. + Matitin và Drimo Millo (1981) đã tiến hành xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 2 - 4 0 C trong thời gian 48h. + Gupta và Borthakeu (1987) đã xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 100C trong thời gian 11 ngày. + Guapta, Quimio và Zapata (1990) xử lý đòng ở 6-80C trong thời gian 8 ngày. + Rush và cộng sự (1982) đã tiến hành xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 400C trong thời gian 15 phút. + Năm 1886, Torrizo xử lý đòng ở 350C trong 15 phút cũng cho kết quả khả quan. Nói chung, đã có nhiều thí nghiệm nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của nhiệt độ và thởi gian xử lý đòng đến kết quả nuôi cấy bao phấn lúa. Kết quả nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng xử lý đòng ở nhiệt độ khác nhau sẽ cho những kết quả nuôi cấy khác nhau * Ảnh hưởng của nồng độ Cacbon đến quá trình tạo mô sẹo và tái sinh cây. Nồng độ cacbon có thể làm thay đổi tỷ lệ hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn lúa. Chen (1978) cho biết đƣờng có tác dụng làm thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trƣờng nuôi cấy. Nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy từ 6 - 8% sẽ làm tăng cả hai quá trình hình thành mô sẹo và tái sinh tiếp theo. Năm 1988 Kim và Paghavan thông báo rằng: Tỷ lệ hình thành mô sẹo từ bao phấn sẽ giảm đi khi nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy cao (8 -12%) * Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến quá trình tạo mô sẹo và tái sinh cây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Trong kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa, các chất điều hoà sinh trƣỏng có thể sử dụng ở dạng đơn hay kết hợp theo những tỷ lệ khác nhau Năm 1980, Khi nuôi cấy bao phấn lúa Japonica, Yang và cộng sự đã sử dụng kết hợp NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l . Kết quả cho thấy rằng nếu môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa 2,4D nồng độ 1mg/l thì mô sẹo dễ dàng tái sinh thành cây. Theo Wasakd (1982): IAA xúc tiến quá trình hình thành rễ, Sự kết hợp các auxin: IAA, NAA, Kinetin một cách hợp lý sẽ xúc tiến mạnh mẽ quá trình phân hoá tế bào và tái sinh cây xanh. Nhìn chung, các chất tham gia vào môi trƣờng nuôi cấy bao phấn lúa nhƣ chất điều hoà sinh trƣởng, muối, đƣờng, sắt, Vitamin..... đều có sự ảnh hƣởng lẫn nhau và ảnh hƣởng chung đến kết quả của quá trình nuôi cấy. * Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý trong môi trường Các yếu tố vật lý của môi trƣờng bao gồm: + Trạng thái vật lý của môi trƣờng ở dạng rắn hay lỏng + Độ pH môi trƣờng + Độ ẩm không khí + Ánh sáng và nhiệt độ của phòng nuôi cấy Các yếu tố trên tác dụng trực tiếp đến sự hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh chồi. Kết quả nghiên cứu lúa mỳ của Bjarmsta (1989) cho thấy rằng xử lý ánh sáng cƣờng độ cao sẽ kìm hãm quá trình tạo mô sẹo nhƣng lại kích thích quá trình tạo cây xanh, ánh sáng yếu hoặc ánh sáng khuyếch tán không ảnh hƣởng gì đến khả năng tạo mô sẹo của mẫu cấy. * Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau đến quá trình nuôi cấy bao phấn. Các môi trƣờng khác nhau sẽ cho những kết quả nuôi cấy bao phấn là khác nhau. Năm 1962 Dono thông báo môi trƣờng Murashige and skoog là môi trƣờng thích hợp nhất cho nuôi cấy bao phấn. Đến năm 1975 thì Chu và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Cs lại thông báo rằng môi trƣờng N6 là môi trƣờng tốt nhất cho nuôi cấy bao phấn lúa. Năm 1974, hai nhóm nghiên cứu của Chen và Wang đã thành công lớn khi sử dụng môi trƣờng Miller trong nuôi cấy bao phấn lúa. Rất nhiều tác giả có chung một kết luận rằng: môi trƣờng có nồng độ muối vô cơ cao sẽ rất thích hợp cho phân hoá mô sẹo. 1.1.3. Tình hình nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam Ở nƣớc ta, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật mới bắt đầu từ năm 1975. [16]. Kỹ thuật nhân giống invitro đã đƣợc tiến hành trên nhiều đối tƣợng thực vật khác nhau nhƣ: chuối, khoai tây, cà chua, ngô, lúa, phong lan…và cũng đã đạt đƣợc những kết quả nhất định, làm tăng hệ số nhân giống và tạo đƣợc giống mới sạch bệnh ở các loại cây này. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa đƣợc ứng dụng rất sớm vào công tác chọn tạo giống và đã đƣợc tiến hành ở những cơ quan nghiên cứu khoa học, các trƣờng đại học. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện có sự trợ giúp của công nghệ sinh học nhằm chuyển lạp gen, gây áp lực bằng điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở mức độ tế bào (rét, nóng, bệnh hai…), nuôi cấy bao phấn, dung hợp tế bào trần, nuôi cấy phôi lúa. Bằng công nghệ sinh học ngƣời ta có thể chủ động chuyển thêm một số gen mới có lợi đã đƣợc nghiên cứu kỹ vào cây lúa nhƣ gen kháng bạc lá, gen chịu phèn, gen chịu rét, gen chịu mặn…Tuy nhiên số lƣợng những giống lúa đạt năng suất, chất lƣợng đƣợc tạo ra chƣa nhiều. Đỗ Năng Vịnh và Lê Thị Diệu Muội [15] đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tạo thành mô sẹo và tạo thành cây lúa từ hạt phấn bằng phƣơng pháp nuôi cấy invitro. Sau nhiều năm tiến hành nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn, năm 1993 Nguyễn Hữu Hổ và Nguyễn Văn Uyển đã có những kết luận sau: - Trong mô túi phấn có chất ức chế ảnh hƣởng tới sự phát triển hạt phấn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 - Giữa phôi dinh dƣỡng và hạt phấn hoặc là giữa các phôi với nhau luôn luôn có sự cạnh tranh làm ức chế quá trình tái sinh cây. - Trong môi trƣờng nuôi cấy, phôi dinh dƣỡng nhị bội phát triển mạnh hơn hạt phấn tách rời dẫn đến kết quả là mô sẹo nhị bội chiếm ƣu thế so với mô sẹo đơn bội. Để loại bỏ các nhân tố cạnh tranh đối với sự phát triển của hạt phấn, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nuôi phấn hạt phấn sau khi đã tách rời khỏi mô túi phấn. Song kết quả đạt đƣợc vẫn còn rát khiêm tốn. Thực tế cho thấy tỷ lệ mô sẹo hình thành thấp, sức tái sinh cây từ mô sẹo cũng không cao. Cũng trong thời gian này, các tác giả đã thử nghiệm nuôi cấy bao phấn lúa trong môi trƣờng lỏng và rút ra kết luân: + Môi trƣờng lỏng thuận lợi cho sự hấp thu dinh dƣỡng hơn môi trƣờng rắn. + Các chất độc do hạt phấn chết tạo ra không có tác động xấu tới các hạt phấn khác bởi vì nó đã bị khuyếch tán vào môi trƣờng lỏng. Năm 1994, Viện di truyền nông nghiệp công bố quá trình nuôi cấy bao phấn, nâng cao tỉ lệ tạo mô sẹo và khả năng tái sinh của cây đơn bội (Nguyễn Văn Đồng, Vũ Đức Quang, Phạm Ngọc Lƣơng, Trần Duy Quý 1994). Từ năm 1994 – 2001, đã có công trình nghiên cứu nuôi cấy bao phấn lúa mới để chọn tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ phát triển lúa lai đựơc công bố (Viện di truyền nồng nghiệp 1997 - 2000). Các nhà khoa học Việt Nam đã đạt đƣợc một số thành tựu có ý nghĩa to lớn trong sản suất. Tại viện Di Truyền Nông nghiệp, phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn kết hợp với chọn dòng biến dị đã tạo ra 50 dòng bất dục phản ứng với nhiệt độ (TGMS) mới , trong đó 5 dòng đƣợc xác định là có tính bất dục ổn định, có ƣu thế lai cao khi lai tạo và đang đƣợc sử dụng trong chọn giống lúa lai 2 dòng. Bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 12 dòng, giống thuần có ƣu thế lai gần tƣơng đƣơng với con lai F1 các dòng giống có triển vọng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 gồm DT26, DT29, DT32, AC22, AC23, AC24, AC25,....đang đƣợc khảo nghiệm. Nhờ nuôi cấy bao phấn lúa có thể rút ngắn thời gian chọn giống mới xuống từ 4-6 thế hệ. Kỹ thuật đơn bội invitro cũng đang đƣợc triển khai mạnh trong chọn giống ở Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Viện công nghệ sinh học...[9]. Những năm gần đây, Vũ Đức Quang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và cải tiến môi trƣờng N6 thành môi trƣờng HD. Ông cho rằng môi trƣờng HD có ƣu điểm vƣợt trội so với môi trƣờng N6 và là môi trƣờng tốt nhất cho sự phát triển của bao phấn lúa. Viện Di truyền nông nghiệp Hà Nội đã tạo ra 3 giống lúa quốc gia DT10, A20, DT11 bằng phƣơng pháp gây đột biến. 1.2. Khái niệm nhân giống Invitro Nhân giông vô tính invitro là phƣơng pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trƣờng nuôi cấy thích hợp và đƣợc kiểm soát [1] Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin có trong các tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó để xây dựng lại toàn bộ cơ thể. 1.3. Cơ sở khoa học của nuôi cấy Invitro 1.3.1. Tính toàn năng của tế bào Haberlandt (1902) là ngƣời đầu tiên đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy rằng, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. [11] Miller và Skoog (1956) đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy, chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào. Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con ngƣời đã hoàn toàn chứng minh đƣợc khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. 1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau. Mỗi tế bào khác nhau sẽ thực hiện một chức năng cụ thể khác nhau Song, mọi tế bào đều đƣợc tạo thành từ tế bào phôi sinh.[12] Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân hoá của tế bào có thể biểu thị nhƣ sau: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá chức năng riêng Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhƣng chúng vẫn giữ nguyên khả năng phân chia. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó đƣợc gọi là phản phân hoá tế bào, (ngƣợc lại với quá trình phân hoá tế bào). Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong điều kiện cần thiết ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngƣợc lại với quá trình phân hoá tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hƣớng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy 2 nhóm chất điều tiết sinh trƣởng thực vật là auxin và cytokinin. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp thì sự phát sinh hình thái theo hƣớng tạo chồi; nếu tỷ lệ này cao thì tạo thành rễ, còn khi tỷ lệ này cân bằng thì sẽ phát sinh theo hƣớng tạo mô sẹo. [3]. 1.3.3. Cơ chế di truyền thông qua các hệ tế bào Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào bao gồm các công đoạn: Trong quá trình nguyên phân, từ một tế bào mẹ sẽ nhân đôi, tạo ra 2 tế bào con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu. Nhƣ vậy qua nguyên phân bộ NST trong nội bộ từng cơ thể đƣợc diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con có bộ NST giống bộ NST của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang tế bào con. Sở dĩ có hiện tƣợng này là do trƣớc mỗi lần giảm phân, mỗi phân tử ADN đã thực hiện quá trình tái sinh để từ mỗi phân tử ADN hình thành 2 phân tử ADN giống nhau và giống ADN ban đầu. Quá trình này đƣợc thực hiện ở kỳ trung gian và thông qua cơ chế phân ly đều của NST ở kỳ sau, là cơ sở cho sự truyền nguyên vẹn thông tin di truyền trong nội bộ cơ thể. Giữa 2 thế hệ cơ thể đƣợc hình thành thông qua cơ chế giảm phân đã làm cho ở thế hệ đời sau có hiện tƣợng phân ly tính trạng, do bộ NST của thế hệ sau không giống nhau và không giống bố mẹ. Vì vậy việc duy trì các tính trạng mong muốn ở bố mẹ sang thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính sẽ không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 thể đảm bảo hoàn toàn chắc chắn. Đây là một trở ngại lớn trong sinh sản hữu tính. Ngày nay bằng phƣơng pháp sinh sản vô tính, ngƣời ta đã khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này. Đặc biệt là nhân giống vô tính in vitro. Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống invitro khi lấy các bộ phận sinh dƣỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông tin di truyền giống nhau và tạo nên các cơ thể mới có thông tin di truyền giống nhau và giống cơ thể mẹ. Nhƣ vậy nếu cơ thể mẹ có các tính trạng di truyền tốt thì các tính trạng đó sẽ đƣợc thể hiện ở mọi cơ thể con cái. [9] 1.3.4. Môi trƣờng nuôi cấy (môi trƣờng dinh dƣỡng) 1.3.4.1. Khái niệm Môi trƣờng nuôi cấy là điều kiện vô cùng quan trọng, có tính chất quyết định sự phân hoá tế bào và cơ quan trong nuôi cấy. Theo Street [23] thì môi trƣờng nuôi cấy và môi trƣờng xung quanh là những nhân tố quyết định sự thành công hoặc thất bại của quá trình nuôi cấy invitro. Môi trƣờng nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự phân chia và phân hoá của mô tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy. Vì vậy, môi trƣờng dinh dƣỡng phải đầy đủ chất dinh dƣỡng, các chất cần thiết. Đối với hầu hết các loài thực vật, Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm các nguyên tố đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn các bon, các axitamin, các chất điều hoà sinh trƣởng và một số chất phụ gia. Thành phần dinh dƣỡng, hàm lƣợng các chất cần thiết cho tế bào sinh trƣởng tốt nhất thay đổi tuỳ theo từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy hay từng cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể. 1.3.4.2. Một số môi trƣờng cơ bản Đã có rất nhiều môi trƣờng dinh dƣỡng lần lƣợt đƣợc tìm ra trên cơ sở cải tiến môi trƣờng của Kotte và Robbin (1902) nhƣ: Môi trƣờng White (1934), Knudson (1946), Vacin và Went (1949), Heller(1953), Murasnige - Skoog (1962), Gammborg (B5) (1968), Knop (1974), WMR (1982), Aderson (1984),… Tuy nhiên, mỗi môi trƣờng chỉ thích hợp với một loài cây nhất định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 nhƣ: Môi trƣờng Knudson (1946), Vacin và Went (1949), chỉ thích hợp cho các loài Lan, môi trƣờng Murasnige - Skoog (1962) thích hợp cho cácloài cây thân thảo và một số loài cây thân gỗ sinh trƣởng nhanh nhƣ Keo, Bạch đàn…Môi trƣờng WMP chỉ thích hợp cho các loài cây thân gỗ.[9] Tuỳ thuộc vào từng đối tƣợng cụ thể, trong mỗi giai đoạn nuôi cấy, mà lựa chọn loại môi trƣờng thích hợp thì mới có kết quả khả quan. Thông thƣờng, ngƣời ta hay sử dụng môi trƣờng MS và môi trƣờng N6 cho nhân giống Invitro. * Môi trƣờng MS: Các thành phần cơ bản của môi trƣờng MS (Murashige- skoog) [1]: bao gồm: - Các nguyên tố đa lượng: Bao gồm: N, P, K, S, Mg, Ca,… thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 30ppm. Thành phần, tỷ lệ của từng chất ở mỗi nuôi trƣờng nuôi cấy cụ thể là khác nhau, môi trƣờng giàu nitro thích hợp cho việc hình thành chồi, môi trƣờng giàu kali có tác dụng xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất - Các nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, Co, I …là các nguyên tố vi lƣợng thƣờng đƣợc dùng trong môi trƣờng nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động của Enzim. Các nguyên tố vi lƣợng thƣờng đƣợc dùng ở nồng độ thấp hơn so với các nguyên tốa đa lƣợng - Nguồn cacbon Mặc dù dƣới ánh sáng nhân tạo, cây Invitro có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp. Song, khả năng tổng hợp cacbon của chúng rất kém do đó các mô thực vật sống theo phƣơng thức dị dƣỡng là chính. Các mô tế bào sống nhờ nguồn cacbon lấy từ đƣờng trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Có hai loại Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 đƣờng đƣợc sử dụng chủ yếu là sacarose và glucose với nồng độ thay đổi từ 20 – 40g/l tuỳ theo từng loài thực vật và mục đích nuôi cấy. - Các vitamin Trong quá trình nuôi cấy, cây invitro có thể tự tổng hợp đƣợc một số vitamin cần thiết nhƣng chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu sinh trƣởng. Do đó ngƣời ta thƣờng bổ sung một số vitamin nhóm B nhƣ: B1, B2, B3, B5, B6...ở nồng độ 1mg/l; Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và bị phân huỷ ở nhiệt độ cao. Vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dƣới 00C hoặc chỉ pha chế trƣớc khi sử dụng. Ngoài ra, bổ sung một lƣợng tƣơng đối lớn myo-inositol : 50 - 500mg/l, để thúc đẩy sự phân chia mô tế bào. - Các chất phụ gia hữu cơ khác Nƣớc dừa, thanh hoạt tính, dịch chiết nấm men...có tác dụng kích thích sự sinh trƣởng của mô sẹo nên thƣờng đƣợc dùng lam chất phụ gia. Trong nƣớc dừa có chứa đƣờng, các axitamin, axit hữu cơ, đặc biệt trong nƣớc dừa có chứa các hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô. đó là myo- inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các gluxit của xytokinin. Nƣớc dừa tỏ ra có tác dụng vƣợt trội trong các môi trƣờng nhân nhanh chồi. - Các chất điều tiết sinh trưởng Các chất điều tiết sinh trƣởng đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình nuôi cấy invitro, là yếu tố quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Các hoormon tự nhiên có tác dụng đến sự biến đổi sinh lý, sinh hoá trong cây, đặc biệt ở các cơ quan chồi và rễ. Hoormon thực vật là những hợp chất hữu cơ do thực vật sinh sản ở nồng độ thấp làm nhiệm vụ điều tiết các quá trình sinh trƣởng của cây. Có 5 nhóm chất điều tiết sinh trƣởng của thực vật đã đƣợc phát hiện, đó là: auxin, xytokinin, gibberellin, absixic axit và ethylen. Trong đó, auxin và xytokinin là hai nhóm chất đƣợc sử dụng nhiều hơn cả. - Auxin: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Auxin là hoormon sinh trƣởng. Tác dụng chủ yếu của Auxin là kích thích sự giãn tế bào, làm tăng phân bào, sự hình thành mô sẹo và sự xuất hiện rễ bất định. Các Auxin thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là: + 2,4 Dicloro phenoxy axetic axit (2,4 D); + α – Naphtylaxetic axit(α –NAA); + Indolaxit axetic ( IAA). + Indol butyric acid (IBA). Riêng IAA là auxin tự nhiên còn NAA, IBA và 2.4D là các auxin nhân tạo, auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên, do cấu trúc phân tử khá bền vững nên auxin nhân tạo khó bị oxy hóa bởi các enzyme. Kinh nghiệm sử dụng auxin trong nuôi cấy cho kết quả cao là sử dụng auxin với nồng độ cao tại thời điểm ban đầu sau đó giảm dần để tránh tình trạng mô bị “say” và nhiễm độc. Nồng độ auxin thƣờng dùng từ 0,001 – 10mg/l môi trƣờng nuôi cấy. - Cytokinin (hoormon phân bào): Các hợp chất cytokinin kích thích sự phân bào và sự phân hoá chồi bất định. Việc điều chỉnh tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy quyết định sự phân hóa tế bào theo hƣớng tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ hay tạo phôi soma. Có 3 loại cytokinin chính đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là: + Kinetin: Kinetin đƣợc hình thành từ chế phẩm AND ở điều kiện nhiệt độ cao. Trong cơ thể sống có thể không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự tạo thành chồi mô nuôi cấy. + Zeatin: Tác dụng tƣơng tự kinetin nhƣng giá thành của zeatin khá cao nên chỉ dùng trong những trƣờng hợp thật đặc biệt. + 6-Benzylaminopurine (BAP): Tác dụng của BAP giống kinetin nhƣng hoạt tính của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững hơn zeatin ở nhiệt độ cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 + Nhóm xytokinin : Các chất thuộc nhóm xytokinin đang đƣợc sử dụng chủ yếu là : Kinetin (K), benzyl adenin purin (BAP), zeatin trong đó BAP và K đƣợc sử dụng rộng rãi nhất vì giá không đắt lại có hoạt tính cao. - Chất làm đông cứng môi trường – agar Mỗi loài thực vật thích hợp với môi trƣờng giá thể khác nhau ngƣời ta thƣờng sử dụng thạch Aga – một loại polysacarrit làm từ rong biển, có khả năng ngậm nƣớc cao, để làm đông cứng môi trƣờng nuôi cấy. Aga tan ở 100 0C, đông đặc ở 450 Trong môi trƣờng axit, aga không có khả năng đông đặc. Nồng độ thƣờng dùng từ 0,4% - 0,8% (tức 4 - 8 g/l) tuỳ thuộc vào độ tinh khiết và từng loại môi trƣờng. Ví dụ : Đối với cây lúa, hàm luợng aga thích hợp từ 5,5 – 6,5 g/l. - pH môi trường : pH môi trƣờng là yếu tố rất quan trọng, có tác động rất lớn đến quá trình trao đổi chất của tế bào. Độ pH môi trƣờng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào trong tế bào. Các hợp chất đặc biệt mẫn cảm với pH môi trƣờng là NAA, GA3, và cỏc vitamin. Ngoài ra, hàng loạt các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào độ pH. Khoảng pH thích hợp nhất cho nuôi cấy invitro là 5,5 – 5,8. Độ pH nhỏ hơn 4.5 hoặc lớn hơn 7 đều gây ức chế quá trình sinh trƣởng của cây Có thể dùng dung dịch KOH 1N, NaOH 1N hay HCl 1N với nồng độ 10% để điều chỉnh độ pH môi trƣờng. * Môi trường Chu (N6) Đây là môi trƣờng rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn lúa và các loài cây hoà thảo khác. 1.3.5. Điều kiện vô trùng Nuôi cấy Invitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trƣờng sẽ bị nhiễm, mô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của của nuôi cấy mô invitro [12]. Phƣơng pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Tuy vậy, nếu tìm đƣợc nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thƣờng hay sử dụng một số hóa chất nhƣ HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, nƣớc javen, cồn 760, clorox,…để khử trùng. Phƣơng tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cây. 1.3.6. Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ Ánh sáng và nhịêt độ là hai yếu tố chính có ảnh hƣởng cơ bản đến quá trình sinh trƣởng của mô nuôi cấy [5] 1.3.6.1. Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hƣởng từ các yếu tố nhƣ: thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng.Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày. Cƣờng độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Theo Ammirato (1986): cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trƣởng của mô sẹo. ngƣợc lại, cƣờng độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux (Morein, 1974), ngoài ra chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vƣơn cao nhƣng lại có ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng của mô sẹo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cƣờng độ 2000 - 2500 lux ngƣời ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35- 40cm. 1.3.6.2. Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hƣởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng tốt ở nhiều loài cây là 250C (white, 1973). 1.3.7. Vật liệu nuôi cấy Để bắt đầu quá trình nhân giống vô tính cho 1 loài hoặc 1 dòng ngƣời ta phải chú trọng trƣớc nhất là vật liệu nuôi cấy. Đây là bƣớc đầu tiên và là khâu quan trọng quyết định đến sự thành bại và tốc độ sinh trƣởng của quá trình nhân giống. Theo nguyên tắc, bất kỳ một tế bào trong cơ thể đều có khả năng tái sinh thành một cây hoàn chỉnh trong điều kiện thích hợp. Tuy vậy để có tốc độ tái sinh, sức sống, sức chống chịu của cây con cao thì khả năng đó còn tùy thuộc vào tuổi sinh lý của vật liệu nuôi cấy [11]. Trong nuôi cấy mô ngƣời ta thƣờng sử dụng vật liệu nuôi cấy nhƣ đỉnh sinh trƣởng, chồi, bao phấn, gieo qua hạt, thân mầm…. 1.3.8. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô, tế bào 1.3.8.1. Kiểu gen của cây cho bao phấn Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy. Nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Japonica (kể cả trƣờng hợp không xử lý lạnh trƣớc) đều đạt tỷ lệ thành cây thƣờng cao hơn nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Indica. Chen và Lin (1981) còn thấy rằng tỷ lệ bao phấn tạo callus, khả năng callus tái sinh thành cây, tỷ lệ cây xanh/cây bạch tạng và số lƣợng nhiễm sắc thể của cây tái sinh đều liên quan đến kiểu gen của cây cho bao phấn. Điều này chứng tỏ khả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 năng nuôi cấy bao phấn lúa cũng do gen điều khiển, đối với những giống phản ứng tốt có thể chứa nhiều gen tác động lên quá trình này. Để tăng hiệu quả nuôi cấy có thể bằng cách lai tạo nhằm cải tiến giống. Ví dụ : ở khoai tây kiểu gen phản ứng tốt có thể thu đƣợc bằng cách lai giữa kiểu gen phản ứng kém với kiểu gen phản ứng tốt. Phải thay đổi điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy cho từng loại cây trồng thậm chí cho từng giống cây trong cùng một loài. 1.3.8.2. Giai đoạn phát triển của bao phấn Giai đoạn phát triển của bao phấn tại thời điểm tách rời ra và nuôi cấy cũng có ảnh hƣởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy. Đối với lúa giai đoạn phản ứng tốt nhất là trƣớc và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đƣờng trong môi trƣờng nuôi cấy tăng từ 6% đến 9% (Chen, 1978). Các tác giả Oono (1975), Lin (1976) và Chen (1977) cho thấy: Mẫu bao phấn đƣợc lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai đoạn đơn bào muộn là tốt nhất. Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả năng phát triển trong môi trƣờng nuôi cấy invitro. Bao phấn ở giai đoạn đơn bào sớm phát triển kém. Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi tứ tử (giai đoạn đơn bào giữa đến đơn bào muộn). 1.3.8.3. Điều kiện sinh lý của cây cho bao phấn Chen và Lin (1976), Chen và Tsay (1984) cho rằng bao phấn nào đƣợc lấy ở những bông trỗ sớm thì cho kết quả nuôi cấy tốt hơn bao phấn lấy ở những bông trỗ muộn. Tỷ lệ tạo callus ở bao phấn lấy từ nhánh cấp 3 thấp hơn bao phấn từ nhánh cấp 1, cấp 2 và từ cây mẹ. Lý do bao phấn từ nhánh cấp 3 cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn có thể những nhánh này thiếu dinh dƣỡng.Tuy nhiên không có sự sai khác giữa những hoa ở các vị trí khác nhau trên cùng một nhánh. Nhìn chung cây nào sinh trƣởng khoẻ, trong điều kiên môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu, có cƣờng độ ánh sáng mạnh thƣờng cho bao phấn có tỷ lệ thành cây cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 1.3.8.4. Nhiệt độ và thời gian xử lý đòng Kết quả nghiên cứu của Zhou và c.s (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn. Điều kiện lạnh làm tăng khả năng tạo cây xanh. Hiệu quả của xử lý trƣớc nhiệt độ thấp đến việc hình thành callus và cây con đã đƣợc nghiên cứu bởi một số tác giả về một số phƣơng pháp xử lý nhƣ: Xử lý bông đã tách bẹ, xử lý bông chƣa tách bẹ hoặc xử lý bao phấn đã đƣợc nuôi cấy. Tất cả các phƣơng pháp đó đều cho kết quả tốt, Tuy nhiên tốt hơn cả là theo phƣơng pháp của Genovest và Magill (1979), xử lý bông còn nằm trong bẹ lá đòng ở nhiệt độ 10- 130C trong 10-14 ngày [11] Tsay và Chen (1984), Lin và Tsay (1984) phát hiện ra rằng những hạt phấn đƣợc xử lý lạnh đột ngột ở 8-100C trong 7 ngày tạo ra nhiều callus hơn gấp 2 lần so với không xử lý. Tuy nhiên kết quả không khác biệt khi xử lý lạnh bao phấn đã cấy trên môi trƣờng. Theo Chen và Cs (1982), thời gian xử lý lạnh dài 8-10 ngày tốt hơn 2-4 ngày. Tuy nhiên nếu kéo dài thời gian này quá 15 ngày lại ức chế quá trình hình thành callus. Lin và Tsay (1984), Tsay và c.s (1988) cho biết callus hình thành từ bao phấn đƣợc xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn bội và ít cây lƣỡng bội hơn là từ bao phấn không xử lý, điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh thành cây cao. Các giống khác nhau đòi hỏi điều kiện xử lý khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng ảnh hƣởng đến hiệu quả của xử lý. Tsay và c.s (1988) thấy rằng khả năng hình thành callus tăng gấp 2 lần khi xử lý bao phấn chứa bào tử ở giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7-14 ngày, quá 14 ngày thì tỷ lệ cây xanh giảm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Nói chung đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đòng đến kết quả nuôi cấy bao phấn. Kết quả của các tác giả cho thấy rằng xử lý đòng ở nhiệt độ khác nhau sẽ cho kết quả nuôi cấy khác nhau. 1.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.4.1. Khái niệm nuôi cấy bao phấn Nuôi cấy bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chƣa chín trong môi trƣờng nhân tạo nhằm tạo cây đơn bội và đƣợc sử dụng rộng rãi trong cải tiến giống cây trồng. Thông qua phƣơng pháp này rút ngắn thời gian chọn tạo, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giải quyết vấn đề lai xa. Từ đó tạo dòng thần từ nuôi cấy bao phấn F1 hoăc F2 trong thời gian ngắn. Kỹ thuật nuôi cấy invitro kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong môi trƣờng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn. Cho phép nhân nhanh chóng, tạo ra hàng loạt cây đơn bội đó là một lối thoát kì diệu đối với ứng dụng cây đơn bội, di truyền giống cây trồng [10]. Bình thƣờng sự phát triển của tế bào sinh dục đực trong bao phấn đi theo các giai đoạn sau: Từ bào tử tế bào mẹ thông qua tính phân bào giảm nhiễm hình thành tiểu bào tử (đơn bội). Sau đó các tiểu bào tử hình thành các giao tử đực (hạt phấn cũng đơn bội). Nhƣng khi ta đƣa bao phấn và nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác đi. Dƣới sự tác động của hàng loạt các yếu tố trong môi trƣờng nhân tạo, đặc biệt là các chất kích thích sinh trƣởng, trong tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hoá, từ đó các bào tử sẽ phân chia thành mô sẹo, các mô sẹo này lúc đầu là đơn bội. Sau đó tuỳ theo từng điều kiện nuôi cấy chúng có thể là đơn bội hay lƣỡng bội hoá, khi chuyển vào trong môi trƣờng tái sinh cây, ta sẽ thu đƣợc cây đơn bội hay lƣỡng bội. Khi cần thiết cây đơn bội thu đựơc ta có thể xử lý bằng colchicine để lƣỡng bội hoá dòng đơn bội thu đƣợc (Theo Phan Khải, Vũ Đức Quang và cộng sự, 1990). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 1.4.2. Các giai đoạn chính 1.4.2.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị Đây là giai đoạn lựa chọn đối tƣợng nuôi cấy (cây trồng, giống) từ đó xác định bộ phận thích hợp của cây để làm vật liệu nuôi cấy. (Ví dụ: thân, lá, chồi, nụ, cuống hoa, đế hoa, hạt phấn...).. Song song với việc chuẩn bị mẫu cấy là tiến hành vệ sinh và khử trùng phòng nuôi cấy, các dụng cụ nuôi cấy, mẫu cấy. Yêu cầu đối với mẫu cấy trƣớc khi đƣa vào nuôi cấy là phải đƣợc vô trùng, tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trƣởng nhanh. Kết quả giai đoạn này đƣợc quyết định bởi kỹ năng lấy mẫu, nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý khử trùng mẫu cấy. 1.4.2.2. Giai đoạn 2: Cấy mẫu tạo mô sẹo Sau khi vật liệu cấy đã đƣợc khử trùng trong thời gian nhất định thì tiến hành cấy mẫu vào môi trƣờng invitro. (vào mẫu) để tạo mô sẹo. Yêu cầu của giai đoạn này là phải hạn chế tối đa tỷ lệ nhiễm nấm và khuẩn trong phòng nuôi cấy. 1.4.2.3. Giai đoạn 3: Tái sinh chồi Khi mẫu cấy trong ống nghiệm đã tạo đƣợc nhiều mô sẹo thì tiến hành cấy tái sinh. Yêu cầu của giai đoạn này là tái sinh một cách định hƣớng sự phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình đƣợc điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin/xytokinin đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Để tái sinh mẫu nuôi cấy trong ống nghiệm thƣờng sử dụng chồi đỉnh, chồi nách, mô sẹo… 1.4.2.4. Giai đoạn 4: Nhân nhanh chồi Để tạo hệ số nhân chồi cao nhất, tiến hành cấy chuyển các chồi đƣợc tái sinh ở mẫu tái sinh sang môi trƣờng dinh dƣỡng mới. Ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trƣởng:auxin, xytokinin…các chất bổ sung khác nhƣ: nƣớc dừa, dịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 chiết nấm men…đồng thời điều khiển nhiệt độ ánh sáng thích hợp…tạo điều kiện tốt nhất cho chồi sinh trƣởng tốt, tăng hệ số nhân chồi tái sinh. Tùy thuộc vào đối tƣợng nuôi cấy ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành cụm chồi hoặc kích thích sự phát triển chồi nách. 1.4.2.5. Giai đoạn 5: Cấy tạo rễ Khi chồi đạt đƣợc kích thƣớc nhất định ta cấy chuyển các chồi đó sang môi trƣờng ra rễ. Thƣờng sau 2-3 tuần từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh. ở giai đoạn này ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các auxin có chức năng tạo rễ phụ từ chồi. Thông thƣờng, các nhóm chất IAA, NAA, 2,4D đƣợc sử dụng nhiều trong quá trình nghiên cứu và sản xuất, tác dụng xúc tiến hình thành rễ từ chồi tái sinh. Mỗi một loài cây, loại mô sẽ yêu cầu một nồng độ hoá chất khác nhau để tạo rễ tốt nhất. 1.4.2.6. Giai đoạn 6: Đƣa cây tái sinh trở về điều kiện sống tự nhiên Đây là công đoạn cuối cùng của quá trình nuôi cấy invitro. Cây đã tái sinh hoàn chỉnh (đủ rễ, thân, lá) đƣợc đƣa ra khỏi ống nghiệm, thuần dƣỡng trong các môi trƣờng nhƣ đất, môi trƣờng thuần dƣỡng lỏng… kết quả của giai đoạn này sẽ quyết định khả năng ứng dụng cây invitro trong các chƣơng trình giống hoặc vào các mục đích khác nhau. 1.5. Kỹ thuật đơn bội Invitro và công tác giống cây trồng 1.5.1. Cây đơn bội Cây trồng trong tự nhiên da dạng về loài và mỗi loài có mức bội thể khác nhau. Song, hầu hết cây trồng có nhiễm sắc thể lớn hơn 1 dạng nhị bội thể 2n là phổ biến. Cũng có những loài cây có bộ nhiễm sắc thể tam bội, tứ bội, lục bội....ví dụ nhƣ: Cây mía, cây khoai lang có bội nhiễm sắc thể hỗn loạn 2n, 4n và 6n. Nhƣ vậy, mỗi đặc điểm di truyền của chúng đều bị hai hay nhiều gen chi phối, một số gen sẽ có trên 2alen và có hiện tƣợng trội hoặc lặn của một gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Nếu cây đa bội thể mang những cặp gen dị hợp tử thì biểu hiện kiểu hình là do các tính trạng trội hoặc lặn quyết định. Đối với những cây có nhiễm sắc thể đơn bội thì kiểu hình sẽ phản ánh trung thực kiểu gen. Dựa vào đặc điểm này ngƣời ta có thể nhận biết dễ dàng các đột biến lặn của giống đang nghiên cứu. Vì vậy cây đơn bội là vật liệu lý tƣởng trong công tác chọn giống cây trồng. Trong cơ thể thực vật, chỉ có hạt phấn và noãn là những tế bào đơn bội (1n). Từ năm 1924 Blakeslee và cộng sự đã chứng minh đƣợc rằng: Hoàn toàn có thể thu đƣợc những dòng đồng hợp tử nhị bội thuần bằng cách nhị bội hoá cơ thể đơn bội. Năm 1968, Mizenkes oono (Nhật Bản) đã thành công trong việc tạo cây lƣỡng bội đồng hợp tử tuyệt đối từ cây đơn bội bằng phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn lúa. Hiện nay đã có 65 loại cây trồng đƣợc tạo ra bằng con đƣờng đơn bội. Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro bằng cách kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây thông qua nuôi cấy bao phấn đã tạo ra hàng loạt cây đơn bội một cách nhanh chóng. Đây là thành tựu vô cùng to lớn, mở ra một hƣớng đi mới trong lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào công tác chọn giống cây trồng, có thể rút ngắn thời gian tạo giống từ 5 đến 7 năm. 1.5.2. Kỹ thuật đơn bội trong công tác chọn tạo giống cây trồng 1.5.2.1. Tạo cây từ hạt phấn của các