Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy của lá cây bồng bồng - Nguyễn Hữu Duy Khang

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TUYẾN TỤY CỦA LÁ CÂY BỒNG BỒNG Nguyễn Hữu Duy Khang(1), Nguyễn Trung Nhân(1) (1) Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (VNU-HCM) Ngày nhận bài 27/05/2018; Ngày gửi phản biện 17/06/2018; Chấp nhận đăng 09/07/2018 Email: ntnhan@hcmus.edu.vn Tóm tắt Từ cao methanol bộ phận lá của cây bồng bồng (Calotropis gigantea), 12 hợp chất đã được phân lập gồm 3 chất mới: 9′-methoxypinoresinol (1), calofurfuralside A (2), calofurfuralside B (3) và 9 hợp chất đã biết (4-12): 2-methylpyridin-3-ol (4), 5-hydroxymethyl-2-furfuraldehyde (5), (+)-syringaresinol (6), (+)-pinoresinol (7), (+)-pinoresinol-4-O-(6’’-O-vanilloyl)-β-D-glucopyra-noside (8), isoliquiritigenin (9), 14α-hydroxypregna-4,6-diene-3,20-dione (10), pregna-4,6-dien-3,20-dione (11), calotropone (12). Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ NMR và khối phổ MS. Trong đó, 2 hợp chất (1) và (9) thể hiện hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư tụy PANC-1 với IC50 lần lượt là of 3.7 and 3.3 μM, mạnh hơn so với chứng dương Gemcitiabine (IC50, 5.4 µM). Từ khóa: bồng bồng, Calotropis gigantea, Ung thư tụy, PANC-1 Abstract PHYTOCHEMICAL AND CYTOTOXIC STUDIES ON THE LEAVES OF CALOTROPIS GIGANTEA From methanol extract of the leaves of Calotropis gigantean, a new lignan, 9′-methoxypinoresinol (1), and two new glycosylated 5-hydroxymethylfurfurals, calofurfuralside A (2), and calofurfuralside B (3), together with nine known compounds (4–12) 2-methylpyridin-3-ol (4), 5-hydroxymethyl-2-furfuraldehyde (5), (+)-syringaresinol (6), (+)-pinoresinol (7), (+)-pinoresinol-4-O-(6’’-O-vanilloyl)-β-D-glucopyranoside (8), isoliquiritigenin (9), 14α-hydroxypregna-4,6-diene-3,20-dione (10), pregna-4,6-dien-3,20-dione (11), calotropone (12) were isolated. Their structures were elucidated on the basis of NMR and MS data. Among the isolated compounds, compounds 1 and 9 exhibited potent cytotoxicity against PANC-1 human pancreatic cancer cell line with IC50 values of 3.7 and 3.3 μM, respectively, more stronger than those of positive control, gemcitabine (IC50, 5.4 µM). 1. GIỚI THIỆU Cây Bồng bồng (Calotropis gigantea) được phân bố khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Châu Phi và Châu Á (Bangladesh, Trung quốc, Burma, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Pakistan, Philippine, Thái Lan, Sri Lanka, Singapore, đảo Timor, Cuba, New Guinea,). Ở nước ta, cây mọc hoang và được trồng khắp nơi, từ miền Bắc vào miền Nam thường mọc trên đất có cát ở các tỉnh ven biển, nhưng cũng gặp ở vùng đồng bằng và các vùng trung du [1,3]. Thân cây nhỏ cao 4-7 m có thể cao hơn nếu để tự nhiên. Cành có lông trắng. Hoa lớn, đều, 5 cánh tỏa ra 5 hướng mọc thành xim gồm nhiều tán đơn hay kép. Bao phấn hàn liền với đầu nhị. Hạt phấn ở mỗi ô hợp thành một khối phấn có chuôi đính với 2 lá noãn rời nhau, bầu thượng, đầu nhụy dính liền với các bao phấn. Quả: gồm 2 đại, nhiều hạt, dài khoảng 20 mm, trên hạt có chùm lông [1,2]. 2. THỰC NGHIỆM Thiết bị và hóa chất: Máy đo khối phổ HR-ESI-MS (microOTOF-Q 10187), đèn UV hai bước sóng 254/365 nm (Spectroline ENF-240C/FE, USA), máy cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Avance) với tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR. Bản mỏng sắc ký trên bản nhôm tráng sẵn và sắc ký cột sử dụng silica gel Merck Kielselgel 60 F254 (0,040-0,063 mm) và silica gel Merck 60 RP-18: Lichroprep RP-18 (0,040-0,063 mm) Nguyên liệu: Lá cây Bồng bồng được thu hái tại Tp. Phan Thiết vào tháng 6 năm 2011, được nhận danh bởi Tiến sĩ Võ Văn Chi. Ly trích và phân lập: Lá cây được rửa sạch, phơi khô và xay nhỏ thành bột. Bột lá khô (20 kg) được chia làm nhiều phần trích nóng với MeOH. Mỗi phần trích khoảng 200 g bột và 1,5 lít MeOH, trích 3 lần mỗi lần trong 3 giờ. Toàn bộ dịch trích sau khi cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất kém thu được cao MeOH thô (2 kg). Hòa tan cao MeOH vào nước (500ml) sau đó trích lỏng - lỏng với các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần: petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, n-butanol. Thu hồi dung môi dưới áp suất kém thu được cao tương ứng. Sắc kí cột silica gel pha thường cao chloroform (100g) cùng với hệ dung môi giải ly n-hexane (H) : ethyl acetate (EA) (độ phân cực tăng dần từ 0 – 100% EA thành 8 phân đoạn (A → H). Sắc ký cột phân đoạn A (4,8 g) với hệ dung môi giải ly n-hexane (H) : ethyl acetate (EA) (0-100% EA) thu được 5 phân đoạn (A1 → A5). Tiếp tục sắc ký cột phân đoạn A2, A3, A4 với hệ dung môi giải ly chloroform (C) : ethyl acetate (EA) (0-100% EA) kết hợp với sắc ký điều chế với các hệ dung môi 100% C, H:C, C:EA ở các tỷ lệ khác nhau thu được 4 hợp chất (2), (3), (8) và (10). Sắc ký cột phân đoạn B (3,9 g) với hệ dung môi giải ly n-hexane (H) : ethyl acetate (EA) (0-100% EA) thu được 6 phân đoạn (B1 → B5). Tiếp tục sắc ký cột phân đoạn B3, B4, B5 với hệ dung môi giải ly chloroform (C) : ethyl acetate (EA) (0-100% EA) kết hợp với sắc ký điều chế với các hệ dung môi 100% C, H:C, C:EA ở các tỷ lệ khác nhau thu được 4 hợp chất (1), (5), (6) và (9). Sắc ký cột phân đoạn C (3,6 g) với hệ dung môi giải ly n-hexane (H) : ethyl acetate (EA) (0-100% EA) thu được 4 phân đoạn (C1 → C4). Tiếp tục sắc ký cột phân đoạn C4, C5 với hệ dung môi giải ly chloroform (C) : ethyl acetate (EA) (0-100% EA) kết hợp với sắc ký điều chế với các hệ dung môi C:EA ở các tỷ lệ khác nhau thu được 2 hợp chất (4), (7), (11) và (12). 9′-methoxypinoresinol (1): 1H-NMR (CH3OH, 500 MHz) δH (ppm) 7.11 (d, 1.9 Hz, H-2); 6.88 (dd, 8.1 & 1.9 Hz, H-5); 6.79 (d, 8.1 Hz, H-6); 7.02 (d, 1.8 Hz, H-2’); 6.85 (dd, 8.1 & 1.8 Hz, H-5’); 6.81 (d, 8.1 Hz, H-6’), 3.15 (dddd, 8.1 & 6.2 & 6.2 & 2.9 Hz, H-8); 2.90 (dd, 8.1 & 8.1 Hz, H-8’), 4.96 (d, 6.2 Hz, H-7); 4.73 (d, 7.5 Hz, H-7’); 5.08 (s, H-9’), 3.96 (dd, 8.9 & 2.9 Hz, H-9a); 4.26 (dd, 8.9 & 6.2 Hz, H-9b), 3.85 (3H, s), 3.86 (3H, s), 3.35 (3H, s)]. 13C-NMR: C-1 (135.7), C-1’ (134.6), C-2 (111.1), C-2’ (110.5), C-3 (148.5), C-3’ (148.5), C-4 (147.1), C-4’ (147.0), C-5 (115.7), C-5’ (115.4), C-6 (120.3), C-6’ (119.6), C-8 (δC 54.1), C-8’ (δC 62.7), C-7 (δC 89.4), C-7’ (δC 84.4), C-9 (δC 73.2), C-9’ (δC 109.0), C-3 (δC 56.3), C-3’ (δC 56.2), 9’-OCH3 (δC 55.0). Calofurfuralside A (2): 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH (ppm) 7.20 (d, 3.50 Hz, H-3); 6.53 (d, 3.5 Hz, H-4)], 9.61 (s, -CHO), [4.73 (d, 13.9 Hz, H-5a); 4.64 (d, 13.9 Hz, H-5b)]. (5.28, dd, 5.3 & 1.0 Hz, H-1’), 3’-OCH3 (3.33, 3H, s), 1.23 (d, 6.5 Hz, 2H-6’), 3.93 (dd, 7.2 & 2.2 Hz, H-3’), 3.93 (dd, 2.8 & 2.2 Hz, H-4’), 3.99 (dq, 6.5 & 2.8 Hz, H-5’). 13C-NMR C-2 (dC 152.9), C-3 (dC 121.9), C-4 (dC 111.4)], C-5 (dC 158.7)], C-6 (dC 61.3), -CHO (dC 177.8). C-1’ (dC 103.6), C-2’ (dC 39.0), C-3’ (dC 79.5), C-4’ (dC 87.2), C-5’ (dC 67.3), C-6’ (dC 18.2), –OCH3 (dC 57.5). Calofurfuralside A (3): 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH (ppm) 7.21 (d, 3.5 Hz, H-3); 6.52 (d, 3.5 Hz, H-4), -CHO 9.63 (1H, s), [4.64 (d, 13.5 Hz, H-5a); 4.54 (d, 13.5 Hz, H-5b)], 4.99 (dd, 3.8 & 1.4 Hz, H-1’), 3’-OCH3 (3.38, s), 1.29 (d, 6.2 Hz, 3H-6’), 3.50 (m, H-3’); 3.18 (t, 9.1 Hz, H-4’); 3.69 (m, H-5’). 13C-NMR: C-3 (dC 121.8), C-4 (dC 111.6)], C-2 (dC 153.0), C-5 (dC 158.0)], -CHO (dC 177.9), 5-CH2O- (dC 61.0), C-1’ (dC 97.4), C-2’ (dC 33.9), C-3’ (dC 78.2), C-4’ (dC 76.2), C-5’ (dC 68.2), C-6’ (dC 18.0), –OCH3 (dC 56.7). Hình 1: Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ lá cây Calotropis gigantea 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phổ 1H-NMR và 13C NMR của hợp chất (1) thể hiện các tín hiệu đặc trưng của khung diepoxylignan.[4] Khối phổ HR-ESI-MS của hợp chất (1) cho mũi ion phân tử giả [M+Na]+ ở m/z 411.1449 phù hợp với CTPT C21H24O7 (sai lệch 3.0 mmu). Phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương quan của proton nhóm –OCH3 (δH 3.35) với carbon oximethine C-9’ (δC 55.0) xác định vị trí nhóm –OCH3 tại C-9’. Mặt khác, phổ NOESY cho thấy H-8 (δH 3.15) cho tương quan với H-8’ (δH 2.90), H-7’ (δH 4.73) cho tương quan đồng thời với H-9’ (δH 5.08) và H-7 (δH 4.96). Từ các dữ liệu trên, cấu trúc của hợp chất (1) được xác định là 9′-methoxypinoresinol.[10] Kiểm tra cấu trúc dự đoán bằng cơ sở dữ liệu Scifinder (ChungNam University, Korea) ngày 10/4/2017 cho thấy (1) là hợp chất mới chưa được được công bố trên thế giới. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (2) thể hiện các tín hiệu đặc trưng của vòng furfuralmonoglycoside.[5,6] Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất (2) cho mũi ion phân tử giả [M+Na]+ ở m/z 293.1038 phù hợp với CTPT C13H18O6 (sai lệch 3.7 mmu). Phổ HMBC cho thấy tương quan giữa proton anomer H-1’ (dH 5.28) với carbon C-6 (δC 61.3) xác định phần đường gắn vào phần aglycone tại C-6. Tương quan HMBC giữa H-1’ (dH 5.28) với C-4’ (dC 87.2) đồng thời H-1’ có dạng mũi đôi với giá trị hằng số ghép 1.0 và 5.0 Hz cho thấy đây là một đơn vị đường α-furanose.[60] Phổ NOESY cho thấy proton Hb-2’ (dH 2.16) cho tương quan đồng thời với H-1’ (dH 5.28) và H-3’ (dH 3.92) chứng tỏ 3 proton này nằm cùng bên mặt phẳng trung bình của vòng. Mặt khác không cho thấy rõ tương quan giữa H-4’ với H-3’. Tuy nhiên giá trị hằng số ghép nhỏ J3’,4’= 2.2 Hz cho phép dự đoán H-4’ nằm khác phía so với H-3’. Từ các dữ kiện trên, phần đường trong hợp chất (2) được xác định là 1 đơn vị α-L-diginofuranose.[6-9] Cấu trúc lập thể của hợp chất (2) được kết luận là 5-(α-L-diginofuranosyloxymethyl)furfural (hình 1). Kiểm tra cấu trúc dự đoán bằng cơ sở dữ liệu Scifinder (Chung Nam University, Korea) ngày 10/4/2017 cho thấy (2) là hợp chất mới chưa được công bố trên thế giới. Tên gọi của hợp chất (2) được đề nghị là calofurfuralside A [10]. Phổ 1H-NMR và 13C NMR của hợp chất (3) cũng thể hiện các tín hiệu đặc trưng của 1 furfuralmonoglycoside tương tự hợp chất (2).[5,6] Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất (3) cho thấy mũi ion phân tử giả [M+Na]+ ở m/z = 293.1013 là hoàn toàn phù hợp với CTPT C13H18O6 (sai lệch 1.2 mmu). Tương quan giữa proton anomer H-1’ (dH 4.99, dd, 3.8 & 1.4) với C-5’ (dH 68.2) cho thấy đây là 1 đơn vị đường α-pyranose. Mặt khác, dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR phần đường của hợp chất (2) khi so sánh với tài liệu tham khảo[6] cho thấy đây là 1 đơn vị đường α-L-cymaropyranose. Kiểm tra cấu trúc dự đoán bằng cơ sở dữ liệu Scifinder (ChungNam University, Korea) ngày 10/4/2017 cho thấy (3) là hợp chất mới chưa được công bố trên thế giới. Tên gọi của hợp chất (3) được đề nghị là calofurfuralside B.[10] Bảng 1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy PANC-1 các hợp chất cô lập được từ cao methanol bộ phận lá của cây Calotropis gigantea STT Mẫu thử IC50 (µM) STT Mẫu thử IC50 (µM) 1 (1) 3.7 7 (7) 37.5 2 (2) >100 8 (8) >100 3 (3) >100 9 (9) 3.3 4 (4) >100 10 (10) >100 5 (5) >100 11 (11) >100 6 (6) 61.1 12 (12) 18.7 Cao MeOH 4.8 Gemcitabine 5.8 Kết quả cho thấy, 5 trong tổng số 12 hợp chất được thử nghiệm thể hiện hoạt tính gây độc tế bào PANC-1 trong điều kiện nuôi cấy tế bào DMEM, thời gian ủ 72h. Trong đó 2 hợp chất 9′-methoxypinoresinol (1) và isoliquiritigenin (9) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh hơn so với chất đối chứng dương Gemcitabine (IC50, 5.4 µM) và cao MeOH ban đầu (IC50, 4.8 µM) với giá trị IC50 lần lượt là 3.7 μM và 3.3 μM. 3 hợp chất (+)-syringaresinol (6), (+)-pinoresinol (7) và calotropone (12) cũng thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư tụy PANC-1. 4. KẾT LUẬN Từ cao methanol bộ phận lá của cây Bồng bồng (Calotropis gigantea), 12 hợp chất đã được phân lập. Thông qua các kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và NOESY), khối phổ phân giải cao (HR-ESI-MS) cũng như so sánh với các tài liệu tham khảo, cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định, trong đó có 3 hợp chất mới [(1), (2), (3)], 6 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong bộ phận lá của cây bồng bồng [(4), (5), (6), (10), (11), (12)]. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư tuyến tụy cho thấy cao MeOH của lá và 2 hợp chất (1) và (9) có hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư tuyến tụy PANC-1. Kết quả nghiên cứu là những bằng chứng ban đầu về tiềm năng ức chế tế bào ung thư tuyến tụy của lá cây bồng bồng mọc ở nước ta. TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, NXB. Thời đại. Võ Văn Chi (2004). Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam. NXB Giáo dục. I. Prassas and E. P. Diamandis (2008). Novel therapeutic applications of cardiac glycosides. Nature Reviews Drug Discovery, 7(11), 926-935. K. Takahashi and T. Nakagawa (1965). Studies on constituents of medicinal plants-The stereochemistry of paulownin and isopaulownin. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 14(6), 641-647. A. T. Khalil, F. R. Chang, C. C. Liaw, P. Ramesh, S. S. F. Yuan, Y. C. Wu (2003). Chemical constituents from the Hydrangea chinensis. Archives of Pharmacal Research, 26(1), 15-20. M. Brasholz, H-U Reißig (2009). Alkoxyallene-based de novo synthesis of rare deoxy sugars: New routes to L-cymarose, L-sarmentose, L-diginose and L-oleandrose. European of Journal Organic Chemistry, 3595‒3604. H. Bai, W. Li, K. Koike, T. Satou, Y. Chen, T. Nikaido (2005). Cynanosides A–J, ten novel pregnane glycosides from Cynanchum atratum. Tetrahedron, 61, 5797‒5811. R. S. Coleman, J. R. Fraser (1993). Acylketene [4+2] cycloadditions: divergent de novo synthesis of 2,6-dideoxy sugars. The Journal of Organic Chemistry, 58, 385‒392. C. Tamm, T. Reichstein (1948). Synthese des 2-desoxy-D-fucose-3-methylathers und seine identifizierung mit D-diginose, Desoxyzucker, 17. Mitteilung. Helvetica Chimica Acta, 31, 1630‒1644. Duy-Khang H. Nguyen, Phu H. Dang, Hai X. Nguyen, Thanh-Mai T. Nguyen, Suresh Awale, Nhan T. Nguyen (2017). Phytochemical and cytotoxic studies on the leaves of Calotropis gigantea. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 27(13), 2092-2096.