Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây kim giao núi đất thu tại Lâm Đồng, Việt Nam - Phần 2. Các hợp chất biflavonoid, steroid và phenolic - Nguyễn Thị Liễu

TẠP CHÍ HÓA HỌC 54(3) 391-395 THÁNG 6 NĂM 2016 DOI: 10.15625/0866-7144.2016-00325 391 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KIM GIAO NÚI ĐẤT THU TẠI LÂM ĐỒNG, VIỆT NAM Phần 2. Các hợp chất biflavonoid, steroid và phenolic Nguyễn Thị Liễu1, Phạm Thị Ninh2, Trần Thị Phương Thảo2, Trần Văn Lộc2, Đinh Thị Phòng3, Nguyễn Thị Hoàng Anh2, Nguyễn Thị Lưu2, Trần Văn Chiến2, Trần Văn Sung2* 1Đại học Thủ Đô Hà Nội 2 Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3 Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Đến Tòa soạn 8-6-2016; Chấp nhận đăng 10-6-2016 Abstract In the frame work of the TÂY NGUYÊN 3 Program, the rare, ancient plant Nageia wallichiana (Kim giao núi đất) was collected in Lam Dong province and chemically, biologically studied. As results, three biflavonoids: amentoflavone (1), 4”’-O-methylamentoflavone (podocarpus flavone A) (2), 4’,4’’’,7’’-trimethoxyamentoflavone (3), 5- hydroxystigmastane-6-one-3β-hexadecanoate (4), β-sitosterol (5) and 2-(4-hydroxyphenyl)-propane-1,3-diol (6) have been isolated. The structures of these compounds were determined by their MS, HR-MS, NMR, (1D and 2D) spectra and comparis on with the data in literatures. The cytotoxicity of compound 4 on eight human cancer cell lines has been tested. This is the first report of these compounds from Nageia wallichiana. Keywords. Nageia wallichiana, biflavonoids, amentoflavone, steroids, phenolic compound, cytotoxicity 1. MỞ ĐẦU Cây Kim giao núi đất [Nageia wallichiana (C.Presl)] thuộc họ kim giao [Podocarpaceae] là cây thường xanh có thể cao tới hơn 30 m. Nageia wallichiana còn có tên đồng nghĩa là Decassocapus wallichiana (Presl.) de Laub, N. blumei Endl.) Gordon, Podocarpus agathifloria Blume, Podocar- pus blumei Endl., Podocarpus latifolia var. ternatensis de Boer, Podocarpus wallichianus (Presl.). Cây này phân bố tại Myamar, Nam Trung Quốc, Ấn Độ (Assam), Malaysia, New Guinea, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam [1]. Gỗ của cây được sử dụng làm đũa ăn, nhạc cụ, đồ mỹ nghệ, đồ gia dụng [2]. Cho đến nay chưa thấy công bố nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Kim giao núi đất. Các nghiên cứu về các loài khác trong chi Kim giao (Nageia) cho thấy chúng chứa các hợp chất biflavonoid, terpenoid bao gồm cả nor- và dinorditerpen lacton. Các chất trong chi này thường có hoạt tính độc với côn trùng, gây ngán ăn cho côn trùng, kháng viêm, ức chế β-secretase. Trong bài này chúng tôi thông báo việc chiết tách, tinh chế và xác định cấu trúc của ba biflavonoid, hai hợp chất steroid và một hợp chất phenolic. Đồng thời hoạt tính gây độc tế bào của chất 4 trên tám dòng tế bào ung thư ở người: Hep- G2 (ung thư gan), KB (ung thư miệng), LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú), SK-MeI2 (ung thư sắc tố), HL-60 (ung thư máu cấp), SW626 (ung thư buồng trứng), SW480 (ung thư ruột kết) cũng được thử nghiệm. 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị Phổ FT-IR được ghi trên máy Nicolet IMPACT 410 dưới dạng viên nén KBr. Phổ ESI-MS được ghi trên máy AGILENT 1100 LC-MSD của hãng Varian. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được ghi trên thiết bị Varian FT-ICR-MS. Phổ NMR ghi trên thiết bị Bruker AM 500 FT-NMR với TMS làm nội chuẩn, 500 MHz cho 1H và 125 MHz cho 13 CNMR. SiO2 Merck 63-200 μm, RP18 (Merck, 75 μm) và Sephadex LH20 (Merck) được sử dụng cho sắc kí cột. Sắc ký lớp mỏng sử dụng silicagel G60 F254 và RP-18F254 tráng sẵn trên bản nhôm. TCHH, 54(3), 2016 Trần Văn Sung và cộng sự 392 2.2. Mẫu thực vật Lá, cành và vỏ cây Kim giao núi đất được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng vào tháng 8/2012 do TS. Nguyễn Tiến Hiệp, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật xác định tên. Tiêu bản số CPC 4715 được lưu giữ tại Viện Hóa học và Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, số 18, đường Hoàng Quốc Việt, Hà Nội. 2.3. Hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện tại viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo qui trình chuẩn của Viện Ung thư học Hoa Kỳ (NCI) [10]. 2.4. Chiết tách và tinh chế chất Lá và cành cây Kim giao núi đất (1100g) đã sấy khô, xay nhỏ được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat và metanol ở nhiệt độ phòng. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở 60 oC thu được các cặn chiết n-hexan (16 g), etylaxetat (39 g) và metanol (20g). Cặn chiết etylaxetat (39 g) được tách trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/EtOAc (100:0→0:100) thu được 33 phân đoạn (EA1- EA33). Phân đoạn EA31 (353 mg) được tách lại trên cột silica gel (CH2Cl2/MeOH 99:1→70:30) thu được 9 phân đoạn (EA31.1→EA31.9). Phân đoạn EA31.1 (45 mg) được kết tinh trong CH2Cl2/MeOH 80:20 thu được 15 mg chất 3 là bột màu vàng. Phân đoạn EA31.7 (60 mg) sau khi kết tinh lại trong ống nghiệm thu được 25 mg chất 2 là bột màu vàng. Phân đoạn EA11 (70mg) được tách lại trên cột silica gel (n-hexan/CH2Cl2 60:40) thu được 5 phân đoạn (EA11.1-EA11.5). Phân đoạn EA11.3 tự kết tinh cho 40 mg chất 4. Phân đoạn EA29 và EA30 gộp lại được (3,4 g) và tách lại trên cột silica gel (CH2Cl2/MeOH 95:5) thu được 5 phân đoạn (EA29.30.1-EA29.30.5). Tách lại phân đoạn EA29.30.4 (165 mg) trên cột pha đảo RP18 (MeOH /H2O 3:1) thu được 25 mg chất 1. Cặn chiết metanol (20 g) được tách trên cột silica gel (CH2Cl2/MeOH 98:2→90:10) thu được 7 phân đoạn (ME5.1→Me5.7). Phân đoạn Me5.6 (25 mg) sau khi tinh chế trên cột sephadex LH20 (MeOH) thu được 7 mg chất 6. Từ vỏ cây Kim giao núi đất (300g) cũng được chiết tương tự như trên thu được cặn chiết n-hexan (2,6 g), etylaxetat (5,8 g) và metanol (20 g). Cặn chiết n-hexan (2,6 g) được sắc ký lặp lại hai lần trên cột silica gel (n-hexan/EtOAc 98:2→0:100) thu được 20 mg chất 5. 2.5. Số liệu phổ của các chất tách được Chất 1 (amentoflavone): ESI-MS (ion dương) m/z 539 [M+H] + ; ESI-MS (ion âm) m/z 537 [M-H] - ; 1 H và 13 CNMR, xem bảng 1. Chất 2 (4”’-O-metylamentoflavon, artocarpus flavone A): ESI-MS (ion dương) m/z 575 [M+Na]+, 553 [M+H] + ; ESI-MS (ion âm) m/z 551 [M-H] - . 1 H- và 13 C-NMR, xem bảng 1 Chất 3 (4’,4’’’,7’’-trimethoxylamentoflavone): HR-ESI-MS (ion dương) m/z 581,1415 (C34H27O9, [M+H] + , tính toán 581,1442); 1 H- và 13 C-NMR, xem bảng 1. Chất 4 (5-hydroxystigmastane-6-one-3β- hexadecanoate: ESI-MS (ion dương) m/z 707 [M+Na] + , 427 [M-C16H31O-H2O] + ; ESI-MS (ion âm) m/z 719 [M+Cl] - , 13 C-NMR: xem phần kết quả và thảo luận. Chất 5 (β-sitosterol): So sánh phổ 1H- và 13C- NMR của chất 5 với mẫu chuẩn trong phòng thí nghiệm của chúng tôi thấy trùng khớp. Chất 6 [2-(4-hydroxyphenyl)-propan-1,3-diol)]: ESI-MS (ion dương) m/z 169 [M+H]+, 151 [M+H- H2O] + , 133 [M+H-2H2O] + . 1 H-NMR (δppm, CD3OD): 2,88 (1H, quin, J = 7,0 Hz, H-2); 3,74 (2H, dd, J = 6,5; 11,0 Hz, 2H-1); 3,83 (2H, dd, J = 7,0, 11,0 Hz, 2H-3); 6,75 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, H-5’); 7,09 ( 2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, H-6’). 13 C-NMR (CD3OD, δppm): 51, 19 (C-2); 65, 20 (C-1, C-3); 130,18 (C-2’, C6’); 116,21 ( C-3’, C-5’); 132,84 (C-1’); 157,15 (C-4’). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chất 1 cho pic ion giả phân tử tại m/z 539 (75, [M+H] + ) trong phổ ESI-MS ion dương và m/z 537 (100, [M-H] - ) trong phổ ion âm. Phổ 13C-NMR của 1 có 30 tín hiệu của nguyên tử cacbon trong đó có 2 tín hiệu của cacbonyl liên hợp tại δC 181,51 và 181,59 ppm cho thấy đây là một biflavonoid. Phổ 1 HNMR của 1 ghi trong DMSO có tín hiệu của 2 nhóm OH tạo phức càng cua tại δH 13,08 và 13,20 ppm(OH-5,OH-5’). Phối hợp giữa phổ MS, phổ 1H-, 13 C-NMR và DEPT có thể kết luận công thức phân tử của 1 là C30H18O10. So sánh các số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của 1 với số liệu của amentoflavone [3] [4] có thể xác định chất 1 chính là amentoflavone. Chất 2 cho phổ 1H- và 13C-NMR tương tự như phổ của 1, với tín hiệu của 12 proton thơm, 2 nhóm OH tạo phức càng cua tại δH 13,01 và 13,15. Điểm khác duy nhất là trong phổ của chất 2 có thêm một nhóm O-metyl (OCH3) (δH 3,80, δC 55,89) thay thế một nhóm OH trong phổ của 1. Vị trí của nhóm OCH3 được xác định bằng phổ HMBC và HSQC. Trong phổ HMBC có tương tác giữa pic ở δH 3,80 TCHH, 54(3), 2016 Thành phần hóa học và hoạt tính...Phần 2. 393 với pic ở δC (C-4”’), chứng minh rằng nhóm OCH3 được gắn ở (C-4”’). So sánh phổ 1H- và 13C-NMR của chất 2 với phổ của 4”’-O-methylamentoflavone (còn gọi là podocarpusflavone A) [3, 5] thấy hoàn toàn trùng khớp. Phổ khối ESI-MS ion dương của 2 có pic ion giả phân tử tại m/z 575 (40, [M+Na]+), 553 (5, [M+H] + , và 551 (100, [M-H] - ) ở phổ ion âm. Từ các số liệu trên có thể khẳng định chất 2 chính là podocarpus flavone A. Chất 3 có phổ 1H và 13CNMR tương tự như phổ của chất 2. Sự khác nhau chính là ở phổ của 3 có thêm tín hiệu của 2 nhóm OCH3 tại δH: 3,81; 3,87 và δC 55,63; 56,02 ppm. Phổ khối phân giải cao ion dương HR-ESI-MS của chất 3 có pic tại m/z 581.1415 (9, C33H25O10) [M+H] + , tính toán là 581.1442. Có thể thấy là hai nhóm OH của chất 2 đã được thay thế bằng 2 nhóm OCH3 trong chất 3. Vị trí của nhóm -OCH3 được xác định tại C-4’, C-7” và C-4”’ thông qua phổ HMBC. Trong phổ HMBC thấy có các pic giao giữa δH 3,80/δC 162,5 (C-4”’), δH 3,87/δC 162,69 (C-7”), δH 3,81/δC 160,5 (C-4’). Khi so sánh phổ NMR của chất 3 với số liệu phổ của chất 4’,4’’’,7’’-trimethoxy -amentoflavon [3] có thể kết luận chất 3 chính là 4’,4’’’,7’’-trimethoxyamento flavone. Chất 4 có pic ion giả phân tử trong phổ ESI-MS ion dương tại m/z 707 (15, C45H80O4, [M+Na] + ). Trên phổ ESI-MS ion âm có pic ion tại m/z 719 (100, [M+Cl] - ). Ngoài ra còn có pic tại m/z 427 (100, [M-C16H31O (mạch nhánh)-H2O] + ), trong phổ khối ion dương ion hóa theo phương pháp APCI. Phổ 13 C-NMR của chất 4 có một số tín hiệu cộng hưởng quan trọng tại δC (ppm): 212,21 (C=O, xeton), 173,77 (C=O, este), 80,39 ( CH,C-3), 70,29 (C, C-5) trong tổng số nguyên tử cacbon bao gồm 7 nhóm CH3, 8 nhóm CH, 5 nguyên tử C bậc 4 và nhiều nhóm CH2. Đặc biệt tín hiệu của các nhóm CH2 của mạch nhánh tập trung trong vùng từ 29,14 đến 29,71 ppm và chồng lấp. Trên phổ 1HNMR của chất 4 thấy tín hiệu cộng hưởng của 7 nhóm CH3tại δC (ppm): 0,64 (s), 0,82 (s); 0,81 (d, J = 6,0 Hz ), 0,82 (d, J = 6,0 Hz), 0,84 (t, J = 7,0 Hz), 0,88 (t, J = 7 Hz), 0,91(d, J = 6,0 Hz). Ngoài ra còn thấy rõ các tín hiệu tại δ 2,25 (2H, t, J = 7,5 Hz, H2-4), 2,75 (2H, t, H2- 2’), 5,04 (1H, m, H-3). Từ các dữ liệu của phổ MS và NMR có thể dự đoán chất 4 là 5- hydroxystigmastane-6-one-3β-hexadecanoat). Khi so sánh phổ NMR của 4 với số liệu phổ NMR của chất này trong tài liệu [6] thì thấy hoàn toàn trùng khớp. Do đó có thể kết luận chất 4 là 5-hydroxy- stigmastane-6-one-3β-hexadecanoat. 4: 5α-hydroxystigmastane-6-one-3β-hexadecanoate 5: β-Sitosterol Hình 1: Cấu trúc của các chất phân lập từ loài kim giao núi đất TCHH, 54(3), 2016 Trần Văn Sung và cộng sự 394 Chất 5 được xác định là β-sitosterol khi so sánh Rf, phổ 1 H- và 13 C-NMR của nó với chất chuẩn trong phòng thí nghiệm của chúng tôi cũng như trong tài liệu [7]. Chất 6 có các pic ion tại m/z 169 (100, [M+H]+), 151 [M+H-H2O] + , 133 [M+H-2H2O] + trong phổ khối ESI-MS ion dương. Phổ 1H- và 13C-NMR của chất 6 có các tín hiệu hoàn toàn phù hợp với phổ của chất 2-(4-hydroxyphenyl)-propane-1,3-diol [8, 9]. Hoạt tính gây độc tế bào Chất 4 được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư người là Hep-G2 (ung thư gan), KB (ung thư miệng), LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú), SK-MeI2 (ung thư sắc tố), HL- 60 (ung thư máu cấp), SW626 (ung thư buồng trứng), SW480 (ung thư ruột kết) với ellipticine làm đối chứng dương. Tuy nhiên chất 4 tỏ ra không có hoạt tính trên các dòng tế bào ung thư đã thử nghiệm (IC50 > 100 μg/ml). Bảng 1: Số liệu phổ 1H và 13CNMR của các chất 1, 2, 3 Vị trí 1* 2 # 3 + δC δH (J Hz) δC δH (J Hz) δC δH (J Hz) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 2” 3” 4” 5” 6” 7” 8” 9” 10” 1’” 2”’ 3”’ 4”’ 5”’ 6”’ OCH3 OCH3 OCH3 164,56 101,90 181,59 161,39 98,76 163,90 93,93 157,29 103,51 117,95 131,33 123,50 160,46 119,19 126,46 162,77 102,38 181,51 160,54 101,57 160,54 106,87 154,71 101,73 121,76 128,08 115,45 160,46 115,45 128,08 6,77 (s) 6,15 (br s) 6,30 (br s) 8,26 (d, 2,0) 6,89 ( d, 8,5) 7,89 (dd, 2,0; 8,5) 6,68 (s) 6,02 (s) 7,67 (d, 9,0) 6,55 (d, 9,0) 6,55 (d, 9,0) 7,67 (d, 9,0) 13,08 (s, OH) 1320 (s, OH) 164,76 104,19 183,45 162,77 99,78 165,05 94,77 160,24 104,33 120,82 132,58 124,28 162,77 117,48 128,84 165,05 104,33 183,06 162,34 104,19 162,77 105,34 158,80 104,19 123,40 128,91 115,27 163,60 115,27 128,91 55,89 6,73 (s) 6,24 (d, 2,0) 6,51 (d, 2,0) 8,11 (d, 2,5) 7,26 (d, 8,5) 8,04 (dd, 2,5; 8,5) 6,71 (s) 6,46 (br s) 7,73 (d, 9,0) 6,94 (d, 9,0) 6,94 ( d, 9,0) 7,73 (d, 9,0) 13,01 (s, OH) 13,15 (s, OH) 3,81 (s) 163,98 10379 182,84 161,64 99,10 164,02 94,18 157,82 104,35 121,64 130,78 123,12 160,51 111,04 127,92 164,02 102,97 182,28 161,40 104,66 162,69 95,20 153,97 104,75 122,94 127,61 114,27 162,50 114,27 127,61 56,02 55,15 55,65 6,61 (1H, s) 6,28 (br s) 6,41 (br s) 7,86 (d, 2,5) 7,18 (d, 9,0) 8,00 (dd, 2,5, 9,0) 6,61 (s) 6,55 (s) 7,48 ( d, 9,0) 6,84 (d, 9,0) 6,84 (d, 9,0) 7,48 (d, 9,0) 3,89 (s) 3,81 (s) 3,80 *Đo trong DMSO; #Đo trong Aceton; +Đo trong CDCl3+CD3OD. TCHH, 54(3), 2016 Thành phần hóa học và hoạt tính...Phần 2. 395 4. KẾT LUẬN Các chất trên đều lần đầu tiên được tách và xác định cấu trúc từ cây Kim giao núi đất, một loài thực vật quí, hiếm tại Việt Nam và trên thế giới cần được bảo vệ. Lời cảm ơn. Công trình này được tài trợ một phần kinh phí từ Chương trình Tây Nguyên 3 mã số TN3/T15. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1, trang 227, Nxb. Trẻ (1999). 2. Nguyen TH., Pham KL., Nguyen DTL., Thomas PI., Farjon A., Averyanov L. and Regalado J. Vietnam Conifers: Conservation Status Review 2004. Fauna and Flora International, Vietnam Programme, Hanoi (2004). 3. Carbonezi C. A., Hameski L., Gunatilaka A. A. L., cavalheiro A., Castro-Gamboa I., Silva Bolzani V.d., Bioactive flavone dimer from Ourafea multiflora (Ochnaceae), Brazilian Journal of Pharmacognosy, 17(3), 319-324 (2007). 4. Dora G., Edwards J. M. Taxonomic status of Lanaria lanata and isolation of novel biflavone, J. Nat. Prod. 54(3), 796-801 (1991). 5. Markham K. R., Sheppard C., Geiger H. 13C-NMR studies of some naturally occurring amentoflavone and hinokiflavone biflavonoids, Phytochemistry, 26(12), 3335-3337 (1987). 6. Yaming X., Shengding F. The chemical constituents from Podocarpus fleuryi Hickle, Acta Botanica Sinica, 32(4), 302-306 (1990). 7. Chaturvedula V. S., Prakash I. Isolation of stigmasterol and β-ssitosterol from the dicloromethane extract of Rubus suavissimus, Internatinal Current Pharmaceutical Journal, 1(9), 234-242 (2012). 8. Cheng H. M., Chang K. P., Choang T. F., Chow H. F., Chui K. Y., Hon P. M., Lê F. N., Yang Y., Zhong Z. P., Structure Elucidation and Total Synthesis of New Tanshinones Isolated from Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen), J. Org. Chem., 55, 3537-3543 (1990). 9. Tyman J. H. P., Payne P. B. The synthesis of phenolic propane-1,2-and 1,3-diols as intermediates in immobilized chelatants for the borate anion, J. Chem. Res, 691-695 ( 2006). 10. Nguyễn Thị Liễu, Phạm Thị Ninh, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Thị Thủy, Nguyễn Thị Lưu, Trần Văn Lộc, Đinh Thị Phòng, Trần Thị Phương Thảo, Trần Văn Sung. Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài kim giao núi đất (Nageia wallichiana) thu tại tỉnh Lâm Đồng. Phần 1. Các hợp chất diterpenoid, Tạp chí Hóa học, 54(1), 86-92 (2016). Liên hệ: Trần Văn Sung Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Số 18, Đường Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội E-mail: tranvansungvhh@gmail.com.