Nghiên cứu thích ứng chủng virút Cúm mùa trên các dòng tế bào khác nhau

Më ®Çu Virót Cóm lµ t¸c nh©n quan träng g©y bÖnh Cóm cho ng­êi trªn toµn cÇu vµ l©y truyÒn chñ yÕu qua ®­êng h« hÊp. Trong c¸c dÞch Cóm hµng n¨m, 5-15% d©n sè bÞ ¶nh h­ëng do l©y nhiÔm b»ng ®­êng h« hÊp trªn. C¸c tr­êng hîp nhËp viÖn vµ tö vong chñ yÕu x¶y ra ë nh÷ng nhãm cã nguy c¬ cao , nh­ ng­êi cao tuæi vµ ng­êi èm m¹n tÝnh. MÆc dï khã cã thÓ ®¸nh gi¸ ®Çy ®ñ, nh­ng c¸c sè liÖu thèng kª cho thÊy nh÷ng dÞch Cóm nµy g©y ra tõ 3 ®Õn 5 triÖu ca bÖnh vµ kho¶ng 250.000 ®Õn 500.000 ca tö vong mçi n¨m trªn toµn cÇu. Nguy c¬ m¾c bÖnh nÆng vµ tö vong cao nhÊt trong sè c¸c bÖnh nh©n lín h¬n 65 tuæi, trÎ nhá d­íi 2 tuæi, vµ nh÷ng ng­êi cã nguy c¬ m¾c thªm c¸c biÕn chøng tõ Cóm. Theo sè liÖu cña Trung t©m KiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng (The Center for Disease Control and Prevention - CDC, Atlanta, Mü) mçi n¨m ë Mü cã h¬n 200.000 ca nhËp viÖn v× biÕn chøng cña Cóm vµ 36.000 tr­êng hîp chÕt. BÖnh Cóm lan réng nhanh chãng trªn toµn thÕ giíi trong nh÷ng mïa dÞch vµ g©y ra g¸nh nÆng ®¸ng kÓ cho kinh tÕ vµ y häc. BiÖn ph¸p phßng chèng h÷u hiÖu nhÊt ®èi víi dÞch Cóm lµ tiªm phßng v¾c xin. V¾c xin Cóm cã hiÖu qu¶ b¶o vÖ 70-90% trªn ng­êi trÎ tuæi m¹nh kháe nÕu kh¸ng nguyªn v¾c xin phï hîp víi chñng virót Cóm ®ang l­u hµnh. Dùa trªn th«ng tin thu thËp ®­îc tõ m¹ng l­íi gi¸m s¸t bÖnh Cóm toµn cÇu cña WHO, hµng n¨m WHO ®­a ra khuyÕn c¸o thµnh phÇn kh¸ng nguyªn cña v¾c xin tËp trung vµo 3 chñng phæ biÕn nhÊt ®ang l­u hµnh. HiÖn t¹i c¸c virót Cóm ®ang l­u hµnh g©y bÖnh cho ng­êi ®­îc ph©n chia thµnh hai nhãm A vµ B. Cóm A cã 2 ph©n týp quan träng nhÊt ®èi víi ng­êi lµ A/H3N2 vµ A/H1N1, liªn quan ®Õn nh÷ng ®¹i dÞch cã sè ng­êi tö vong nhiÒu nhÊt. HiÖn nay, tÊt c¶ c¸c nhµ s¶n xuÊt v¾c xin Cóm trªn thÕ giíi ®· vµ ®ang sö dông c«ng nghÖ truyÒn thèng lµ s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i kh«ng mang c¸c t¸c nh©n g©y bÖnh ®Æc hiÖu. Tuy nhiªn, ®©y lµ mét hÖ thèng cång kÒnh víi nhiÒu ®iÓm bÊt lîi nh­: chi phÝ cao, cã thÓ lÉn c¸c t¹p chÊt g©y dÞ øng. Virót Cóm ng­êi sinh tr­ëng trªn trøng cã thÓ dÉn ®Õn sù chän läc nh÷ng biÕn ®æi trong c¸c kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu tõ chñng virót gèc (14) vµ nguån cung cÊp trøng kh«ng ®¶m b¶o ®­îc thêi gian, ¶nh h­ëng ®Õn tÝnh s½n sµng cho viÖc ®èi phã víi bÖnh dÞch (29). ViÖc nu«i cÊy virót Cóm trªn tÕ bµo lµ rÊt kh¶ thi trong viÖc s¶n xuÊt v¾c xin víi nh÷ng lîi thÕ so víi trªn trøng gµ cã ph«i nh­: cho n¨ng suÊt cao vµ s¹ch do kh«ng lÉn nh÷ng t¹p chÊt nh­ trªn trøng, virót nh©n lªn trªn tÕ bµo vÉn gi÷ ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn nh­ ë chñng virót gèc. XuÊt ph¸t tõ thùc tÕ ®ã, nh»m nghiªn cøu s¶n xuÊt v¾c xin Cóm mïa bÊt ho¹t cã hiÖu lùc cao víi gi¸ thµnh h¹, chóng t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi: "Nghiªn cøu thÝch øng chñng virót Cóm mïa trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau". §Ò tµi ®­îc thùc hiÖn nh»m 2 môc tiªu: §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng thÝch øng cña 3 chñng virót Cóm mïa H1N1, H3N2 vµ B trªn c¸c dßng tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t (PMKc), thËn khØ xanh ch©u Phi th­êng trùc (Vero) vµ thËn chã Madin-Darby th­êng trùc (MDCK). Nghiªn cøu cÊy truyÒn c¸c chñng virót Cóm mïa trªn dßng tÕ bµo thÝch hîp nh»m n©ng cao hiÖu gi¸. Ch­¬ng 1 TæNG QUAN Virót Cóm N¨m 1931, Shope vµ céng sù ®· lÇn ®Çu tiªn ph©n lËp ®­îc virót Cóm tõ lîn bÞ nhiÔm bÖnh.
H×nh 1. H×nh ¶nh virót Cóm A d­íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua. Nguån: Public Health Image Library (CDC), ID: #8160. §é phãng ®¹i 100.000 lÇn LÞch sö N¨m 1918, dÞch Cóm T©y Ban Nha ®· lµm tö vong 50 triÖu ng­êi, do virót ph©n nhãm H1N1 g©y ra, th­êng ®­îc coi lµ chñng g©y Cóm lîn nh­ng cã kh¶ n¨ng truyÒn nhiÔm. N¨m 1957 vµ 1958, H2N2 g©y nªn dÞch Cóm ch©u ¸ vµo ®· lµm chÕt kho¶ng 1 triÖu ng­êi trªn thÕ giíi. N¨m 1968, 1969 H3N2 ph¸t triÓn tõ chñng H2N2 do biÕn ®æi di truyÒn vµ g©y nªn dÞch Cóm Hång K«ng ®· g©y tö vong 750,000 ng­êi. §©y lµ ®¹i dÞch g©y tö vong lín nhÊt thÕ kû 20. N¨m 2002, víi sù bïng ph¸t ph©n nhãm H7N2 trong gia cÇm, 44 ng­êi ®· ®­îc ph¸t hiÖn lµ bÞ nhiÔm virót t¹i bang Virginia, Mü. Th¸ng 2 n¨m 2004, ë B¾c Mü, ng­êi ta ®· ph¸t hiÖn chñng virót Cóm gµ H7N3 t¹i mét sè trang tr¹i gia cÇm t¹i British Columbia. N¨m 2003 ë Hµ Lan, 89 ng­êi ®· ®­îc chÈn ®o¸n lµ nhiÔm virót Cóm H7N7 sau mét ®ît dÞch Cóm gia cÇm tõ mét sè trang tr¹i l©n cËn. Mét tr­êng hîp ®· tö vong. N¨m 2005, cã 3 tr­êng hîp ph¸t hiÖn nhiÔm H9N2 ë Trung Quèc vµ Hång K«ng cho thÊy bÞ nhiÔm virót vµ tÊt c¶ ®Òu ®· qua khái. Lo¹i virót nµy ®· ®­îc nghiªn cøu cho thÊy chØ lµ d¹ng "g©y nhiÔm thÊp". Tõ n¨m 1997, sù bïng ph¸t cña virót H5N1 ®· lµm nhiÔm bÖnh vµ chÕt hµng chôc triÖu gia cÇm. H5N1 ®­îc coi lµ t©m ®iÓm cña sù chó ý vµ c¶nh b¸o r»ng mét biÕn chñng tõ ph©n nhãm H5N1 cã thÓ tù biÕn ®æi (hoÆc t¸i tæ hîp) ®Ó t¹o thµnh mét chñng virót cã kh¶ n¨ng g©y ®¹i dÞch Cóm toµn cÇu. T×nh h×nh hiÖn nay Tõ th¸ng 2 ®Õn th¸ng 9 - 2008, ho¹t ®éng cña virót Cóm ®­îc b¸o c¸o ë ch©u Phi, ch©u Mü, ch©u ¸, ch©u ¢u vµ ch©u §¹i D­¬ng. Nh×n chung, virót Cóm ho¹t ®éng ë møc võa ph¶i (42). ë phÝa B¾c b¸n cÇu, virót Cóm tiÕp tôc l­u hµnh vµ g©y ra nh÷ng vô bïng ph¸t dÞch ë ch©u ¸, ch©u ¢u vµ B¾c Mü. Ho¹t ®éng cña virót Cóm gi¶m xuèng trong th¸ng 3 ë ch©u ¢u vµ th¸ng 4 ë ch©u ¸ vµ B¾c Mü. Virót Cóm A/H1N1 l­u hµnh réng r·i vµ chiÕm ­u thÕ ë nhiÒu quèc gia. Virót Cóm A/H3N2 chiÕm ­u thÕ ë Mü vµ l­u hµnh Ýt h¬n ë ch©u ¸ vµ §«ng ¢u. Virót Cóm B l­u hµnh ®ång thêi vµ cã nh÷ng vô bïng ph¸t ë mét vµi n­íc. ë phÝa Nam b¸n cÇu, ho¹t ®éng cña virót Cóm b¾t ®Çu vµo th¸ng 3 vµ t¨ng lªn trong th¸ng 4 ë B¾c Mü, trong khi ë ch©u Phi vµ ch©u §¹i D­¬ng, ho¹t ®éng b¾t ®Çu trong th¸ng 5 vµ t¨ng lªn ë th¸ng 6. Nh×n chung, ho¹t ®éng gi¶m xuèng trong th¸ng 8 ngo¹i trõ ë Australia, Braxin vµ New Zealand. ë ch©u Phi, virót Cóm A/H1N1 chiÕm ­u thÕ vµ g©y ra nh÷ng vô bïng ph¸t. ë Nam Mü, virót Cóm A/H1N1 vµ virót Cóm B cïng l­u hµnh vµ liªn quan ®Õn nh÷ng vô dÞch. ë ch©u §¹i D­¬ng, cã b¸o c¸o vÒ nh÷ng vô bïng ph¸t do virót Cóm A/H3N2 vµ Cóm B cïng l­u hµnh g©y ra. Sau 3 n¨m nghiªn cøu vÒ dÞch tÔ bÖnh Cóm t¹i Hµ Néi, tõ n¨m 2001 ®Õn 2003, c¸c nhµ khoa häc ®· thu thËp tæng céng 4078 mÉu dÞch tôy hÇu (nasopharyngeal swab) tõ bÖnh nh©n èm gièng Cóm (ILI) tr­íc khi dÞch Cóm gia cÇm A/H5N1 bïng ph¸t (10). B»ng c¸ch ph©n lËp virót Cóm, ®· ph¸t hiÖn 119 mÉu (2,5%) d­¬ng tÝnh. Virót Cóm ®­îc ph¸t hiÖn thÊy ë hÇu hÕt c¸c th¸ng trong n¨m víi ®Ønh lµ vµo th¸ng 6 ®Õn th¸ng 8 trong suèt mïa m­a, mét ®Ønh kh¸c r¬i vµo th¸ng 12 ®Õn th¸ng 1 trong suèt mïa ®«ng ë Hµ Néi. Virót Cóm B chiÕm ­u thÕ trong n¨m 2001, tiÕp theo lµ Cóm A/H3N2 trong n¨m 2002, vµ trong n¨m 2003, c¶ 3 ph©n nhãm Cóm A/H3N2, A/H1N1 vµ B cïng l­u hµnh. Kh«ng cã tr­êng hîp nµo nhiÔm virót Cóm A/H5N1 trong c¸c mÉu bÖnh phÈm nµy. Theo kÕt qu¶ cña sù gi¸m s¸t c¸c bÖnh truyÒn nhiÔm quèc gia thùc hiÖn bëi Bé Y tÕ ViÖt Nam, trong giai ®o¹n 2001-2003, trung b×nh sè tr­êng hîp m¾c bÖnh mçi n¨m trªn toµn quèc lµ 2054,2/100.000 d©n vµ lµ bÖnh ®­îc xÕp h¹ng cao nhÊt trong 24 bÖnh truyÒn nhiÔm. Mçi vïng cã tÝnh mïa vµ sè ca ILI kh¸c nhau. MiÒn B¾c cã 2725,8 ca/100.000 d©n mçi n¨m, vµ thÓ hiÖn tÝnh mïa víi ®Ønh cao tõ th¸ng 5 ®Õn th¸ng 9. Trung b×nh sè ca ILI cao nhÊt ë vïng nói T©y B¾c víi 3670,6 ca/100.000 d©n víi møc ®Ønh ë th¸ng 8 vµ th¸ng 9. MiÒn Trung vµ miÒn Nam kh«ng thÓ hiÖn tÝnh mïa râ rµng, vµ c¸c ca ILI còng thÊp h¬n c¸c vïng kh¸c. Còng nh­ nh÷ng b¸o c¸o tr­íc ®©y ë quèc gia nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi ë ch©u ¸ nh­ Th¸i Lan, Indonesia, Myanma, Singapo vµ mét phÇn miÒn nam cña Trung Quèc gåm c¶ §µi Loan (9, 19), nh÷ng kÕt qu¶ nµy chØ ra r»ng virót Cóm l­u hµnh trong c¶ n¨m ë Hµ Néi víi 2 ®Ønh cao, mét trong mïa m­a vµ mét trong mïa ®«ng l¹nh. Tuy nhiªn, th«ng tin tõ nh÷ng khu vùc nµy vÉn cßn h¹n chÕ, cã thÓ do thiÕu nh÷ng m¹ng l­íi gi¸m s¸t Cóm quèc gia, ph­¬ng tiÖn vµ nh©n viªn cã ®ñ kü n¨ng trong c¸c phßng thÝ nghiÖm vµ nguån tµi chÝnh cÇn thiÕt (31). Theo c¸c b¸o c¸o cña WHO vµ c¸c trung t©m hîp t¸c vÒ sù ho¹t ®éng cña virót Cóm, nh÷ng týp/ph©n týp chiÕm ­u thÕ ë §«ng Nam ¸ vµ ch©u §¹i D­¬ng lµ sù trén lÉn cña A/H1N1, H3N2 vµ B trong suèt n¨m 2001 vµ 2002, ®Õn n¨m 2003 th× Cóm A/H3N2 chiÕm ­u thÕ (38-40). Trong nghiªn cøu nµy, nh÷ng týp/ph©n týp virót Cóm l­u hµnh ë Hµ Néi qua thêi gian 3 n¨m cã sù kh¸c nhau Ýt h¬n so víi ë c¸c khu vùc xung quanh ë ch©u ¸, song nh÷ng ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn lµ t­¬ng tù (38-41). KÕt qu¶ thu thËp ®­îc cho phÐp nhãm t¸c gi¶ kÕt luËn r»ng nh÷ng chñng virót ë Hµ Néi kh¸ phï hîp víi nh÷ng chñng v¾c xin toµn cÇu. Ph©n lo¹i C¸c virót Cóm thuéc hä Orthomyxoviridae, lµ nh÷ng chñng virót cã hÖ gen d¹ng sîi ®¬n ARN (-) gåm 8 ph©n ®o¹n lÇn l­ît m· hãa cho 8 lo¹i protein kh¸c nhau cña virót (Cóm A, B). Hä Orthomyxoviridae gåm 4 gièng: Virót Cóm A, virót Cóm B, virót Cóm C vµ Thogovirót. Virót Cóm B vµ C th­êng chØ g©y nhiÔm cho ng­êi trong khi phÇn lín virót Cóm A g©y nhiÔm trªn gia cÇm vµ chØ cã mét vµi ph©n týp g©y nhiÔm cho ng­êi vµ c¸c ®éng vËt kh¸c nh­ lîn, ngùa. Virót Cóm A, B vµ C kh¸c nhau vÒ tÝnh kh¸ng nguyªn cña nucleocapsit vµ neuramidaza glycoprotein. Virót Cóm A ®­îc chia c¸c ph©n týp dùa trªn tÝnh kh¸ng nguyªn cña c¸c ph©n tö HA vµ NA cña chóng. HiÖn nay, c¸c nhµ khoa häc ®· t×m ra 16 lo¹i HA (H1-H16) vµ 9 lo¹i NA (N1-N9). Gia cÇm thñy sinh lµ æ chøa tù nhiªn cña tÊt c¶ c¸c lo¹i virót Cóm. Chñng virót Cóm ®­îc ®Æt tªn theo nguån gèc ph©n lËp, vïng ®Þa lý ph©n lËp, sè chñng, n¨m ph©n lËp. Tõ n¨m 1983 ®Õn nay, kh«ng cã thªm ph©n týp míi nµo ®­îc ph¸t hiÖn, ®iÒu nµy cho thÊy cã mét sè giíi h¹n vÒ sù biÕn chñng cña virót Cóm A. H×nh th¸i vµ cÊu tróc cña virót Cóm Virót Cóm A vµ B cã cÊu tróc gièng nhau trong khi virót Cóm C cã cÊu tróc kh¸c biÖt víi c¸c gai glycoprotein s¾p xÕp theo h×nh 6 c¹nh. Virót Cóm A vµ B nu«i cÊy trªn tÕ bµo hoÆc trøng cã h×nh d¹ng th«ng th­êng ®­êng kÝnh 80-120nm. Ng­îc l¹i, virót Cóm ph©n lËp tõ ng­êi vµ ®éng vËt sau ®ã ®­îc cÊy truyÒn mét lÇn trªn tÕ bµo th­êng cã h×nh th¸i kh¸c biÖt vµ ®a d¹ng. H×nh th¸i virót Cóm A lµ mét kiÓu gen riªng biÖt nh­ng phô thuéc rÊt nhiÒu vµo lo¹i tÕ bµo chñ khi virót nh©n lªn. §Æc ®iÓm h×nh th¸i næi bËt cña virót Cóm A lµ líp bao gåm 500 gai (10-14nm) xße ra phÝa ngoµi líp lipit. Cã 2 lo¹i gai kh¸c nhau: gai h×nh gËy lµ kh¸ng nguyªn HA vµ gai h×nh nÊm lµ kh¸ng nguyªn NA. Tû lÖ HA:NA th­êng dao ®éng nh­ng th«ng th­êng tõ 4:1 ®Õn 5:1. Protein matrix M1 ®­îc cho lµ n»m d­íi líp lipit kÐp vµ liªn kÕt víi Ribonucleoprotein (RNP) lâi cña virót. M1 lµ protein cã nhiÒu nhÊt trong virion.
H×nh 2. Virion cña virót Cóm A vµ c¸c protein. Nguån: www.influenzareport.com B»ng ph­¬ng ph¸p c¾t líp máng tiªu b¶n cã c¸c h¹t virót hoÆc ph¸ vì h¹t, cÊu tróc RNP cã thÓ ®­îc chia thµnh nhiÒu líp cã kÝch th­íc kh¸c nhau vµ chøa 8 ®o¹n gen cña ARN ®¬n. C¸c RNP cã chøa 4 lo¹i protein vµ ARN. NP lµ protein tiÓu ®¬n vÞ næi tréi cña nucleocapsit vµ bao quanh ARN, cã kho¶ng 20 nucleotit trong 1 tiÓu ®¬n vÞ NP. Liªn kÕt víi RNP lµ phøc hîp ARN polymeraza phô thuéc - ARN bao gåm 3 polymeraza protein PB1, PB2, PA vµ chØ cã mÆt tõ 20-30 b¶n sao trong mét virion. Thµnh phÇn cña c¸c virót trong hä Orthomyxoviridae bao gåm 1% ARN, 70% protein, 20% lipit vµ 5 ®Õn 8% carbonhydrat. Axit nucleic vµ protein Virót Cóm chøa 7 ®Õn 8 ®o¹n ARN sîi ®¬n, ©m. Tæng chiÒu dµi genom lµ 12000-15000 nucleotit, ®o¹n lín nhÊt dµi 2300-2500 nucleotit, nhá nhÊt lµ 800-900 nucleotit. Tr×nh tù genome cã c¸c tr×nh tù lÆp tËn cïng, ë c¶ hai ®Çu. C¸c tr×nh tù lÆp ë ®Çu 5’ dµi 12-13 nucleotit. Tr×nh tù nucleotit cña ®Çu 3’ gièng hÖt ®Çu 5’ ë hÇu hÕt c¸c ®o¹n ARN vµ nh­ nhau trong cïng mét gièng cña cïng mét hä. Nh÷ng tr×nh tù lÆp l¹i dµi 9-11 nucleotit. Lipit Líp mµng lipit cña virót Cóm ®­îc t¹o thµnh tõ mµng bµo t­¬ng cña tÕ bµo chñ n¬i virót nh©n lªn. ¶nh h­ëng cña c¸c t¸c nh©n vËt lý vµ hãa häc Virót Cóm gia cÇm vÉn cã thÓ tån t¹i trong n­íc cÊt h¬n 102 ngµy ë 28OC vµ 207 ngµy ë 17OC vµ thêi gian tån t¹i cña virót ë 4OC ®­îc ­íc l­îng lµ h¬n 1300 ngµy (32). Nghiªn cøu kh¸c ®· chøng minh r»ng ph©n týp cña virót Cóm gia cÇm H7N3 trong n­íc peptone (pH 7.0) vÉn gi÷ ®­îc kh¶ n¨ng l©y nhiÔm cña nã khi ñ ë 4, 30 vµ 37OC trong 35 ngµy. Kh¶ n¨ng l©y nhiÔm cña virót vÉn tån t¹i sau khi chÞu t¸c ®éng cña nhiÖt ®é 56OC trong 30 phót nh­ng sÏ mÊt kh¶ n¨ng nµy sau khi chÞu t¸c ®éng ë 56OC trong vßng 60 phót. Virót cã thÓ gi÷ ë nhiÖt ®é d­íi -50OC trong vßng nhiÒu n¨m. Othomyxoviridae ®­îc xem lµ rÊt dÔ bÞ ¶nh h­ëng bëi ®é pH trong acid. §é pH thÊp t¹o ra sù thÝch nghi vµ sù thay ®æi kh¸ng nguyªn trong protein HA, cho phÐp liªn kÕt víi mµng cña c¸c tÕ bµo ký sinh. ë pH 2, nhiÖt ®é 56OC vµ trong dung dÞch 70% etanol hoÆc mét chÊt tÈy ®Æc hiÖu, ho¹t tÝnh cña virót Cóm bÞ bÊt ho¹t trong thêi gian d­íi 30 phót (20). C¸c lo¹i kh¸ng nguyªn HA Tªn gäi cña protein HA (hemagglutinin) xuÊt ph¸t tõ kh¶ n¨ng ng­ng kÕt hång cÇu cña virót b»ng c¸ch g¾n víi c¸c thô thÓ ®Æc biÖt cã chøa axit sialic. HA cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh sao chÐp virót. §Çu tiªn HA g¾n víi thô thÓ cã chøa axit sialic trªn bÒ mÆt tÕ bµo vµ t¹o thµnh sù g¾n kÕt gi÷a virót vµ tÕ bµo. TiÕp ®ã HA chÞu tr¸ch nhiÖm cho sù x©m nhËp cña virót vµo tÕ bµo b»ng c¸ch gi¸n tiÕp t¹o nªn sù hßa mµng endocytosed cña virót vµ mµng néi bµo lµm cho nucleocapsit virót gi¶i phãng vµo trong bµo t­¬ng. HA lµ kh¸ng nguyªn chÝnh cña virót Cóm, bao gåm c¸c vÞ trÝ kh¸ng nguyªn lµ A, B (mang vÞ trÝ g¾n thô thÓ), C, D vµ E. C¸c vÞ trÝ nµy n»m ë phÇn ®Çu ph©n tö HA, trong khi phÇn cuèi ®­îc g¾n vµo trong líp lipid. Khi bÞ nhiÔm virót Cóm, c¬ thÓ ®¸p øng miÔn dÞch víi kh¸ng nguyªn HA b»ng c¸ch sinh ra c¸c kh¸ng thÓ trung hßa. Nh÷ng thay ®æi ë c¸c vÞ trÝ kh¸ng nguyªn lµm gi¶m hay øc chÕ sù g¾n kÕt cña c¸c kh¸ng thÓ trung hßa, do ®ã cho phÐp mét ph©n týp míi lan réng trong quÇn thÓ kh«ng cã kh¶ n¨ng miÔn dÞch. HiÖn t­îng nµy gäi lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn chËm (antigenic drift). §ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh (antigenic shift) xuÊt hiÖn khi HA bÞ thay ®æi trong mét virót, ch¼ng h¹n H1 thay thÕ bëi H5 dÉn tíi sù h×nh thµnh mét chñng virót Cóm míi. §iÒu nµy cã thÓ x¶y ra khi mét tÕ bµo nhiÔm bëi 2 chñng virót Cóm kh¸c nhau vµ trao ®æi c¸c ®o¹n genome cña chóng trong qu¸ tr×nh nh©n lªn. Nh­ vËy HA lµ kh¸ng nguyªn chÝnh t¹o nªn kh¸ng thÓ trung hßa vµ c¸c vô dÞch Cóm ®Òu liªn quan ®Õn thay ®æi cÊu tróc kh¸ng nguyªn. NP NP lµ protein cÊu tróc chÝnh phèi hîp víi c¸c ®o¹n ARN t¹o thµnh RNP. NP cßn lµ kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu týp, kh¸c nhau gi÷a virót Cóm A, B vµ C. MÆc dï lµ mét protein ®Æc hiÖu týp nh­ng NP cña virót Cóm A vÉn biÓu hiÖn sù biÕn ®æi kh¸ng nguyªn. NP cã Ýt nhÊt 3 vïng liªn kÕt kh¸ng thÓ kh«ng chång lªn nhau, mét trong sè nµy cã tÝnh b¶o thñ cao. Kh¸ng thÓ ®¬n dßng g¾n vµo vÞ trÝ nµy g©y øc chÕ phiªn m· ARN virót trong phßng thÝ nghiÖm. NP cã mét vµi quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu tÕ bµo T ®­îc b¶o tån trong sè c¸c virót Cóm A ë ng­êi. NA NA lµ glycoprotein thø hai ®Æc hiÖu cho ph©n týp cña virót Cóm A, B. NA do ®o¹n gen ARN thø 6 m· hãa vµ lµ mét homotetramer. NA quan träng do ho¹t tÝnh sinh häc lo¹i bá axit sialic tõ glycoprotein. NA cã thÓ cho phÐp vËn chuyÓn virót qua mµng mucin ë trªn ®­êng h« hÊp, gióp hç trî virót tÊn c«ng tÕ bµo biÓu m« ®Ých. NA cña virót Cóm A cã 4 vÞ trÝ kh¸ng nguyªn, mçi vÞ trÝ bao gåm nhiÒu quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn (epitop). Nh÷ng cÊu tróc kh¸ng nguyªn cña N9 NA ®­îc nghiªn cøu nhiÒu nhÊt. Ph©n tÝch cÊu tróc cña phøc hîp N9 NA tõ chñng A/tern/Australia/G75 víi m¶nh Fab cña kh¸ng thÓ ®¬n dßng NC41 (34) cho thÊy r»ng kh¸ng thÓ tiÕp xóc NA qua mét bÒ mÆt cã diÖn tÝch 900Ǻ2, bao gåm 19 axit amin n»m trªn 5 vßng polypeptit bao quanh vÞ trÝ ho¹t ®éng cña enzym. Trong sè nµy, chØ cã mét vµi axit amin cung cÊp nh÷ng ®iÓm tiÕp xóc quyÕt ®Þnh cÇn cho sù nhËn diÖn cña kh¸ng thÓ (24). Trong sù l©y nhiÔm tù nhiªn, miÔn dÞch ®èi víi NA chØ cã vai trß kh«ng ®¸ng kÓ b¶o vÖ con ng­êi khái nhiÔm Cóm. Cã thÓ lÊy vÝ dô minh häa tõ ®¹i dÞch 1968, khi ®ã t¸c nh©n g©y bÖnh cã NA tõ mét virót Cóm ng­êi l­u hµnh tr­íc ®ã, sù miÔn dÞch ®èi víi NA ®· kh«ng thÓ ng¨n con ng­êi khái ®¹i dÞch Cóm. Ngoµi c¸c kh¸ng nguyªn chñ yÕu trªn, virót Cóm cßn cã c¸c kh¸ng nguyªn protein polymeraza (PB1, PB2, PA), M1, M2, NS1 vµ NS2 ®­îc nhËn diÖn bëi c¸c tÕ bµo T trong c¬ thÓ ng­êi nhiÔm virót Cóm. Sù t¸i tæ hîp cña virót Cóm Virót Cóm A, B, C cã thÓ t¸i tæ hîp trong tù nhiªn gi÷a c¸c thµnh viªn cïng týp nh­ng kh«ng x¶y ra gi÷a c¸c týp kh¸c nhau. Sù xuÊt hiÖn cña chñng ®¹i dÞch lµ hËu qu¶ cña viÖc t¸i tæ hîp t¹o ra chñng ph©n týp míi cã NA hoÆc HA kh¸c h¼n víi chñng l­u hµnh tr­íc ®ã. Virót Cóm B kh¸c víi virót Cóm A lµ kh«ng cã æ chøa ®éng vËt. MÆc dï virót Cóm B nguyªn thñy thÝch øng trªn ng­êi dÔ dµng h¬n virót Cóm A nh­ng tû lÖ ®ét biÕn vµ thay ®æi chØ b»ng mét nöa virót Cóm A (43). Cã nhiÒu b»ng chóng cho r»ng virót Cóm trong loµi thñy cÇm l©y truyÒn cho lîn, ngùa, gia cÇm vµ ®éng vËt cã vó ë biÓn; g©y nªn nh÷ng vô dÞch nghiªm träng (36). Virót Cóm gia cÇm kh«ng lan truyÒn trªn quÇn thÓ ng­êi vµ ng­îc l¹i, virót cña ng­êi kh«ng l©y truyÒn sang quÇn thÓ chim, ®iÒu nµy cho thÊy hµng rµo gi÷a chim vµ ng­êi rÊt chÆt chÏ. Tuy nhiªn, nhiÒu b»ng chøng cho thÊy loµi lîn cã thÓ c¶m nhiÔm dÔ dµng víi c¶ hai lo¹i virót Cóm ng­êi hoÆc gia cÇm (12) vµ hµng rµo loµi gi÷a lîn vµ gia cÇm hoÆc gi÷a lîn vµ ng­êi láng lÎo h¬n nhiÒu, v× vËy lîn cã thÓ ®ãng vai trß nh­ lµ vËt chñ trung gian ®Ó t¹o ra gièng virót Cóm míi trªn ng­êi (6). Virót Cóm H3N2 ®· ®­îc ph©n lËp trªn lîn ë kh¾p thÕ giíi. Nh÷ng virót nµy cã ®Æc tÝnh kh¸ng nguyªn vµ gen gièng nh­ nh÷ng chñng ®· l­u hµnh trªn ng­êi tr­íc khi ph©n lËp ë lîn (23). Sù t¸i tæ hîp cña ®o¹n ARN virót trong khi nhiÔm trïng kÐp víi hai chñng Cóm ng­êi vµ gia cÇm lµ c¬ chÕ ®Ó t¹o ra chñng míi. QuÇn thÓ ng­êi kh«ng cã kh¸ng thÓ trung hßa víi kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót míi t¹o ra do ®ã kh«ng ®­îc b¶o vÖ. Virót míi cã thÓ lan truyÒn dÔ dµng g©y ra ®¹i dÞch. §¸p øng miÔn dÞch víi virót Cóm
H×nh 3. §¸p øng miÔn dÞch thÓ dÞch vµ qua trung gian tÕ bµo khi nhiÔm virót Cóm. Nguån: www.influenzareport.com Nh¸nh thÓ dÞch cña hÖ thèng miÔn dÞch bao gåm c¸c tÕ bµo lympho B (tr¸i), sau khi t­¬ng t¸c víi virót Cóm sÏ biÖt ho¸ thµnh c¸c tÕ bµo plasma s¶n xuÊt kh¸ng thÓ. §¸p øng qua trung gian tÕ bµo (ph¶i) b¾t ®Çu víi tr×nh diÖn KN th«ng qua c¸c ph©n tö MHC I (mµu ®en) vµ II (mµu xanh) bëi c¸c tÕ bµo tua, lµ tÕ bµo sau ®ã sÏ dÉn tíi sù ho¹t ho¸, t¨ng sinh vµ biÖt ho¸ c¸c tÕ bµo T ®Æc hiÖu kh¸ng nguyªn (CD4 hoÆc CD8). Nh÷ng tÕ bµo nµy cã chøc n¨ng gióp tÕ bµo xö lý (effector cell) qua phãng thÝch trùc tiÕp c¸c cytokin hoÆc trung gian tÝnh ®éc tÕ bµo sau khi ®· nhËn diÖn kh¸ng nguyªn. §¸p øng miÔn dÞch dÞch thÓ C¸c kh¸ng thÓ ®­îc c¸c tÕ bµo plasma s¶n xuÊt, n»m trong giai ®o¹n cuèi cïng cña sù ph¸t sinh tÕ bµo B, ®ßi hái tÕ bµo B ph¶i nhËn diÖn ®­îc kh¸ng nguyªn vµ ®­îc tÕ bµo T CD4 vµ c¸c cytokin ph¸t sinh tõ tÕ bµo T. Kh«ng gièng nh­ tÕ bµo T, tÕ bµo B cã thÓ nhËn ra kh¸ng nguyªn d­íi d¹ng tù nhiªn cña chóng. TÝnh ®Æc hiÖu cña kh¸ng nguyªn lµ do sù t¸i s¾p xÕp ngÉu nhiªn c¸c gen m· ho¸ cho vïng siªu biÕn cña c¸c Ig trong tÕ bµo khi tÕ bµo cßn n»m trong tuû x­¬ng. C¸c tÕ bµo B non (naive B cell) sau ®ã ®i vµo hÖ tuÇn hoµn råi theo m¸u vµ h¹ch b¹ch huyÕt ®Õn c¸c m« vµ c¬ quan lymph«. T¹i c¸c h¹ch lymph«, tÕ bµo B non sÏ nhËn diÖn kh¸ng nguyªn, sau ®ã tÕ bµo B ®­îc ho¹t ho¸, chuyÓn s¶n xuÊt tõ Ig M sang IgG, lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu vµ ¸i lùc cña globuline miÔn dÞch vµ biÖt ho¸ thµnh c¸c tÕ bµo plasma hoÆc tÕ bµo B nhí khi tÕ bµo tiÕp tôc ph©n chia d­íi sù hiÖn diÖn cña c¸c cytokin. Trong lóc Ig A ®­îc vËn chuyÓn xuyªn qua líp biÓu m« cña ®­êng h« hÊp trªn, lµ n¬i IgA sÏ trung hoµ vµ lo¹i trõ virót g©y nhiÔm, th× IgG chñ yÕu chØ cã vai trß b¶o vÖ ®­êng h« hÊp d­íi. Khi nhiÔm virót Cóm, c¬ thÓ sÏ t¹o ra c¸c kh¸ng thÓ ®èi víi c¶ 2 glycoprotein HA vµ NA, còng nh­ protein M vµ NP. HiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao nhÊt vµo gi÷a tuÇn thø 4-7 sau khi nhiÔm, vµ sau ®ã gi¶m dÇn. Kh¸ng thÓ vÉn cßn cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc nhiÒu n¨m sau ®ã dï kh«ng bÞ t¸i ph¬i nhiÔm. C¸c hiÖu gi¸ øc chÕ HA huyÕt thanh tõ 1/40 trë lªn, hoÆc hiÖu gi¸ trung hoµ huyÕt thanh tõ 1/8 trë lªn ®­îc coi nh­ cã kh¶ n¨ng b¶o vÖ. ë ng­êi giµ, ®Ó ®­îc b¶o vÖ hoµn toµn, cÇn ph¶i cã møc kh¸ng thÓ cao h¬n. Ng­îc l¹i víi kh¸ng thÓ kh¸ng HA, kh¸ng thÓ kh¸ng NA kh«ng trung hoµ ®­îc tÝnh g©y nhiÔm cña virót, nh­ng thay vµo ®ã kh¸ng thÓ nµy sÏ ng¨n kh«ng cho c¸c tÕ bµo bÞ nhiÔm phãng thÝch virót ra ngoµi. §ã lµ do t¸c dông ph©n c¾t acid sialic cña NA n»m trªn thô thÓ tÕ bµo. Kh¸ng thÓ kh¸ng NA cã thÓ b¶o vÖ c¬ thÓ khái tr¸nh nhiÔm bÖnh vµ lµm gi¶m sù th¶i tiÕt virót còng nh­ møc ®é trÇm träng cña c¸c triÖu chøng. §¸p øng miÔn dÞch mµng niªm chèng l¹i virót Cóm, c¨n cø theo l­îng dÞch tiÕt ë mòi, cã sù hiÖn diÖn cña IgA vµ IgG1 chèng l¹i HA. C¸c nghiªn cøu cho thÊy r»ng sù ®Ò kh¸ng t¸i nhiÔm chñ yÕu ®­îc trung gian qua IgA, mÆc dï IgG còng cã phÇn liªn quan. Trong miÔn dÞch, kh¸ng thÓ t¸c ®éng chèng l¹i virót Cóm b»ng c¸ch trung hoµ virót hoÆc ly gi¶i tÕ bµo bÞ nhiÔm th«ng qua bæ thÓ hoÆc tÝnh ®éc tÕ bµo phô thuéc vµo kh¸ng thÓ. §¸p øng miÔn dÞch qua trung gian tÕ bµo Ng­êi ta ®· chøng minh c¸c tÕ bµo tua ®ãng vai trß trung t©m trong viÖc khëi ®Çu vµ thóc ®Èy c¸c ®¸p øng tÕ bµo T. §©y lµ nhãm b¹ch cÇu ph¸t sinh tõ tuû x­¬ng, di ®éng, ph©n bè th­a thít, chuyªn tr¸ch viÖc thu nhËn, vËn chuyÓn, xö lý vµ tr×nh diÖn kh¸ng nguyªn cho tÕ bµo T. Khu«n mÉu c¬ b¶n cho lo¹i tÕ bµo nµy lµ c¸c tÕ bµo tua n»m ë phæi b¾t gi÷ kh¸ng nguyªn tõ t¸c nh©n g©y bÖnh bªn ngoµi x©m nhËp vµo, ho¹t ho¸ vµ sau ®ã tËp trung vÒ c¸c h¹ch lymph«. Kh¸ng nguyªn sau ®ã ®uîc xö lý vµ g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo tua d­íi d¹ng c¸c peptit, c¸c peptit nµy ®­îc c¸c ph©n tö MHC. T¹i c¸c h¹ch lymph«, c¸c tÕ bµo tua lóc nµy sÏ khëi ®éng mét ®¸p øng miÔn dÞch bëi bÊt cø tÕ bµo T nµo cã thô thÓ ®Æc hiÖu cho phøc hîp MHC n»m trªn bÒ mÆt tÕ bµo tua. C¸c tÕ bµo T võa míi ®­îc kÝch ho¹t sÏ di chuyÓn tíi vÞ trÝ bÞ nhiÔm virót n»m ë phæi, n¬i mµ c¸c tÕ bµo nµy sÏ lµm trung gian cho c¸c ho¹t ®éng chèng virót. §¸p øng tÕ bµo T ë ng­êi ®¹t ®Õn ®Ønh vµo kho¶ng ngµy 14 sau khi nhiÔm vµ ë ng­êi lín, l­îng tÕ bµo T ®éc ®Æc tr­ng cho virót Cóm t­¬ng øng víi møc ®é sao chÐp cña virót gi¶m dÇn qua thêi gian. C¸c tÕ bµo T nhí CD8 nhí cã thÓ ®ãng vai trß lµm gi¶m nhÑ møc ®é trÇm träng cña bÖnh vµ lµm cho sù håi phôc nhanh h¬n khi bÞ nhiÔm l¹i. §iÒu quan träng lµ, nh÷ng tÕ bµo nµy cã kh¶ n¨ng ®¸p øng l¹i c¸c tÝn hiÖu ®Çu tiªn khi bÞ nhiÔm víi l­îng virót x©m nhËp ë møc rÊt thÊp. Trong khi kh«ng thÓ t¨ng sinh ®Ó ®¸p øng víi t×nh tr¹ng nhiÔm trïng, c¸c tÕ bµo nµy cã thÓ s¶n xuÊt ra c¸c cytokin ®Ó lµm k×m h·m kh«ng cho virót sao chÐp vµ lan réng trªn biÓu m«. Giai ®o¹n 2 cña ®¸p øng qua trung gian tÕ bµo T nhí lµ c¸c tÕ bµo nµy tËp trung nhanh chãng ë ®­êng h« hÊp trong mét vµi ngµy ®Çu tiªn cña ®¸p øng. Giai ®o¹n 3 lµ sù më réng c¸c tÕ bµo T nhí d­íi t¸c ®éng cña kh¸ng nguyªn x¶y ra ë c¸c c¬ quan lymph« thø cÊp. Sù nh©n lªn cña virót Cóm Virót Cóm còng gièng nh­ c¸c virót kh¸c, nã b¾t buéc ph¶i nh©n lªn trong tÕ bµo c¶m thô. Trong c¬ thÓ sèng, virót Cóm g¾n vµo bÒ mÆt tÕ bµo biÓu m« trong phæi vµ cæ häng, tuy nhiªn trong nu«i cÊy tÕ bµo virót Cóm g©y nhiÔm vµ nh©n lªn kh«ng ph¶i lµ tÕ bµo biÓu m«. Sù l©y nhiÔm virót Cóm b¾t ®Çu khi HA virót g¾n víi c¸c thô thÓ ®Æc biÖt cã chøa axit sialic trªn tÕ bµo chñ (b­íc 1). Ng­êi ta thÊy r»ng nh÷ng virót Cóm ph©n lËp tõ ng­êi vµ lîn ­u tiªn g¾n víi vÞ trÝ SA-α2,6-Gal, trong khi ®ã nh÷ng virót ph©n lËp tõ chim vµ ngùa l¹i g¾n tèt h¬n vµo vÞ trÝ SA-α2,3-Gal (2, 5). Sù g¾n ®Æc hiÖu cña HA lµ mét trong nh÷ng yÕu tè quyÕt ®Þnh ®Õn qu¸ tr×nh x©m nhËp vµo vËt chñ cña virót (16, 18). §Ó virót cã thÓ x©m nhËp ®­îc vµo tÕ bµo, HAO ph¶i ®­îc ph©n c¾t bëi mét serine proteinaza nh­ trypsin ë mét vÞ trÞ ®Æc hiÖu, ®­îc m· hãa bëi mét axit amin ®¬n c¬ b¶n (th­êng lµ arginin), t¹o thµnh hai tiÓu ®¬n vÞ HA1 (khèi l­îng ph©n tö 36 kDa) vµ HA2 (khèi l­îng ph©n tö 27 kDa) g¾n víi nhau b»ng liªn kÕt céng hãa trÞ bëi cÇu disulfide. Sù ph©n c¾t HA lµ ®iÒu kiÖn cÇn thiÕt cho sù l©y nhiÔm cña virót nh»m ®Ó lé ra ®Çu amin kþ n­íc cña HA2 lµm trung gian cho sù hßa mµng cña vá ngoµi virót vµ mµng néi bµo (37). Virót ®i vµo tÕ bµo b»ng c¬ chÕ nhËp bµo. Trong thÓ néi bµo cã tÝnh axit, mét phÇn protein HA hßa tan mµng virót víi mµng kh«ng bµo, gi¶i phãng c¸c ph©n tö vARN, c¸c protein phô vµ enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN vµo tÕ bµo chÊt (b­íc 2). Nh÷ng protein nµy vµ vARN t¹o thµnh mét phøc hîp ®­îc vËn chuyÓn vµo nh©n tÕ bµo, n¬i enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN b¾t ®Çu phiªn m· sîi vARN d­¬ng bæ sung (b­íc 3a vµ 3b). vARN hoÆc ®­îc vËn chuyÓn vµo trong tÕ bµo chÊt vµ dÞch m· (b­íc 4), hoÆc vÉn ë l¹i trong nh©n. C¸c protein virót míi ®­îc tæng hîp hoÆc ®­îc ®­a ra bÒ mÆt tÕ bµo th«ng qua bé m¸y Golgi (trong tr­êng hîp cña HA vµ NA, b­íc 5b) hoÆc vËn chuyÓn trë l¹i vµo trong nh©n ®Ó g¾n víi vARN vµ t¹o thµnh nh÷ng h¹t genome cña virót míi. C¸c protein kh¸c cña virót thùc hiÖn nhiÒu c«ng viÖc trong tÕ bµo chñ, bao gåm ph©n hñy mARN cña tÕ bµo vµ sö dông c¸c nucleotit ®­îc gi¶i phãng ®Ó tæng hîp vARN vµ øc chÕ dÞch m· mARN cña tÕ bµo chñ. vARN ©m t¹o nªn genome cña virót t­¬ng lai, cïng víi enzym phiªn m· ARN phô thuéc ARN vµ c¸c protein kh¸c cña virót ®­îc l¾p r¸p vµo trong mét virion. C¸c ph©n tö HA vµ NA tËp hîp l¹i thµnh mét chç låi ra trong mµng tÕ bµo. vARN vµ c¸c protein virót chñ yÕu rêi nh©n vµ ®i vµo trong phÇn nh« lªn nµy cña mµng (b­íc 6). Virót tr­ëng thµnh n¶y chåi ra khái tÕ bµo trong mét khèi cÇu cña mµng photpholipit, cã c¸c ph©n tö HA vµ NA trªn líp ¸o mµng nµy (b­íc 7). Sau khi gi¶i phãng virót Cóm míi, tÕ bµo chñ sÏ chÕt ®i.
H×nh 4. Chu tr×nh nh©n lªn cña virót Cóm. Nguån: en.wikipedia.org Sù ph¸t triÓn cña virót trªn tÕ bµo Virót cóm ®Çu tiªn ®­îc nu«i trªn trøng gµ cã ph«i. Sau nµy, c¸c virót cóm cã thÓ ®­îc nu«i cÊy trªn trøng gµ cã ph«i hoÆc trong mét sè hÖ nu«i cÊy tÕ bµo tiªn ph¸t. ViÖc nu«i cÊy virót trªn trøng gµ cã ph«i vÉn ®­îc lùa chän lµm quy tr×nh s¶n xuÊt v¾c xin cóm trªn thÕ giíi. HiÖn nay, c¸c hÖ nu«i cÊy tÕ bµo nh­ thËn khØ tiªn ph¸t hay thËn chã th­êng dïng ®Ó ph©n lËp virót cóm tõ mÉu bÖnh phÈm cña ng­êi. Sù ph¸t triÓn cña virót trªn nu«i cÊy tÕ bµo g©y ra sù hñy ho¹i tÕ bµo vµ t¹o ra c¸c ®¸m ho¹i tö trong mét sè dßng tÕ bµo nh­ tÕ bµo thËn khØ, thËn bª, thËn chuét ®ång, thËn gµ. Ngoµi ra nÕu sö dông c¸c dßng tÕ bµo th­êng trùc th× trypsin ph¶i ®­îc bæ sung ®Ó ho¹t hãa c¸c ph©n tö protein HA trong qu¸ tr×nh x©m nhËp vµo tÕ bµo chñ cña virót. Sinh bÖnh häc C¸c nghiªn cøu ®· ®­a ra nh÷ng b»ng chøng chøng minh r»ng sinh bÖnh häc cña virót Cóm lµ tÝnh tr¹ng ®a gen. §iÒu nµy cã nghÜa lµ s¶n phÈm cña tÊt c¶ c¸c gen cña virót ®Òu tham gia vµo qu¸ tr×nh nhËn d¹ng tÕ bµo vËt chñ vµ g©y ®éc tÝnh trong qu¸ tr×nh x©m nhËp ph¸ vì tÕ bµo. Trong ®ã gen HA ®ãng vai trß trung t©m vÒ tÝnh ®éc cña virót gåm 2 ph©n týp H5, H7, cã ®éc tÝnh m¹nh nªn g©y tû lÖ chÕt cao. Protein HA cña c¸c virót nµy kh¸c c¸c HA cña c¸c ph©n nhãm kh¸c lµ cã mét tr×nh tù nhiÒu axit amin ë ®Çu carboxyl cña HA1. §iÒu nµy cho phÐp c¸c enzyme proteaza cña tÕ bµo nhËn biÕt tr×nh tù ®ã ®Ó c¾t HA thµnh HA1 vµ HA2, lµ giai ®o¹n cÇn thiÕt cho virót x©m nhËp tÕ bµo vµ ph¸t triÓn lan ra. §©y còng lµ c¬ së gi¶i thÝch tÝnh g©y ®éc cña virót Cóm ë ng­êi. DÞch tÔ häc Sù l©y truyÒn vµ sù thay ®æi theo mïa BÖnh Cóm chñ yÕu ®­îc l©y truyÒn tõ ng­êi sang ng­êi qua nh÷ng h¹t nhá (®­êng kÝnh > 5 µm) tõ mòi vµ häng khi ng­êi bÞ nhiÔm khi ho vµ h¾t h¬i. C¸c sol khÝ nµy kh«ng l¬ löng trong kh«ng khÝ vµ cÇn ph¶i cã tiÕp xóc gÇn ®Ó cã thÓ lan truyÒn ®­îc (tõ 1-2 mÐt). Sù l©y truyÒn còng cã thÓ x¶y ra qua tiÕp xóc ngoµi da trùc tiÕp hoÆc tiÕp xóc gi¸n tiÕp víi dÞch tiÕt h« hÊp (tay ch¹m vµo c¸c bÒ mÆt bÞ nhiÔm sau ®ã sê lªn m¾t, mòi hoÆc miÖng). Ng­êi nhiÔm Cóm cã thÓ ph¸t t¸n virót tõ 2 ngµy tr­íc ®Õn 5 ngµy sau khi cã triÖu chøng. TrÎ em cã thÓ l©y lan virót ®Õn 10 ngµy hoÆc l©u h¬n. BÖnh Cóm l©y lan m¹nh nhÊt vµo mïa ®«ng vµ bëi phÝa B¾c vµ Nam b¸n cÇu cã mïa ®«ng ë nh÷ng thêi ®iÓm kh¸c nhau trong n¨m nªn trong thùc tÕ cã hai mïa Cóm kh¸c nhau mçi n¨m. §iÒu nµy gi¶i thÝch t¹i sao WHO ®­a ra nh÷ng khuyÕn c¸o ®èi víi s¶n xuÊt hai lo¹i v¾c xin kh¸c nhau mçi n¨m, mét cho phÝa B¾c, vµ mét cho phÝa Nam b¸n cÇu. Cã nhiÒu lý do ®Ó gi¶i thÝch t¹i sao bÖnh Cóm th­êng bïng ph¸t vµo mïa ®«ng nh­ ®é Èm vµ nhiÖt ®é t­¬ng ®èi thÊp gióp virót Cóm cã thÓ sèng l©u h¬n, mäi ng­êi th­êng xuyªn ë trong nhµ dÉn ®Õn sù tiÕp xóc gÇn gòi h¬n t¹o ®iÒu kiÖn virót l©y lan. Mét gi¶ thiÕt kh¸c lµ do l­îng vitamin D trong c¬ thÓ xuèng thÊp trong mïa l¹nh còng lµm cho con ng­êi dÔ m¾c Cóm h¬n. Tuy nhiªn, nh÷ng thay ®æi theo mïa trong c­êng ®é l©y nhiÔm virót Cóm còng x¶y ra ë nh÷ng vïng nhiÖt ®íi, sù l©y lan cao nhÊt chñ yÕu diÔn ra trong suèt mïa m­a. DÞch vµ ®¹i dÞch Mçi n¨m, c¸c vô dÞch Cóm g©y ra 3-5 triÖu ca bÖnh vµ tõ 300.000-500.000 tö vong trªn toµn cÇu. Nguy c¬ m¾c bÖnh nÆng vµ tö vong cao nhÊt trong sè c¸c bÖnh nh©n lín h¬n 65 tuæi, trÎ nhá d­íi 2 tuæi, vµ nh÷ng ng­êi cã nguy c¬ m¾c thªm c¸c biÕn chøng tõ Cóm. Nh÷ng virót Cóm míi lu«n lu«n ®­îc sinh ra do ®ét biÕn hay t¸i s¾p xÕp vËt liÖu di truyÒn. Nh÷ng ®ét biÕn cã thÓ g©y ra nh÷ng thay ®æi nhá trong c¸c kh¸ng nguyªn HA vµ NA trªn bÒ mÆt virót. §ã lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn chËm, t¹o ra nhiÒu chñng Cóm qua thêi gian cho tíi khi mét trong nh÷ng biÕn thÓ ®¹t tíi sù thÝch øng cao h¬n vµ l©y lan nhanh chãng trong céng ®ång, g©y ra bÖnh dÞch. Ng­îc l¹i, khi c¸c virót Cóm ®­îc sinh ra cã nh÷ng kh¸ng nguyªn míi hoµn toµn, ch¼ng h¹n sù t¸i s¾p xÕp vËt liÖu di truyÒn gi÷a c¸c chñng Cóm gia cÇm vµ c¸c chñng Cóm ng­êi; ®ã lµ ®ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh. NÕu mét chñng virót Cóm ng­êi cã c¸c kh¸ng nguyªn míi hoµn toµn xuÊt hiÖn, tÊt c¶ mäi ng­êi sÏ bÞ c¶m nhiÔm vµ virót Cóm míi sÏ lan trµn kh«ng thÓ kiÓm so¸t, g©y ra ®¹i dÞch. Ng­îc l¹i víi vô dÞch, ®¹i dÞch lµ nh÷ng biÕn cè Ýt gÆp, x¶y ra cø mçi 10 hoÆc 50 n¨m. Nh÷ng ®¹i dÞch ®· ®­îc ghi nhËn tõ thÕ kû thø 16, vµ trong vßng 400 n¨m trë l¹i ®©y, ®· cã 3 ®¹i dÞch Cóm x¶y ra (b¶ng1). ThiÖt h¹i vÒ ng­êi cña c¸c ®¹i dÞch nµy thay ®æi tõ møc tµn ph¸ sang võa hoÆc nhÑ. B¶ng 1. §ét biÕn kh¸ng nguyªn nhanh vµ c¸c ®¹i dÞch (11, 25) N¨m  Tªn chñng virót  Møc ®é  Sè ng­êi chÕt   1889  H3N2  Võa ph¶i  1 triÖu   1918  H1N1 ("Spanish")  Nghiªm träng  40 - 100 triÖu   1957  H2N2 ("Asian")  Võa ph¶i  1 - 1,5 triÖu   1968  H3N2("Hong kong")  NhÑ  0,75 - 1 triÖu   ?            C¸c ®¹i dÞch Cóm lu©n chuyÓn trªn toµn cÇu theo nhiÒu ®ît kÕ tiÕp nhau, vµ kh«ng cã c¸ch nµo ®Ó ng¨n ngõa sù lan réng cña mét virót g©y ®¹i dÞch Cóm míi. Mét ®Æc ®iÓm cña Cóm trong ®¹i dÞch lµ sè tö vong chuyÓn sang nhãm tuæi trÎ h¬n. Mét nöa sè tö vong cã liªn quan ®Õn Cóm trong ®¹i dÞch 1968 vµ phÇn lín nh÷ng ca tö vong liªn quan ®Õn Cóm trong c¸c ®¹i dÞch 1957 vµ 1918, ®Òu x¶y ra ë ng­êi < 65 tuæi. Kinh nghiÖm trong qu¸ khø chØ ra r»ng kh«ng cã quy t¾c chung cho c¸c ®¹i dÞch vµ còng kh«ng cã c¬ së tin cËy nµo ®Ó dù ®o¸n thêi gian vµ n¬i ®¹i dÞch cã thÓ xuÊt hiÖn. Trong suèt thÕ kû 20, c¸c ®¹i dÞch x¶y ra ë nh÷ng kho¶ng thêi gian t­¬ng ®èi dµi vµ kh«ng thÓ dù ®o¸n tr­íc ®­îc, tõ 9 ®Õn 39 n¨m trong suèt c¸c ®¹i dÞch 1918 (H1N1), 1957 (H2H2), 1968 (H3N2) vµ 1977 víi quy m« nhá h¬n. Trong n¨m 1957, virót H2N2 ®· thay thÕ hoµn toµn virót H1N1 tr­íc ®ã, vµ trong n¨m 1968, H3N2 thay thÕ H2N2. Sù t¸i xuÊt hiÖn cña H1N1 n¨m 1977 kh«ng g©y ra mét ®¹i dÞch thËt sù, bëi nhiÒu ng­êi sinh tr­íc n¨m 1957 ®· ®­îc miÔn nhiÔm mét phÇn. H¬n thÕ n÷a, virót H1N1 kh«ng thay thÕ H3N2. Tõ n¨m 1968, c¶ hai ph©n týp H1N1 vµ H3N2 l­u hµnh ®ång thêi víi virót Cóm B g©y ra nh÷ng vô dÞch bïng ph¸t trªn ng­êi trong giai ®o¹n tiÒn ®¹i dÞch. Dù phßng vµ kiÓm so¸t BiÖn ph¸p phßng chèng h÷u hiÖu nhÊt ®èi víi dÞch Cóm lµ tiªm phßng v¾c xin. V¾c xin Cóm cã hiÖu qu¶ b¶o vÖ 70-90% trªn ng­êi trÎ tuæi m¹nh kháe nÕu kh¸ng nguyªn v¾c xin phï hîp víi chñng virót Cóm ®ang l­u hµnh. Tuy nhiªn, hiÖu qu¶ phßng bÖnh cña v¾c xin kh«ng cao ®èi víi trÎ em vµ ng­êi giµ. Víi nh÷ng giíi h¹n cña v¾c xin hiÖn cã, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ph¸t triÓn nh÷ng t¸ chÊt tèt h¬n ®Ó t¨ng c­êng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾c xin Cóm còng nh­ ph¸t triÓn v¾c xin sèng gi¶m ®éc lùc. Mét trong nh÷ng b­íc tiÕn høa hÑn lµ ph¸t triÓn v¾c xin sèng gi¶m ®éc lùc b»ng thÝch øng nhiÖt ®é l¹nh. Tuy nhiªn, mÆc dï v¾c xin nµy cã hiÖu qu¶ ë trÎ em vµ ng­êi trÎ tuæi th× l¹i qu¸ gi¶m ®éc lùc ®Ó kÝch thÝch sinh kh¸ng thÓ b¶o vÖ ë ng­êi giµ (8). Sù ph¸t triÓn cña kü thuËt di truyÒn ng­îc sö dông hÖ thèng chuyÓn nhiÔm ribonucleoprotein (RNP) cho phÐp thay thÕ c¸c gen cña virót Cóm vµ t¹o thµnh ph©n tö ARN t¸i tæ hîp in vitro. Mét sè t¸ chÊt kh¸c nhau còng ®· ®­îc sö dông ®Ó t¨ng c­êng kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾c xin Cóm. V¾c xin Cóm bÊt ho¹t b»ng formaldehyt hoÆc v¾c xin chøa glycoprotein bÒ mÆt tinh khiÕt ®­îc s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i ph¶i thay ®æi chñng s¶n xuÊt hµng n¨m ®Ó ®¸p øng víi tÝnh ®a d¹ng cña virót. Chñng virót lµ mét trong nh÷ng thµnh phÇn quan träng nhÊt cña s¶n xuÊt v¾c xin Cóm. Chñng virót ph¶i kh«ng cã c¸c yÕu tè ngo¹i lai, cã chøa thµnh phÇn HA vµ NA phï hîp víi chñng g©y dÞch trong n¨m vµ ph¶i cã kh¶ n¨ng nh©n lªn tèt. Dùa trªn th«ng tin tõ m¹ng l­íi gi¸m s¸t Cóm toµn cÇu, hµng n¨m vµo th¸ng Hai, Tæ chøc Y tÕ ThÕ Giíi (WHO) ®· xem xÐt 2 lÇn trong mét n¨m t×nh h×nh dÞch tÔ vÒ Cóm trªn toµn thÕ giíi, khuyÕn c¸o sö dông c¸c chñng virót Cóm míi. Theo khuyÕn c¸o cña WHO th× th­êng xuyªn cÇn thiÕt ph¶i ph¸t triÓn c¸c chñng virót v¾c xin chuÈn cã c¸c tÝnh chÊt kh¸ng nguyªn cña loµi chñng mµ WHO khuyÕn c¸o, vµ cã kh¶ n¨ng nh©n lªn tèt ®Ó viÖc s¶n xuÊt v¾c xin cã hiÖu qu¶. HiÖn t¹i, ®èi víi Cóm mïa, v¾c xin ®­îc cÊp phÐp trªn toµn thÕ giíi ph¶i chøa 2 ph©n týp Cóm A ®ang l­u hµnh lµ H3N2, H1N1 vµ mét chñng Cóm B (42). HiÖn nay trªn thÕ giíi còng ®· rÊt nhiÒu n­íc nh­ Mü, Ph¸p, NhËt B¶n, Trung Quèc, Hungaria víi c¸c h­íng c«ng nghÖ ®ang ®­îc c¸c nhµ s¶n xuÊt lùa chän hiÖn nay bao gåm: 1/ Tõ trøng gµ cã ph«i SPF (Specific Pathogen Free); 2/ Trªn c¸c dßng tÕ bµo ®éng vËt (MDCK); 3/ Sèng gi¶m ®éc lùc vµ 4/ Trªn tÕ bµo Vero (dïng chñng ®éc lùc hoang d¹i). ThÝch øng cña chñng Cóm mïa trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau TÕ bµo Vero Mét trong nh÷ng dßng tÕ bµo ®· ®­îc nghiªn cøu kh¸ kÜ lµ dßng tÕ bµo Vero, thÝch hîp cho viÖc s¶n xuÊt c¸c v¾c xin virót ë ng­êi, nh­ c¸c v¾c xin phßng bÖnh b¹i liÖt vµ bÖnh d¹i (21). Tr­íc ®©y, chØ cã dßng tÕ bµo tiªn ph¸t vµ tÕ bµo l­ìng béi ®­îc sö dông s¶n xuÊt c¸c lo¹i v¾c xin cho ng­êi lµ ®­îc cÊp phÐp. Dßng tÕ bµo th­êng trùc kh«ng ®­îc sö dông bëi nh÷ng lo ng¹i liªn quan ®Õn kh¶ n¨ng lµm xuÊt hiÖn c¸c khèi u vµ sù l©y nhiÔm virót cña nh÷ng dßng tÕ bµo nµy. TÕ bµo Vero, dßng tÕ bµo thËn khØ xanh ch©u Phi th­êng trùc, ®· ®­îc kiÓm nghiÖm trong khÝa c¹nh nµy vµ ng­êi ta còng ®· x©y dùng mét ng©n hµng tÕ bµo Vero ®­îc chÊp thuËn bëi WHO (21). §iÒu nµy chøng minh kh«ng cã t¸c nh©n cña virót vµ kh«ng cã kh¶ n¨ng g©y khèi u ë nh÷ng ®êi cÊy truyÒn trªn dßng tÕ bµo nµy (4, 13, 35). TÕ bµo Vero mÉn c¶m víi mét phæ virót réng nh­ng ë nh÷ng lÇn thö nghiÖm ®Çu tiªn, virót Cóm kh«ng ph¸t triÓn thµnh c«ng trªn tÕ bµo nµy (17, 22). Tuy nhiªn, nh÷ng nghiªn cøu sau ®ã ®· chøng minh r»ng thªm trypsin nhiÒu l©n vµo m«i tr­êng nu«i cÊy cña tÕ bµo Vero ®· nhiÔm virót Cóm phôc håi kiÓu nh©n lªn nhiÒu lÇn cña virót Cóm A vµ B (7, 15). Nghiªn cøu cña Govorkova vµ céng sù cho thÊy dßng tÕ bµo Vero lµ mét hÖ thèng vËt chñ thÝch hîp ®Ó ph©n lËp vµ nu«i cÊy c¸c virót Cóm A (7). HiÖu qu¶ ph©n lËp nh÷ng chñng ®ang l­u hµnh hiÖn nay A/H3N2 lµ t­¬ng tù ë tÕ bµo Vero vµ MDCK. Trong 72 chñng thÝch øng trªn trøng, 90,3% ®­îc ph¸t hiÖn cã hiÖu gi¸ HA trªn tÕ bµo Vero sau lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn vµ 51,4% sau lÇn thø hai. Nh÷ng tr×nh tù axit amin cña vïng HA1 cña c¸c virót Cóm A ®­îc ph©n lËp vµ cÊy truyÒn trªn tÕ bµo Vero gièng hÖt nh­ c¸c virót sinh tr­ëng trªn tÕ bµo MDCK. ë nång ®é g©y nhiÔm thÊp, ng­êi ta thu ®­îc s¶n l­îng virót cao b»ng c¸ch thªm nhiÒu lÇn trypsin vµo m«i tr­êng. Sau 20 lÇn cÊy truyÒn chñng A/H1N1, ng­êi ta thu ®­îc l­îng protein cña virót cao nh­ trªn tÕ bµo MDCK. Nh÷ng nghiªn cøu ban ®Çu víi mét sè l­îng chñng giíi h¹n ®· cho thÊy tÕ bµo Vero hç trî tèt cho sù ph©n lËp vµ nh©n lªn cña c¸c chñng virót Cóm A . Nhãm t¸c gi¶ nµy còng ®· chØ ra Vero lµ mét tÕ bµo chñ thÝch hîp ®Ó ph©n lËp vµ nu«i cÊy c¸c chñng virót Cóm B vµ x¸c ®Þnh nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh häc vµ di truyÒn häc cña c¶ virót Cóm A vµ B trªn tÕ bµo Vero. §ång thêi m« t¶ ®Æc ®iÓm c¸c thô thÓ trªn tÕ bµo Vero so víi nh÷ng thô thÓ nµy trªn tÕ bµo MDCK. Ph©n tÝch tr×nh tù ®· kh¼ng ®Þnh HA cña virót Cóm B trªn tÕ bµo Vero gièng hÖt víi HA trªn tÕ bµo MDCK, nh­ng kh¸c víi virót sinh tr­ëng trªn trøng ë c¸c vÞ trÝ axit amin 196 ®Õn 198. TÕ bµo MDCK TÕ bµo thËn chã Madin Darby ®­îc ph©n lËp lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m 1958 vµ ®· ®­îc sö dông réng r·i trong s¶n xuÊt v¾c xin thó y. Chóng cã thÓ s¶n sinh ra khèi l­îng lín virót Cóm (33). Còng nh­ tÕ bµo Vero, MDCK lµ dßng tÕ bµo b¸m dÝnh vµ cã thÓ nu«i cÊy trong m«i tr­êng kh«ng cã serum. MDCK lµ dßng tÕ bµo ®­îc WHO khuyÕn c¸o sö dông ®Ó ph©n lËp virót Cóm A tõ mÉu bÖnh phÈm cña c¸c tr­êng nghi ngê m¾c Cóm. Reina vµ céng sù b¸o c¸o mét b¶n nghiªn cøu so s¸nh cña c¸c dßng tÕ bµo MDCK, Vero vµ MRC-5 trong sù ph©n lËp virót Cóm A. Trong 746 mÉu nghiªn cøu mÉu cã 60 virót Cóm A ®­îc ph©n lËp. Dßng tÕ bµo MDCK thÓ hiÖn sù nh¹y c¶m víi virót Cóm lµ 100%, dßng tÕ bµo Vero lµ 71,4% vµ dßng tÕ bµo MRC-5 lµ 57,1% (26). Qua thèng kª, tÕ bµo MDCK ®· tá râ sù kh¸c nhau ®¸ng kÓ ®èi víi Vero vµ MRC-5. Ph©n tÝch ®Þnh l­îng chØ ra dßng tÕ bµo MDCK nh¹y c¶m h¬n h¼n nh÷ng dßng tÕ bµo kh¸c. Cã vÎ nh­ dßng tÕ bµo MDCK vÉn lµ mét trong nh÷ng dßng tÕ bµo tèt nhÊt ®­îc khuyÕn c¸o ®Ó ph©n lËp virót Cóm A tõ c¸c mÉu bÖnh phÈm ®­êng h« hÊp. Mét nghiªn cøu kh¸c vÒ tr×nh tù axit amin vµ nh÷ng ®Æc ®iÓm sinh häc cña HA cña ba biÕn thÓ cña chñng virót Cóm X-31 (H3N2) khi nu«i cÊy trªn tÕ bµo MDCK. Trong hai biÕn thÓ, cã 2 vÞ trÝ axit amin thay ®æi ë HA1 lµ c¸c axit amin ë vÞ trÝ thø 8 vµ 144 lÇn l­ît t­¬ng øng víi mÊt vÞ trÝ glycosin hãa vµ nh÷ng thay ®æi ®Æc biÖt trong tÝnh kh¸ng nguyªn. Nh­ c¸c virót thÝch øng trªn trøng kh¸c cña ph©n týp H3, virót Cóm X-31 còng nh©n lªn kÐm trªn tÕ bµo. Khi kh«ng cã trypsin, c¸c ®¸m ho¹i tö hÇu nh­ kh«ng thÓ nh×n thÊy vµ rÊt khã cã thÓ ®Õm ®­îc. Khi cã trypsin, c¸c ®¸m ho¹i tö thÊy ®­îc râ rµng cã ®­êng kÝnh tõ 1 ®Õn 2 mm. Trong ®iÒu kiÖn nµy, sè l­îng ®¸m ho¹i tö ®· t¨ng lªn Ýt nhÊt 100 lÇn (27). TÕ bµo PMKc ViÖc sö dông tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t ®Ó trong s¶n xuÊt v¾c xin phßng virót Cóm lµ mét c«ng nghÖ míi víi c¶ thÕ giíi, ViÖt Nam còng kh«ng ph¶i ngo¹i lÖ. HiÖn nay, thÕ giíi chñ yÕu ®ang sö dông c«ng nghÖ v¾c xin truyÒn thèng lµ s¶n xuÊt trªn trøng gµ cã ph«i. Tuy nhiªn c¸c nhµ khoa häc cña C«ng ty V¾c xin vµ Sinh phÈm sã 1 ®· s¶n xuÊt v¾c xin Cóm A/H5N1 trªn tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t. Qu¸ tr×nh thÝch øng chñng rgH5N1 cã hiÖu qu¶ trªn tÕ bµo PMKc vµ nghiªn cøu ph¸t triÓn v¾c xin Cóm A/H5N1 trªn dßng tÕ bµo nµy ®· cã nh÷ng thµnh c«ng nhÊt ®Þnh (1). KÕt qu¶ nµy còng ®ång thêi còng høa hÑn kh¶ n¨ng thÝch øng tèt nh÷ng chñng virót Cóm mïa trªn dßng tÕ bµo nµy. Ch­¬ng 2 VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU VËT LIÖU CHUNG PhiÕn 24 giÕng (Nunc - §an M¹ch) Chai 25cm2 vµ 75cm2 (Nunc - §an M¹ch) Tñ Êm 37oC (Memmert - §øc) Tñ Êm CO2 (Sanyo - NhËt) Hèt v« trïng (Biosyt - Ph¸p) KÝnh hiÓn vi lén ng­îc (Olympus - NhËt) TÕ bµo TÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t mét líp (Do Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt v¾c xin vµ sinh phÈm y tÕ cung cÊp. TÕ bµo nµy ®­îc chuÈn bÞ tõ nguån khØ s¹ch ®· ®­îc kiÓm tra kh«ng cã c¸c t¸c nh©n ngo¹i lai nh­: SV40, SFV, SIV, virót B, M. tuberculosis) TÕ bµo MDCK (Do Ng©n hµng tÕ bµo Ch©u ©u cung cÊp) TÕ bµo Vero (Do Ng©n hµng tÕ bµo Ch©u ©u cung cÊp) Chñng virót Chñng virót Cóm A H1N1 A/New Caledonia 20/99 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) Chñng virót Cóm A H3N2 A/Wisconsin/ 67/2005 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) Chñng virót Cóm B B/Malaysia/ 2506/2004 (Do ViÖn Quèc gia sinh phÈm chuÈn, UK cung cÊp) M«i tr­êng vµ hãa chÊt MEM (Gibco) FBS (Gibco) PBS (-) (Gibco) Trypsin-EDTA 0,25% (Gibco) Trypsin-TPCK (Sigma) Hank’s (Gibco) Ph­¬ng ph¸p chuÈn bÞ tÕ bµo LÊy tÕ bµo tõ nit¬ láng ChuÈn bÞ chai nu«i tÕ bµo 75 cm2 hoÆc 25 cm2 (tuú môc ®Ých sö dông) ®· cã s½n m«i tr­êng nu«i (vÝ dô: MEM 10% FBS) ë 37oC hoÆc ë nhiÖt ®é phßng. TiÕn hµnh lÊy èng tÕ bµo khái nit¬ láng, lµm ®«ng tan. V« trïng èng tÕ bµo tr­íc khi më n¾p èng. Hót dÞch tÕ bµo tõ èng (cßn l¹nh) chuyÓn sang chai nu«i ®· cã s½n m«i tr­êng. L¸ng nhÑ ®Ó tÕ bµo ph©n bè ®Òu trong dÞch m«i tr­êng. Nu«i tÕ bµo trong 37oC trong 6-8h hoÆc qua ®ªm ®Ó tÕ bµo b¸m vµo bÒ mÆt chai. Thay m«i tr­êng cho tÕ bµo b»ng m«i tr­êng nu«i sau 24h (tuú thuéc dßng tÕ bµo vµ môc ®Ých thÝ nghiÖm, vÝ dô: MEM 5% FBS cho tÕ bµo MDCK ). T¸ch tÕ bµo Nu«i tÕ bµo kÝn mét líp. Hót bá m«i tr­êng trong chai nu«i tÕ bµo. Röa tÕ bµo b»ng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vµo chai, l¸ng ®Òu. §Ó chai tÕ bµo ë 370C kho¶ng 20-30 phót ®Õn khi tÕ bµo bong khái thµnh chai. Cho MEM 5% FBS vµo chai, hót lªn hót xuèng vµi lÇn. Ph©n chia ra c¸c chai míi tïy thuéc tû lÖ t¸ch. Thªm vµo mçi chai cho ®ñ l­îng m«i tr­êng MEM 10% FBS. ñ ë 370C cho ®Õn khi tÕ bµo kÝn mét líp. Ph­¬ng ph¸p g©y nhiÔm virót Cóm Pha lo·ng virót b»ng Hank’s ®Õn nång ®é cÇn g©y nhiÔm (vÝ dô 0,01PFU/tÕ bµo). Hót bá m«i tr­êng trong chai nu«i tÕ bµo. Röa tÕ bµo b»ng Hank’s. G©y nhiÔm hçn dÞch virót ®· pha lo·ng vµo chai nu«i tÕ bµo, chai cßn l¹i lµm chøng (-) cho Hank’s. L¸ng nhÑ cho hçn dÞch dµn ®Òu trªn bÒ mÆt tÕ bµo. HÊp phô virót ë nhiÖt ®é phßng trong 1h, cø 20 phót l¸ng 1 lÇn. ChuÈn bÞ m«i tr­êng nu«i cÊy virót: pha TPCK-trypsin trong m«i tr­êng MEM. Nu«i virót ë 37oC trong 72-96h. Theo dâi møc ®é hñy ho¹i cña virót hµng ngµy. Ph­¬ng ph¸p gÆt virót Sau 72-96h g©y nhiÔm, thu lÊy hçn dÞch virót trong èng eppendorf v« trïng. Ly t©m 8000 vßng/phót trong 5 phót, 4oC ®Ó lo¹i bá x¸c tÕ bµo, thu n­íc næi. B¶o qu¶n virót ë -80oC PH¶N øNG NG¦NG KÕT HåNG CÇU ChuÈn bÞ hång cÇu LÊy 1ml m¸u gµ vµo èng falcon chøa dung dÞch b¶o qu¶n Alsever. Ly t©m 2500 vßng/phót trong 5 phót ë 250C. Hót n­íc næi, thªm 5ml PBS (-) vµo èng. TiÕp tôc ly t©m 2500 vßng/phót trong 5 phót ë 250C, lÆp ®i lÆp l¹i 4 lÇn. Pha dung dÞch 0,5% hång cÇu gµ trong PBS (-). TiÕn hµnh HiÖu gi¸ virót sau khi gÆt sÏ ®­îc ®¸nh gi¸ b»ng ph¶n øng ng­ng kÕt hång cÇu (HA). LÊy phiÕn thö, viÕt tªn mÉu theo thø tù: (-), (+) vµ c¸c mÉu thö. Cho vµo mçi giÕng 50µl PBS (-). Hót 50µl mÉu vµo c¸c giÕng ®Çu tiªn, giÕng (-) cho 50µl PBS (-). Pha lo·ng mÉu b»ng c¸ch hót 50µl mÉu tõ giÕng ®Çu tiªn chuyÓn sang giÕng tiÕp theo, ®Õn giÕng cuèi cïng còng hót bá 50µl vµ bá ®Çu c«n. Mçi giÕng hót lªn hót xuèng 5 lÇn. Thªm vµo mçi giÕng 50µl dung dÞch 0,5% hång cÇu gµ. Vç nhÑ vµo phiÕn vµ ®Ëy n¾p. §Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 30 phót vµ ®äc kÕt qu¶. KÕt qu¶ HiÖu gi¸ HA lµ nång ®é pha lo·ng thÊp nhÊt cña mÉu cßn cã kh¶ n¨ng ng­ng kÕt hång cÇu. C¸c giÕng cã kh¶ n¨ng ng­ng kÕt HA lµ c¸c giÕng khi nghiªng, hång cÇu ch¶y xuèng cã h×nh giät lÖ. C¨n cø vµo chøng (-) vµ (+) ®Ó ®¸nh gi¸ thö nghiÖm. QUY TR×NH CHUÈN §é HIÖU GI¸ Virót Cóm VËt liÖu TÕ bµo MDCK. M«i tr­êng Hank’s: pH 6,8 - 7,2 Dung dÞch Trypsin 0,25% Trypsin (Gibco - Mü) 2,5g EDTA (BDH - Anh) 1g PBS d¹ng bét (Sigma - Mü) 1 gãi N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1000 ml M«i tr­êng nu«i cÊy MEM (Gibco) M«i tr­êng MEM 2X MEM d¹ng bét (Gibco - Mü) 1 gãi Sodium bicarbonate (Gibco - Mü) 20 ml Aminoacid (Gibco - Mü) 10 ml L - Glutamin 200 mM/ml (Gibco - Mü) 5 ml Gentamicin 10 mg/ml 2 ml Fungizone 250 µg/ml (Gibco - Mü) 0,5 ml N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 500 ml M«i tr­êng phñ th¹ch MEM 2X 10 ml MgCl2.6H20 4.1M/1 (Wako - NhËt) 0,2 ml Agarose 1,2% (Seakem - Mü) 10 ml FBS (Sigma - Mü) 0,4 ml Thuèc nhuém Crystal violet Crystal violet (Merck - §øc) 0,325 g Isopropyl alcohol (Amresco - Mü) 12,5 ml Formaldehyde (BDH - Anh) 75 ml N­íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1000 ml Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh ChuÈn bÞ tÕ bµo MDCK M«i tr­êng EMEM 2X ChuÈn bÞ tÕ bµo MDCK ra phiÕn 24 giÕng: Hót hÕt m«i tr­êng trong chai . Röa tÕ bµo b»ng 5ml PBS (-) Cho 0,3ml Trypsin-EDTA vµo chai, l¸ng ®Òu. §Ó chai tÕ bµo ë 37oC kho¶ng 20-30 phót ®Õn khi tÕ bµo bong khái thµnh chai. Cho 5ml MEM 10% FBS vµo chai hót lªn hót xuèng nhiÒu lÇn. Cho thªm 30ml MEM 10% FBS vµo chai, trén ®Òu. Cho vµo 3 phiÕn, mçi phiÕn 12ml, 0,5ml/giÕng. Cho vµo tñ CO2, 37oC. ChuÈn bÞ m«i tr­êng phñ th¹ch: cho 1 phiÕn EMEM 2X 10ml DW 3,8ml 1% DEAE-dextran 0,2ml Trypsin 1,2(l Agarose 2% 6ml 2.9.2.2. TiÕn hµnh MÉu thö ®­îc pha lo·ng bËc 10 ë 8 nång ®é g©y nhiÔm tõ 10-1 ®Õn 10-8 b»ng Hank’s. LÊy phiÕn ra khái tñ Êm, viÕt tªn vµ ®é pha lo·ng trªn n¾p giÕng. Hót bá m«i tr­êng theo c¹nh giÕng. Röa c¸c giÕng tÕ bµo b»ng c¸ch cho 0,5ml Hank’s vµo tÊt c¶ c¸c giÕng, l¸ng ®Òu Hank’s trªn bÒ mÆt tÕ bµo. L¾c qua l¾c l¹i nhÑ nhµng ®Ó lo¹i bá tÕ bµo chÕt. Hót hÕt Hank’s ë trong giÕng tÕ bµo. Cho 200µl Hank’s vµo giÕng tÕ bµo chøng vµ 100µl Hank’s vµo c¸c giÕng g©y nhiÔm. Hót 100µl dung dÞch ë c¸c ®é pha lo·ng vµo c¸c giÕng g©y nhiÔm theo s¬ ®å phiÕn thö S¬ ®å phiÕn thö:  1  2  3  4  5  6   A  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   B  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   C  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   D  TÕ bµo chøng  10-4  10-5  10-6  10-7  10-8   §Ëy kÝn phiÕn tÕ bµo ®· g©y nhiÔm, ®Ó hÊp phô 2 giê trong tñ Êm 5% CO2, nhiÖt ®é 37oC. Lo¹i bá n­íc næi trong c¸c giÕng. Cho vµo mçi giÕng 0,6ml dung dÞch phñ th¹ch. §Ó vµo tñ Êm CO2/37oC trong 3 ngµy. Nhuém th¹ch b»ng thuèc nhuém Crystal violet, 400µl/giÕng. ñ ë tñ Êm 37oC. Sau 3-4h röa líp th¹ch phñ, ®äc kÕt qu¶. C¸ch tÝnh kÕt qu¶ C¸c ®¸m ho¹i tö lµ nh÷ng ®èm tr¾ng cã thÓ nh×n thÊy b»ng m¾t th­êng n»m ë mÆt ®¸y cña c¸c giÕng khi soi trªn ®Ìn. §Õm c¸c ®¸m ho¹i tö ë mçi giÕng råi ghi l¹i. HiÖu gi¸ virót Cóm = sè ®¸m ho¹i tö (PFU)/ ml C«ng thøc tÝnh hiÖu gi¸ cña virót Cóm:
 Ch­¬ng 3 KÕT QU¶ Vµ BµN LUËN ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng thÝch øng cña virót Cóm a/h1n1, a/h3n2 vµ b trªn c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau Sù nh©n lªn cña virót Cóm trªn tÕ bµo Vero TÕ bµo Vero ®­îc g©y nhiÔm víi ba chñng virót Cóm mïa A/H1N1, A/H3N2 vµ Cóm B. Quan s¸t sù nh©n lªn cña virót trong khi nu«i cÊy b»ng d­íi kÝnh hiÓn vi ®Ó kiÓm tra møc ®é hñy ho¹i (CPE) vµ ®¸nh gi¸ nhanh hiÖu gi¸ kh¸ng nguyªn virót th«ng qua ph¶n øng ng­ng kÕt hång cÇu (HA) t¹i nh÷ng thêi ®iÓm: 24 giê, 48 giê, 72 giê vµ 96 giê sau khi g©y nhiÔm.

 

  H×nh 5. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 24 giê g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). B¶ng 2. Møc ®é hñy ho¹i (% CPE) trªn tÕ bµo Vero qua c¸c lÇn cÊy truyÒn LÇn cÊy truyÒn (Vn)  Møc ®é hñy ho¹i (%CPE)    H1N1  H3N2  B    24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h   V1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V2  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V3  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V5  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V6  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V7  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V8  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V9  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V10  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  

 

  H×nh 6. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 48 giê g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm).

 

  H×nh 7. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 72h g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). .

 

  H×nh 8. ¶nh chôp tÕ bµo Vero ë lÇn cÊy truyÒn thø 10 sau 96h g©y nhiÔm víi ba chñng Cóm A/H1N1 (B), A/H3N2 (C) vµ B (D). (A) lµ ¶nh chôp tÕ bµo chøng (tÕ bµo kh«ng nhiÔm virót Cóm). ¶nh chôp cho thÊy tÕ bµo Vero ®­îc g©y nhiÔm vµ tÕ bµo chøng kh«ng cã sù kh¸c biÖt. TÕ bµo vÉn mäc kh¸ dµy vµ kh«ng thÊy sù ph¸t triÓn cña virót. KÕt qu¶ thu ®­îc cho thÊy virót gÇn nh­ kh«ng hñy ho¹i tÕ bµo Vero tõ nh÷ng lÇn cÊy truyÒn ®Çu tiªn ®Õn nh÷ng lÇn cÊy truyÒn cuèi cïng. Do ®ã thö nghiÖm HA cña virót gi¶i phãng vµo n­íc næi còng kh«ng ®em l¹i kÕt qu¶ (b¶ng 3). B¶ng 3. So s¸nh hiÖu gi¸ HA cña virót Cóm qua c¸c lÇn cÊy truyÒn trªn tÕ bµo Vero LÇn cÊy truyÒn (Vn)  HiÖu gi¸ HA    H1N1  H3N2  B    24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h  24h  48h  72h  96h   V1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V2  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V3  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V5  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V6  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V7  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V8  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V9  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   V10  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0   Nh­ vËy sau 10 ®êi nu«i cÊy, cã thÓ rót ra kÕt luËn c¶ 3 chñng virót Cóm mïa ®Òu kh«ng thÝch øng ®­îc trªn tÕ bµo Vero.