Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của cây chùm ngây (Moringa Oleifera Lam.) ở một số tỉnh Nam và Nam Trung Bộ Việt Nam

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 180 NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.) Ở MỘT SỐ TỈNH NAM VÀ NAM TRUNG BỘ VIỆT NAM Nguyễn Thanh Tố Nhi*, Trần Công Luận*, Lý Thu Yến**, Trần Hồng Bảo Quyên**, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Moringa oleifera là loài duy nhất trong chi Moringa được tìm thấy ở Việt Nam. Chúng mọc hoang và được ươm trồng trong vườn nhà hay tại các công ty tư nhân ở khu vực Nam và Nam Trung Bộ, với nguồn giống thu thập trong cũng như ngoài nước. Tuy nhiên, hiện nay chưa có báo cáo nào về tính đa dạng di truyền của loài này tại Việt Nam làm cơ sở chọn giống và quy hoạch vùng trồng. Báo cáo này thể hiện kết quả bước đầu đánh giá tính đa dạng di truyền các mẫu chùm ngây được thu thập tại khu vực các tỉnh Nam và Nam Trung bộ Việt Nam thông qua chỉ thị phân tử ITS. Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: 23 mẫu lá Chùm ngây tươi, 1 mẫu bột lá Chùm ngây. Phương pháp nghiên cứu: Phân tích đa dạng di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS. Kết quả: Trình tự nucleotide vùng ITS của các mẫu Chùm ngây có độ dài dao động trong khoảng 596 – 644 bp. Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các trình tự sau hiệu chỉnh trên GenBank, cho thấy tất cả các mẫu khảo sát đều có kết quả trùng khớp với trình tự Moringa oleifera trên GenBank (độ bao phủ là 96-100%; độ tương đồng là 95-96%), riêng mẫu KH5 có độ bao phủ là 93%. 24 mẫu Chùm ngây đã được giải trình tự thành công, đúng thuộc loài Moringa oleifera, giá trị bootstrap ủng hộ cho nhóm này là 94%. Kết luận: Phương pháp giải trình tự gen vùng ITS đã chứng minh được 24 mẫu Chùm ngây khảo sát đúng thuộc loài Moringa oleifera và có tính đa dạng di truyền thấp. Các mẫu Chùm ngây thuộc một số tỉnh Nam và Trung Bộ có thể có chung nguồn gốc với Chùm ngây thu thập tại vườn thực vật quốc gia Bỉ (8). Từ khóa: Chùm ngây, chỉ thị phân tử ITS. ABSTRACT STUDY ON THE GENETIC DIVERSITY OF MORINGA OLEIFERA FROM SOME PROVINCES OF SOUTHERN AND SOUTH CENTRAL VIETNAM Nguyen Thanh To Nhi, Tran Cong Luan, Ly Thu Yen, Tran Hong Bao Quyen, Nguyen Thi Ngoc Tuyet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 180 - 184 Objectives: Moringa oleifera is the only species in the genus Morgina found in Vietnam. It is grown wildly, in home gardens or in private farms in Southern and South Central Vietnam, which the seeds are originated from domestic and abroad as well. However, there is no report on the genetic relationship from samples of Moringa oleifera collected in Vietnam. This present study is conducted to evaluate the genetic diversity of samples of Moringa oleifera collected in Southern and South Central Vietnam. Materials & Methods: Study on phylogenic analysis of 23 fresh samples and 1 powder sample collected from Southern and South Central provinces by the ITS sequencing method. ∗ Khoa Y học cổ truyền – ĐH Y Dược Tp. HCM ∗∗ Công ty cổ phần công nghệ Gen-Việt Tất Thành Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Công Luận ĐT: 0903671323 Email: congluan53@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 181 Results: After checking the signal peaks, exporting the consensuses, all fragments were aligned and blasted on GenBank. As the result, ITS regions of all samples are 596-644 bp in lenght. Since the max identy values between these sequence and the Moringa oleifera sequences which are available in Genbank reach to 95-96% with the covery values of 96-100% except 93% for KH5, it preliminary conludes that these 24 samples belongs to Moringa oleifera. In addition, the boostrap value that indicates the phylogenic relationship among 24 samples is 94%. Conclusion: 24 Moringa oleifera specimens were low in diversity due to the boostrap value 94%. These 24 samples, collected in Southern and South Central Vietnam, may have the same origin as the Moringa oleifera obtained in Belgium National Botanic Garden (8) Keywords: Moringa oleifera, ITS sequence. ĐẶT VẤN ĐỀ Moringa oleifera thuộc chi Moringa, họ Moringaceae, bộ Brassicales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliphyta. Chùm ngây là loài cây có hàm lượng dinh dưỡng cao, chịu hạn tốt, thích hợp trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới(3). Theo Fuglie(4), các bộ phận của cây Chùm ngây được sử dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi; trong thực phẩm; trong dược phẩm và trong xử lý nguồn nước. Do đó, Chùm ngây đã đem lại lợi ích kinh tế, xóa nghèo và giải quyết tình trạng suy dinh dưỡng cho phần đông dân số ở các nước châu Á và châu Phi. Moringa oleifera là loài duy nhất trong chi Moringa được tìm thấy ở Việt Nam. Chúng mọc hoang và được ươm trồng trong vườn nhà, tại các công ty tư nhân ở khu vực Nam và Nam Trung Bộ, với nguồn giống thu thập ở trong nước và ở nước ngoài. Tuy nhiên, hiện nay chưa có báo cáo nào về tính đa dạng di truyền của loài này tại Việt Nam. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu về tính đa dạng di truyền của Chùm ngây, trước hết chỉ để đánh giá mức độ khác biệt kiểu gen bên trong loài, nhằm định hướng cho nghiên cứu xác định mối tương quan giữa sự đa dạng di truyền và thành phần hóa học, thành phần dinh dưỡng của các cá thể trong cùng một loài. Vùng ITS đại diện cho hầu hết tất cả các sinh vật, do chúng là một phần của một đơn vị phiên mã của DNA ribosom. Vùng ITS bao gồm 3 thành phần: các trình tự biến thiên ITS1 và ITS2, và exon DNA riboxom 5.8S có tính bảo tồn cao(9). Các trình tự ITS không mã hóa cho RNA chức năng, vì vậy chúng tích lũy đột biến với tỷ lệ cao hơn các vùng khác trên DNA, do đó trình tự ITS có ý nghĩa trong đánh giá đa dạng ở mức loài và dưới loài (1, 6). Do vậy, phương pháp giải trình tự ITS được sử dụng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền bên trong loài Chùm ngây. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: 23 mẫu lá Chùm ngây tươi, 1 mẫu bột lá Chùm ngây, được thu thập từ 6 tỉnh, 4 huyện, 2 thành phố và 1 thị xã thuộc Nam và Trung Bộ Việt Nam (Bảng 1). Bảng 1. Danh sách các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu. STT Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu 1 AD Mẫu lá tươi của Ấn Độ do Trung tâm sâm và dược liệu TPHCM cung cấp 2 ADB Mẫu lá bột của Ấn Độ do Trung tâm sâm và dược liệu TPHCM cung cấp 3 AG1 Huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang (Bản địa) 4 AG2 Huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang (Trồng) 5 AG3 Huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang (Thuộc giống Mỹ) 6 BT1 Xã Phong Nẫm, thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận 7 BT3 Xã Phong Nẫm, thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận 8 BT5 Xã Phong Nẫm, thành phố Phan Thiết, tỉnh Bình Thuận 9 DN Công ty Hanh Thông, Đồng Nai 10 HC Quận 2, TPHCM 11 HW Mẫu của Mỹ do Trung tâm sâm và dược liệu cung cấp 12 KH1 Thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa 13 KH2 Thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa 14 KH3 Thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 182 STT Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu 15 KH4 Thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa 16 KH5 Huyện Diên Khánh, tỉnh Khánh Hòa 17 PY1 Khu phố Mỹ Sơn, thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên 18 PY2 Khu phố Mỹ Sơn, thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên 19 PY3 Thôn Nhiêu Hậu, TX. Sông Cầu, tỉnh Phú Yên 20 PY5 Khu phố Chánh Bắc, thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên 21 PY6 Khu phố Mỹ Sơn, thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên 22 PY7 Khu phố Mỹ Sơn, thị xã Sông Cầu, tỉnh Phú Yên 23 PY8 Huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên 24 UN Công ty Hanh Thông (giống Mỹ) Phương pháp nghiên cứu Tách chiết và tinh sạch DNA Theo phương pháp CTAB của Doyle & Doyle (2) có cải biên, sử dụng thêm PVP (5). Lá tươi được nghiền mịn với nitơ lỏng, sau đó được ủ ở 65 oC trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ với dung dịch đệm chiết (100 mM Tris- HCl (pH 8), 50 mM EDTA (pH 8), 1,5 M NaCl, 2,5% CTAB (Hexadecyltrimethylammonium bromide), 1% β-mercaptoethanol (v/v), 1% PVP (Polyvinylpyrrolidone (w/v)). Thêm đồng lượng hỗn hợp chloroform - isoamylacohol (24:1) và lắc đảo, ly tâm và thu dịch nổi. Loại bỏ RNA bằng RNase A trước khi tạo tủa với cồn và hòa tan cắn trong 30 µl TE0,1. Nhận biết sự hiện diện của DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. DNA tinh sạch được xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng phương pháp đo quang, sau đó được bảo quản ở -20 0C đến khi dùng. Khuếch đại và giải trình tự nucleotide vùng ITS (6,8) Vùng ITS của Chùm ngây được khuếch đại bởi cặp mồi plt8, plt9 với thành phần phản ứng trong 25µl: PCR buffer 1X, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,02 mM, mồi plt8 0,5mM, mồi plt 9 0,5mM, iTaq polymerase (BioRad) 1 U, 10 ng DNA toàn phần và thực hiện chu trình luân nhiệt như sau: 1 chu kỳ 94 0C trong 3 phút; 35 chu kỳ với 3 bước: 94 0C trong 1 phút, 50 0C trong 1 phút và 72 0C trong 2 phút; cuối cùng là chu kỳ kéo dài 10 phút ở 72 0C. Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1,5 % có nhuộm với ethidium bromide 1mg/ml. Điện di được thực hiện trong 40 phút, ở 150 Voltage, trong dung dịch TAE 1X, sử dụng thang chuẩn 100bp của invitrogen. Kết quả điện di được quan sát bằng máy Dolphin Doc (Wealtec). Sau điện di kiểm tra, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega) và giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Phân tích tương quan di truyền Kết quả giải trình tự được xử lý qua các bước sau: Hiệu chỉnh trình tự, so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank. Xây dựng bộ dữ liệu DNA, dò tìm mô hình tiến hoá, xây dựng cây phát sinh loài. Phần mềm được sử dụng cho phân tích này là Seaview 4, Mega 5.05.(9). KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Khuếch đại trình tự nucleotide vùng ITS Phản ứng PCR với mồi plt8, plt9 đã khuếch đại được đoạn ITS của 24 mẫu Chùm ngây với sự xuất hiện một băng có kích thước khoảng 700 bp, mẫu chứng âm không cho bất kỳ sản phẩm PCR nào (Hình 1). Giải trình tự nucleotide vùng ITS Sản phẩm khuếch đại vùng ITS, sau khi tinh sạch, sẽ được giải trình tự với cả 2 mồi plt8 và plt9 trên toàn bộ 24 mẫu Chùm ngây. Trình tự concensus sau hiệu chỉnh có độ dài dao động trong khoảng 596 nucleotid – 644 nucleotid. Kết quả kiểm tra độ tương đồng của các trình tự sau hiệu chỉnh trên GenBank, cho thấy tất cả các mẫu khảo sát đều có kết quả trùng khớp với trình tự Moringa oleifera trên GenBank (độ bao phủ là 96 -.100%; độ tương đồng là 95.-.96%), riêng mẫu KH5 có độ bao phủ là 93%, tuy nhiên mẫu này có tương đồng với trình tự gốc trên Gen bank là 96%, vì vậy chúng tôi vẫn sử dụng mẫu này cho các phân tích tiếp sau. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 183 Hình 1. Sản phẩm khuếch đại vùng ITS của 24 mẫu Chùm ngây. Phân tích mối quan hệ di truyền Để phân tích cây phát sinh loài, một bộ cơ sở dữ liệu được xây dựng bao gồm 24 trình tự của đề tài này và 3 trình tự tham khảo trên GenBank, trong đó có 1 trình tự nhóm trong là Moringa oleifera (assession number: AY845130), 2 trình tự nhóm ngoài là Moringa ovalifolia (assession number: AY461551) và Carica papaya (assession number: (assession number: AY461547). Sau khi được sắp cột thẳng hàng bằng seaview và loại bỏ các vùng không bảo tồn, các trình tự khảo sát có độ dài 567 nucleotid. Ở một số vị trí còn tồn tại các điểm gap được xử lý như các điểm chưa xác định (missing data). Bộ dữ liệu gồm 27 trình tự, dài 567 nucleotid được chuyển vào phần mềm Mega 5.05 để xác định mô hình tiến hoá tối ưu. Kết quả cho thấy mô hình phù hợp nhất cho bộ dữ liệu trên là T92 tức mô hình Tamura- 3parameter, với các thông số như sau: -lnL = 1477.695, r(AT)=0,037, r(AC)=0,065, r(AG)=0,189, r(CG)=0,065, r(CT)=0,107, r(GT)=0,037. Cây phát sinh loài ở cả 3 phương pháp Maximum Likelihood, Maximum Parsimony, Neighbour Joining được thiết lập bằng phần mềm Mega 5.05 (đã được sử dụng bởi Stensvold, cho kết quả đáng tin cậy) dựa trên các thông số của mô hình tiến hóa (Hình 2). Hình 2. Cây phát sinh loài thiết lập theo phương pháp ML, sử dụng phần mềm Mega 5.05. Kết quả thiết lập cây phát sinh loài của 24 mẫu Chùm ngây là khác nhau ở 3 phương pháp. Cây phát sinh loài thiết lập theo phương pháp ML được chọn để phân tích kết quả, bởi phương pháp này tìm cây tiến hóa bằng cách đưa ra các mô hình có thể xảy ra và tìm ra mô hình tối ưu nhất (là khả năng lớn nhất có thể xảy ra từ các số liệu và mô hình đưa ra). Kết quả phân tích trên vùng ITS cho thấy sự đa dạng di truyền tương đối thấp của 24 mẫu Chùm ngây khảo sát, không có sự tương quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý. Điển hình như mẫu Chùm ngây bản địa và thuộc giống Mỹ thu thập tại An Giang có trình tự ITS gần với mẫu Chùm ngây Ấn Độ, nhưng xa mẫu Chùm ngây trồng tại L100bp AD ADB AG1 AG2 AG3 BT1 BT3 BT5 DN HC HW KH1 KH2 KH3 KH4 KH5 PY1 PY2 PY3 PY5 PY6 PY7 PY8 UN (-) 700bp 600bp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 184 An Giang. Các mẫu Bình Thuận có trình tự ITS gần với mẫu Chùm ngây giống Mỹ. Tuy nhiên, kết quả này chứng tỏ rằng các mẫu Chùm ngây thu thập đúng thuộc loài Moringa oleifera (nhóm trong), giá trị bootstrap ủng hộ cho nhóm này là 94%. Do đó, có thể kết luận rằng không xảy ra ngoại nhiễm trong quá trình thu mẫu cũng như lưu trữ mẫu. Mặt khác, các mẫu Chùm ngây thuộc một số tỉnh Nam và NamTrung Bộ có thể có chung nguồn gốc với Chùm ngây thu thập tại vườn thực vật quốc gia Bỉ, mẫu do Olson thu thập trong nghiên cứu của ông(9). KẾT LUẬN Thông qua phương pháp giải trình tự ITS, 24 mẫu Chùm ngây khảo sát đã được giải trình tự thành công và chúng đúng thuộc loài Moringa oleifera. Kết quả phân tích phát sinh loài cho thấy 24 mẫu Chùm ngây thuộc cùng một nhóm lớn, không có sự tương quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý. Kết quả phân tích phát sinh loài 24 mẫu Chùm ngây khảo sát dựa trên vùng ITS chưa đủ khả năng để đánh giá đa dạng di truyền Chùm ngây ở mức dưới loài. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alvarez I, Wendel JF (2003). "Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference". Mol Phyl Evol, 29, pp. 417 - 434. 2. Doyle JJ, Doyle JL (1987). "A rapid DNA isolation procedure for small quantities from fresh leaf tissue". Phytochemistry Bulletin, 19, pp. 11 - 15. 3. Fahey JW (2005). "Moringa oleifera: A review of the medical evidence for its nutritional, therapeutic, and prophylactic properties, part 1". Trees for life journal, 1:5. 4. Fuglie LJ (2001). The miracle tree: the multiple attributes of moringa, CTA/CWS. pp.103 - 115. 5. Khanuja SPS, Shanasy AK, et al (1999). "Rapid isolation of DNA from dry and fresh samples of plants producing large amounts of secondary metabolites and essential oils". Plant molecular biology reporter, 17, pp. 1-7. 6. Mihalov, J.J, Marderosian, A.D., Pierce J.C. (2000). "DNA identification of commercial Ginseng samples". J. argic. food chem., 48, pp. 3744 - 3752. 7. Olson ME (2002). "Combining data from DNA sequences and morphology for a phylogeny of Moringaceae (Brassicales)". Systematic Botany, 27(1), pp. 55 - 73. 8. Trần Thu Hoa và cộng sự (2010). Áp dụng phương pháp phân tích DNA để xác định nguồn gốc của các dược liệu và sản phẩm thuốc từ sâm, sâm bố chính và nghệ. Báo cáo nghiệm thu đề tài do Sở khoa học công nghệ TP. Hồ Chí Minh quản lí, Đại học Y Dược TP. HCM. 9. Wheeler WC, Honeycutt RL (1988). "Paired sequence difference in ribosomal RNAs: evolutionary and phylogenetic implications". Mol Biol Evol, 5, pp. 90 - 96. Ngày nhận bài báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/10/2013, 21/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014