Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc gen tms2 tạo ra các dòng TGMS mới

Đề cương thực tập tốt nghiệpĐề tài:  “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc gen tms2 tạo ra các dòng TGMS mới” Người hướng dẫn : 1.PGS.TS.Phan Hữu Tôn 2.KS.Tống Văn Hải Bộ môn : Công nghệ sinh học ứng dụng Khoa CNSH-Trường ĐHNN-Hà Nội Người thực hiện : SV.Nguyễn Thị Hồng Hạnh Lớp :06-02 CNSH PHầN I :Mở ĐầU 1.1.Đặt vấn đề: Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực chủ yếu trên thế giới(lúa mì,lúa gạo,ngô),có tầm quan trọng sống còn với hơn nửa dân số thế giới.Hiện nay với sự gia tăng dân số nhanh và sự giảm dần diện tích đất nông nghiệp đặc biệt là đất canh tác lúa mỗi năm thì vấn đề đảm bảo an ninh lương thực là yêu cầu cấp thiết cần quan tâm trước mắt cũng như lâu dài.Do đó,để tăng năng suất lúa gạo,một trong những hướng đặt ra có hiệu quả cao đó là sử dụng ưu thế lai. Các giống lúa lai hiện nay cho có thể cho năng suất cao hơn 20-30% so với các giống lúa thường.Hiện nay,chúng ta đang sử dụng hai hệ thống:hệ thống lúa lai hai dòng và hệ thống lúa lai ba dòng.Nhưng lúa lai hai dòng vượt trội hơn hẳn như:cơ hội chọn tạo các dòng bố lớn thuận lợi cho việc cải tạo chất lượng gạo,không có hiệu ứng đồng tế bào chất nên ít bị sâu hại hơn,năng suất cao hơn lúa lai ba dòng từ 5-10%,chỉ cần hai dòng khác nhau về bản chất di truyền(một là dòng TGMS hoặc PGMS,hai là dòng cho phấn) nên giá thành giảm,tính trạng bất dục đực mẫn cảm với điều kiện môi trường(EGMS) chủ yếu do một cặp gen lặn điều khiển thuận lợi cho việc tạo giống mới. Để chọn tạo lúa lai hai dòng thành công thì dòng TGMS phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho ưu thế lai cao.Hiện nay các dòng TGMS đang được sử dụng như:103S,T1S-96,64S,287S,36S2,Kim 76S,Pair 64S và 25S. Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS(tms1, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó,gen tms2 có ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các dòng,giống lúa triển vọng để tạo dòng TGMS tốt,có khả năng phối hợp cao,tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế lai cao như TH3-3,Việt Lai 20,TH3-4,… Bằng việc sử dụng ADN marker(chỉ thị phân tử) thời gian chọn tạo ra các dòng mới được rút ngắn.Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen mong muốn.Kỹ thuật này không chỉ có độ chính xác cao mà còn xác định được trên một lượng lớn vật liệu nghiên cứu. Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các dòng TGMS mới”. 1.2.Mục đích và yêu cầu: 1.2.1.Mục đích: -Xác định gen tms2 trong tập đoàn các dòng TGMS bằng chỉ thị phân tử. -Nghiên cứu di truyền gen tms2. 1.2.2 Yêu cầu : -Khảo sát một số đặc điểm nông sinh học của các tổ hợp lai F1 -Chiết tách AND để tiến hành phản ứng PCR -Đánh giá được khả năng hữu – bất dục bằng phương pháp truyền thống của các tổ hợp lai F2. -Phát hiện gen tms2 ở các dòng TGMS và thế hệ F2 . PHầN II : TổNG QUAN TÀI LIệU 2.1. Hiện tượng ưu thế lai 2.2. Hệ thống lúa lai hai dòng - Khái niệm hệ thống lúa lai hai dòng - Ưu điểm của hệ thống lúa lai hai dòng - Các phương pháp chọn tạo dòng mẹ lúa lai hai dòng(EGMS). + Phương pháp truyền thống + Chỉ thị phân tử và ứng dụng 2.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo lúa lai hai dòng - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam PHầN III : VậT LIệU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CứU 3.1. Đối tượng , vật liệu , địa điểm và thời gian nghiên cứu  3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Gồm một số tổ hợp lai F1­­­ , quần thể F2 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu  * Thí nghiệm trong phòng: Thiết bị :+ Máy PCR , máy chạy điện di , máy chụp ảnh điện di , máy li tâm , máy votex , tủ lạnh , lò vi sóng . + Các loại ống effendof , các loại pipet và đầu tiếp đi kèm . Thành phần cho phản ứng PCR + Cặp mồi phát hiện gen bất dục đực tms2 theo M.T.Lopez và cộng sự (2003)có trình tự là : RM11_F:5’-TCTCCTCTTCCCCCGATC-3’ RM11_R:5’-ATAGCGGGCGAGCTTAG-3’ Hóa chất chạy PCR : dNTD , MgCl2 , Taq ADN polymerase , PCR mastermix , nước cất Hóa chất dùng để chiết tách ADN hệ gen : Thành phần dung dịch đệm chiết tách Ngoài ra còn có : Hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 ) Ethanol 70% Đá lạnh Dung dịch đệm TE Thành phần dung dịch đệm TE Hóa chất dùng cho chạy điện di trên Gel agarose : Agarose 1% , Ethidium Bromide 10mg/ml, loading Bufer(Bromo phenol blue , Xylen cyanol , Saccarose ) * Thí nghiệm ngoài đồng ruộng: Gồm 1 vài tổ hợp lai F1­­­ giữa dòng mẹ TGMS là 103S với các dòng bố khác Cọc tre, nilon, thước. 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu:tại phòng công nghệ sinh học ứng dụng và khu thí nghiệm đồng ruộng khoa nông học – Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội .  3.1.4. Thời gian nghiên cứu : Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2010 đến tháng 5/2010. 3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu +) Theo dõi đặc điểm nông sinh học : Các chỉ tiêu nông sinh học : + Thời gian từ cấy đến bắt đầu trổ(10% số bông thoát khỏi lá đòng). + Thời gian trổ từ khi bắt đầu trỗ(10% số bông thoát khỏi lá đòng) đến khi kết thúc trổ (85% thoát khỏi lá đòng) . + Thời gian tự cấy đến chín(85% số hạt chắc màu vàng) + Tổng thời gian sinh trưởng từ gieo đến khi thu hoạch . + Chiều cao cây (cm) cuối cùng : đo từ mặt đất đến mút đầu bông dài nhất không kể râu . + Chiều dài lá đòng : đo từ gối lá đến đầu mút lá , đo vào giai đoạn chín sáp. + Chiều rộng lá đòng. + Góc độ lá đòng . + Chiều dài bông : đo từ cổ bông đến hết bông vào thời kì chín chắc . Chỉ tiêu các yếu tổ cấu thành năng suất: + Tổng số nhánh(số nhánh max) + Số nhánh hữu hiệu /khóm : đến toàn bộ số nhánh trổ thành bông . + Tổng số hạt/bông. + Số hạt chắc/bông + Khối lượng 1000 hạt . + Số bông hữu hiệu/khóm: đến toàn bộ số bông có từ 10 hạt chắc trở lên + Năng suất lý thuyết được tính theo công thức : NSLT = A x B x C x mật độ/đơn vị diện tích(g) Trong đó: A: số bông hữu hiệu/khóm B: số hạt chắc/bông C: khối lượng 1000 hạt Ưu thế lai của các tổ hợp lai so với bố mẹ :   Ưu thế lai trung bình H(MP%) = MP (mit parent) là giá trị trung bình của hai bố mẹ . ƯTL trung bình là sự biểu hiện hơn hẳn ở một tính trạng nào đó ở con lai F1 so với giá trị trung bình dó ở hai bố mẹ.     Ưu thế lai thực H(BP%) =   BP(best parent) là bố hoặc mẹ tốt nhất . Ưu thế lại thực là biểu hiện sự hơn hẳnn ở một tính trạng nào đó của con lai F1 so với giá trị đó của bố hoặc mẹ tốt nhất. Nghiên cứu chỉ thị phân tử nhằm xác định được gen tms2 có trong các dòng TGMS , các tổ hợp F2. 3.2.2. Phương pháp nghiên cứu * Xác định khả năng chứa gen bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ tms2 bằng phương pháp PCR : +) Chiết tách ADN tổng số của dòng mẹ TGMS,các tổ hợp phân ly F2 theo quy trình cải tiến của Bộ môn Công nghệ sinh học. Bước 1:Thu ngắt mẫu lá khỏe,dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tích 1,5ml,đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh. Bước 2:Cối,chày sứ dùng để nghiền mẫu đã được hấp khử trùng và đặt trong đá lạnh.Các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0,5cm rồi bỏ vào cối. Bước 3:Nhỏ 400 µl dung dịch đệm chiết suất ADN vào cối rồi nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh đen. Bước 4:Bổ sung thêm 400 µl dung dịch chiết suất AND vào pha trộn lẫn sau đó hút 400 µl vào ống eppendorf đã được đánh dấu. Bước 5: Cho 700 µl hỗn hợp Phenol : Chlorofom : Isoamylalcohol ( 25:24:1 ) Bước 6:Cho 600 µl hỗn hợp Chlorofom : Isoamylalcohol(24:1),lắc đều va ly tâm 7 phút với tốc độ 13000 vòng/phút rồi hút phần dung dịch ở trên vào ống eppendorf mới đã đánh dấu tương ứng. Bước 7: Cho 800 µl Ethanol(96%)(hoặc 600 µl Isopropanol),trộn đều và ly tâm 7 phút với tốc độ 13000 vòng/phút.Sau đó đổ phần dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa dưới đáy ống nghiệm. Bước 8: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%,làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm. Bước 9:Hòa tan kết tủa bằng 50 µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -20oC +Kiểm tra độ tinh sạch ADN bằng cáchđiện di trên gel agarose 1%. +Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi RM11 cho gen tms2. Thành phần cho phản ứng PCR Chu trình nhiệt PCR cho cặp mồi tms2 Chạy điện di phát hiện sản phẩm PCR trên gel agarose 1 % *Nghiên cứu ưu thế lai của các tổ hợp lai F1 so với bố +Bố trí thí nghiệm: -Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khảo sát tập đoàn,các con lai F1 trồng cạnh bố tương ứng.Các tổ hợp lai được bố trí tuần tự không nhắc lại. -Ô thí nghiệm được bố trí theo hình chữ nhật,mỗi ô là 5m2. +Các biện pháp kỹ thuật: -Làm đất cày bừa -Thời vụ: Vụ chiêm xuân 2010 -Ngày gieo mạ :01/2010 -Ngày cấy: 02/2010 -Cấy 1 dảnh/khóm,cây x cây 11cm,hàng x hàng 20cm. -Mật đọ cấy 45 khóm/m2. -Lượng phân bón cho 1 ha: Phân đạm 120 kg Phân lân 90kg Phân kali 60kg +Kỹ thuật bón phân: -Bón lót:100%lân + 30%đạm,bón sau khi bừa. -Bón thúc lần 1:50% phân đạm +40% phân kali,bón vào thời kì bắt đầu đẻ nhánh. -Bón thúc lần 2:bón hết số đạm,kali còn lại,bón khi lúa làm đòng. PHầN IV:Dự KIếN Kế HOạCH VÀ KếT QUả ĐạT ĐƯợC 4.1.Kế hoạch: -01/2010,viết đề cương và bảo vệ đề cương -Gieo mạ:06/01/2010 -Cấy: 10/02/2010 -Từ 21/02/2010 khảo sát các đặc điểm nông sinh học,tiến hành phản ứng PCR và viết báo cáo tốt nghiệp.   4.2.Kết quả: -Phát hiện được tổ hợp chứa gen tms2 -Tìm được marker-PCR liên quan đến tính trạng nghiên cứu