Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây bệnh khảm vàng (pymov) trên cây hồ tiêu ở Việt Nam

BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 58 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN NHANH VI-RÖT GÂY BỆNH KHẢM VÀNG (PYMoV) TRÊN CÂY HỒ TIÊU Ở VIỆT NAM Study on PCR Techniques for Detection of Piper Yellow Mottle Virus (PYMoV) on Black Pepper in Viet Nam Tạ Hoàng Anh 1 , Nguyễn Hồng Tuyên 1 , Nguyễn Thúy Hạnh 1 , Nguyễn Thị Thúy 1 và A Ishwara Bhat 2 . Ngày nhận bài: 25.09.2018 Ngày chấp nhận: 28.09.2018 Abstract Four pairs of primers designed at conserved regions corresponding to four Open Reading Frames - OFR1, OFR2, OFR3 and OFR4, of the Piper yellow mottle virus (PYMoV) genome were used in four separated tubes in the same polymerase chain reaction (PCR) for each sample after extraction of total DNA using CTAB method. All four primer pairs gave bright and a single band of expected size including 379bp, 352bp, 539bp and 420bp, respectively, only on the lanes of infected sample but not any in the lane of healthy plant sample (as negative control) on a 0.8% agarose gel after electrophoresis. Like many other Budnavirus, PYMoV was found to occur endogenous virus intergrated most of their genomic sequence in the sequence of the host plant. Hence, in this study for the confirmation of any unspecific amplification in PCR (though no band was found on the healthy control DNA after PCR), the One-Step RT-PCR was done using the same pairs of primers after total RNA extraction using Tri-Reagent. The same result was obtained after electrophoresis as done previously by PCR. Afterwards, the serial dilution of DNA extract was done and gave the sensitivity of PCR protocol was of 10 -3 . These results of PCR and RT-PCR helped to recommend a good protocol using either one of or all those four pairs of primers for a specific and sensitive detection of PYMoV from infected black pepper plants in Vietnam by PCR. Keywords: Piper yellow mottle virus, detection, PCR, RT-PCR 1. ĐẶT VẤN ĐỀ * Cây hồ tiêu (Piper nigrum L., Piperaceae) là một cây gia vị quan trọng, đem lại giá trị kinh tế cao và được trồng phổ biến ở nhiều nước Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Theo thống kê của Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, tính đến năm 2015, tổng diện tích trồng hồ tiêu cả nước lên đến 101.623 ha, tập trung chủ yếu ở miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên, chiếm 93,50% diện tích trồng hồ tiêu trong cả nước. Có 3 giống hồ tiêu được ưa chuộng và trồng phổ biến hiện nay gồm Tiêu Vĩnh Linh (Tiêu Sẻ), Tiêu Trâu và Tiêu Ấn Độ. Diện tích hồ tiêu của Việt Nam năm 2015 đạt 176.789 tấn, chiếm 32% sản lượng của thế giới. Năng suất hồ tiêu bình quân của nước ta đạt 2,6 tấn/ha, vùng Tây Nguyên cao nhất đạt 3,1 tấn/ha. Hiện tượng cây hồ tiêu sinh trưởng kém, độ dài đốt ngắn lại, phần mô lá giữa các gân lá bị khảm vàng, lá biến dạng đã xuất hiện khá phổ 1. Viện Bảo vệ thực vật (PPRI) - P. Đức Thắng, Q. Bắc Từ Liêm, Hà Nội, Việt Nam. 2. Viện Nghiên cứu cây gia vị Ấn Độ (IISR) - Kozhikode 673012, Kerala, Ấn Độ. biến ở hầu khắp các vườn trồng tiêu trên thế giới, nhất là ở các khu vực có vĩ độ cao, năng suất và chất lượng hạt tiêu giảm đáng kể, cây lụi dần và chết (Bhat et al., 2003, 2005). Những triệu chứng này đã được xác định là do vi-rút khảm vàng hồ tiêu, tên tiếng Anh là Piper yellow mottle virus (PYMoV), thuộc nhóm Badnavirus, họ Caulimoviridae, và đã được ghi nhận ở các nước Braxin, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Thái Lan (Lockhart et al., 1997; Duarte et al., 2001; de Silva et al., 2002; Bhat et al., 2003). Bên cạnh PYMoV, các nhóm tác giả cũng ghi nhận Cucumber mosaic virus (CMV) gây nhi m trên hồ tiêu nhưng chủ yếu nhi m kép với PYMoV với tần suất xuất hiện thấp đến rất thấp (Deeshma and Bhat, 2017). Các triệu chứng tương tự như đã được ghi nhận ở các nước trồng hồ tiêu trên thế giới cũng được ghi nhận ở Việt Nam từ nhiều năm nay. Bên cạnh đó, các dạng triệu chứng vàng lá do sinh lý; vàng lá và còi cọc do thiếu dinh dưỡng, do chăm sóc và cắt tỉa không hợp lý hay do thâm canh quá mức khiến cây hồ tiêu kiệt quệ dẫn đến những biểu hiện bất thường hay do phức Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 59 hợp nhiều yếu tốđược người nông dân và cán bộ địa phương gọi chung là hiện tượng “tiêu điên” với những mô tả không thống nhất gữa các khu vực trồng tiêu khác nhau. Piper yellow mottle virus có cấu trúc phân tử là sợi kép DNA mạch vòng. Bộ gene gồm 4 khung đọc mở (ORF) mã hóa 4 protein. PYMoV cũng như nhiều Budnavirus khác có đặc tính “enogenous” (Deeshma et al., 2017), có nghĩa là trong quá trình tái sinh PYMoV “copy” phần lớn bộ gene của mình ở nhiều vị trí khác nhau từ trình tự gene của cây ký chủ. Điều này đã gây khó khăn trong việc xác định một công cụ chẩn đoán có tính đặc hiệu nếu chỉ thực hiện theo các phương pháp thông thường bởi hiện tượng “dương tính giả”. Khi đó, các sản phẩm PCR không chỉ thu được trên các mẫu nhi m mà cũng được khuyếch đại trên cả mẫu đối chứng cây khỏe. Hiện tượng này xảy ra khi đoạn gene được khuyếch đại trong phản ứng PCR nằm trong vùng gene mà PYMoV đã copy từ trình tự gene của cây chủ. Để có được những cặp mồi có tính đặc hiệu với PYMoV thì cần phải được thiết kế trên vùng gene của riêng vi-rút. Các cặp mồi sẽ được thiết kế trên các vùng gene có tính bảo thủ cao của các Budnavirus (trong tự nhiên, các Budnavirus có tính đa dạng rất cao) và chỉ những cặp mồi cho sản phẩm PCR với kích thước như mong đợi trên các mẫu giám định và âm tính trên mẫu đối chứng cây khỏe sẽ được lựa chọn cho các bước tiếp theo. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cùng lúc 4 cặp mồi, trong 4 tube PCR riêng biệt, được thiết kế tại các vùng gene bảo thủ tương ứng trên 4 ORFs (OFR1 - OFR4) của bộ gene PYMoV trong cùng 1 phản ứng PCR với yêu cầu cả 4 cặp mồi đều cho kết quả dương tính rõ trên DNA của mỗi mẫu nhi m bệnh và đều âm tính trên mẫu đối chứng khỏe. Các cặp mồi này chỉ được đề xuất sử dụng khi chúng đều cho kết quả tương tự trong phản ứng RT-PCR, ở bước tiếp theo, sử dụng RNA tổng số tách chiết từ cùng 1 mẫu giám định. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - Mẫu lá hồ tiêu nhi m bệnh:  Mẫu giám định: mẫu lá thu thập tại ấp 1, xã Minh Lập, huyện Chơn Thành, tỉnh Bình Phước, giống tiêu Vĩnh Linh, vườn 5 năm tuổi.  Mẫu đối chứng dương và âm: DNA tách chiết từ mẫu lá bệnh và mẫu lá khỏe thu tại nhà lưới Viện Nghiên cứu cây gia vị (IISR) – Calicut, Kerala, Ấn Độ. - Các cặp mồi được thiết kế tại các vùng gene bảo thủ của Budnavirus tương ứng trên các khung đọc mở ORF1, ORF2, ORF3 và ORF4 trong bộ gene của PYMoV, sử dụng trình tự gene trên GenBank với mã truy cập NC_022365 (Hany et al., 2014). - Phần mềm sử dụng để phân tích và lựa chọn các cặp mồi là VectorNTI 11 và MEGA6. - Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện BVTV và IISR (Ấn Độ). Bảng 1. Danh sách các cặp mồi đƣợc sử dụng ORFs Tên mồi Trình tự mồi (5'  3') Sản phẩm PCR (bp) 1 PYMoV-1F GAGAGATCAATCGAGGATTG 379 PYMoV-1R CAACCTTGGCTATCATCAAC 2 PYMoV-2F TTTGTCAAGCCAAGAGACCAC 352 PYMoV-2R TTGAGTGATTTGGTCCTCCAC 3 PYMoV-3F GAGTACCAACAGGTGATGA 539 PYMoV-3R GTGCTTCCTCTTCTCAATC 4 PYMoV-4F TATGGAAGCAGCTCTCGTTCA 420 PYMoV-4R CTTTGCCCGCACAGATTTGAT 2.2 Phƣơng pháp - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá: 100 mg lá tươi được nghiền bằng chày cối sứ với 500 µl Ext-Bf (DNA Extraction Buffer) cùng 1% (V/v) ME (β-mercaptoethanol) rồi chuyển toàn bộ sang tuýp 2-ml. Tuýp được ủ trong waterbath tại nhiệt độ 65 o C trong 30 phút. Lắc nhẹ tube trước khi BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 60 thêm 500 µl PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol - 25:24:1) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex. Ly tâm 2.500 g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.. Phần dịch trong phía trên được chuyển sang 1 tuýp 1,5-ml khác, cho thêm vào mỗi tuýp 2 l RNase, lắc nhẹ rồi để ở nhiệt độ 3 o C trong 30 phút. Thêm 500 µl CI (Chloroform : Isoamyl alcohol – 24:1) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex trước khi ly tâm 2.500 g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Phần dịch trong phía trên được chuyển sang 1 tuýp 1,5-ml mới. Thêm 50 l Sodium acetate 3M (pH 4,0), lắc nhẹ, rồi thêm một lượng tương đương Isopropanol, lắc nhẹ rồi để lạnh trong nước đá ít nhất 30 phút. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Đổ bỏ phần dung dịch và rửa phần kết tủa bằng 150 l cồn 70 o . Để khô ở nhiệt độ phòng trước khi hòa tan kết tủa với 100 l DEPC-H2O. - Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá: 50 mg lá tươi được nghiền bằng chày cối sứ với 495 µl Tri-Reagent cùng 1% (V/v) ME (β- mercaptoethanol) rồi chuyển toàn bộ sang tuýp 1,5-ml. Thêm lần lượt 50 µl Sodium sulphite 3M và 50 µl Sodium acetate 2M (pH 4,0), lắc thật mạnh hoặc vortex. Thêm 500 l Phenol (water saturated) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Chuyển phần dịch trong phía trên sang 1 tuýp mới. Thêm 100 µl CI (24:1) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex trước khi ủ trong nước đá 15 phút. Thêm vào mỗi tuýp 2 l DNase, lắc nhẹ rồi để ở nhiệt độ 37 o C trong 30 phút. Thêm 100 µl CI (24:1) rồi lắc thật mạnh hoặc vortex trước khi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Thêm một lượng tương đương Isopropanol, lắc nhẹ rồi để lạnh trong nước đá ít nhất 45 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Đổ bỏ phần dung dịch và rửa phần kết tủa bằng 150 l cồn 70 o . Để khô ở nhiệt độ phòng trước khi hòa tan kết tủa với 100 l DEPC-H2O. - DNA Extraction Buffer: Dung dịch mẹ Dung lượng (ml) 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 5,0 0,5 M EDTA (pH 8,0) 0,4 1,4 M NaCl 14,0 Nước Deionized – thêm cho đủ 50 ml 30,6 - Thành phần và chu trình nhiệt PCR: Thành phần PCR Dung tích (l) Nhiệt độ Thời gian Master Mix 12,50 1. 94 o C 3:00 Primer forwards 0,25 2. 94 o C 0:30 Primer reverse 0,25 3. 52 o C 0:30 Deionized H2O 11,00 4. 72 o C 0:30  quay lại 3 (35X) DNA 1,00 5. 72 o C 10:00 Tổng dung tích 25,00 6. 4 o C Hold - Thành phần và chu trình nhiệt RT-PCR: Thành phần PCR Dung tích (l) Nhiệt độ Thời gian 10X PCR-buffer 5,00 1. 42 o C 45:00 0.1M DTT 5,00 2. 94 o C 0:30 25 Mm dTNPs 2,00 3. 52 o C 0:30 1U Taq 3,00 4. 72 o C 0:30  quay lại 3 (35X) 100U RT 0,50 5. 72 o C 10:00 10U RI 0,25 6. 4 o C Hold Primer forwards 0,50 Primer reverse 0,50 Deionized H2O 10,25 RNA Tổng dung tích 50,00 Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 5/2018 61 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định nồng độ DNA và RNA tổng số Hàm lượng và chất lượng DNA hay RNA là một yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR hay RT-PCR. Hàm lượng DNA hay RNA quá thấp hoặc độ tinh sạch không đảm bảo sẽ dẫn đến phản ứng PCR hoặc RT-PCR thất bại. Hàm lượng DNA và RNA được tách chiết và tinh sạch theo các qui trình đã nêu được xác định trên máy đo NANO-DROP ND-100 (bảng 2). Bảng 2. Nồng độ DNA và RNA tổng số xác định bằng máy NANO-DROP ND-100 Nồng độ DNA tổng số Nồng độ RNA tổng số 43 ng/l (Mẫu Ấn Độ) 54 ng/l (Mẫu Việt Nam) 28 ng/l (Mẫu Ấn Độ) 32 ng/l (Mẫu Việt Nam) Kết quả đo nồng độ DNA và RNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá hồ tiêu như trên bảng 2 đã cho thấy lượng nucleic-axits tổng số thu được ở mức thấp thấp. Với qui trình tách chiết RNA tổng số sử dụng Trizol của Viện BVTV (Tạ Hoàng Anh và cs, 2009) luôn cho hàm lượng cao, trên dưới 500 ng/l với mẫu lá lúa và trên dưới 200 ng/l với cá thể rầy. Tuy nhiên, hàm lượng DNA/RNA tổng số như trên bảng 2 cũng là lượng thông thường khi thực hiện trên mẫu lá hồ tiêu. Mặt khác, hàm lượng vi-rút trong cây hồ tiêu luôn thấp đến rất thấp (Bhat et al., 2018) và do đó kỹ thuật ELISA đã từng được thử nghiệm trong chẩn đoán vi-rút PYMoV nhưng không hiệu quả, tỷ lệ phát hiện rất thấp, nói cách khác độ nhạy rất thấp (Bhadramuphy et al., 2005). Đây cũng là lý do mà dung lượng RNA được sử dụng trong mỗi phản ứng RT-PCR như đã nêu trong mục 2.2 là 23 l, so với lượng thông thường khi áp dụng với vi-rút lúa chỉ 2 - 3 l (Tạ Hoàng Anh và cs, 2009). Tuy nhiên, phản ứng PCR có độ nhạy rất cao nên với hàm lượng DNA tổng số như trong bảng 2, mỗi phản ứng PCR chỉ cần 1 l (Xem mục 2.2). 3.2 Kết quả PCR giám định PYMoV Kết quả chạy điện di trên gel-agarose 0,8% trong dung dịch TBE đã ghi nhận cả 4 cặp mồi PYMoV-1F/R, PYMoV-2F/R, PYMoV-3F/R và PYMoV-4F/R đều cho kết quả dương tính với cả mẫu lá hồ tiêu thu tại nhà lưới của Viện Nghiên cứu Cây gia vị (IISR), Ấn Độ là cây đối chứng dương và mẫu lá thu tại Bình Phước (Việt Nam) với kích thước của sản phẩm PCR như thiết kế (bảng 1), tương ứng là 379bp, 352bp, 539bp và 420bp (hình 1). Hình 1. Kết quả giám định PYMoV bằng PCR trên mẫu lá hồ tiêu thu tại nhà lƣới của IISR - Ấn Độ (A: đối chứng cây bệnh; H: đối chứng cây khỏe) và Việt Nam (mẫu B). M: 100bp marker (Thermo Scientific); 380, 352, 540 và 420 là kích thƣớc mong đợi của các sản phẩm PCR tƣơng ứng với các cặp mồi (Primer-1 ~ 4) ở bảng 1 Kết quả PCR thu được như trên hình 1 với độ đậm của các vạch DNA trên gel đã cho thấy độ nhạy cao của kỹ thuật PCR. Mặt khác, việc sử dụng cùng lúc cả 4 cặp mồi đặc hiệu gene như trên cũng nâng cao tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Cả 4 cặp mồi này đều không cho phản ứng dương tính giả trên mẫu đối chứng cây khỏe. 3.3 Kết quả one-tube RT-PCR giám định PYMoV Một đặc điểm chung của nhiều vi-rút thuộc nhóm Budnavirus là hiện tượng “endogenous“ được hiểu là trong quá trình tái sinh trong cây chủ, vi-rút đã “copy“ nhiều đoạn trình tự của cây chủ để tái thiết bộ gene của mình. Các đoạn trình tự này có thể nằm rải rác trong bộ gene của cây chủ. Nói cách khác, một phần bộ gene của vi-rút nằm trong trình tự gene của cây chủ. Điều này đã gây khó khăn cho việc xác định các cặp mồi đặc hiệu cho vi-rút trong quá trình chẩn đoán bệnh. Thực tế tạo ra hiện tượng “dương tính giả“ trên mẫu cây khỏe. M A B H A B H A B H A B H ------- Primer 1 -------- ------- Primer 2 --------- ------- Primer 3 ------- ------ Primer 4 --------- (380 bp) (352 bp) (540 bp) (420 bp) 500 bp BVTV - Sè 5/2018 Kết quả nghiên cứu khoa học 62 Để khắc phục hiện tượng này, cũng nhằm lựa chọn các cặp mồi có tính đặc hiệu cho vi-rút PYMoV. Cả 4 cặp mồi trên được sử dụng trong phản ứng One-Step RT-PCR. Việc này dựa trên nguyên lý bộ gene của vi-rút được hình thành từ quá trình phiên mã ngược từ RNA sang cDNA và do đó chỉ có mẫu nhi m vi-rút mới tạo ra sản phẩm PCR như mong đợi. Hình 2. Kết quả giám định PYMoV bằng One- Step RT-PCR trên mẫu lá hồ tiêu thu tại Việt Nam (B); H: đối chứng cây khỏe. M: 100bp marker (Thermo Scientific); 380, 352, 540 và 420 là kích thƣớc mong đợi của các sản phẩm PCR tƣơng ứng với các cặp mồi đã sử dụng ở bảng 1 Từ kết quả thu được sau khi sử dụng 4 cặp mồi để chẩn đoán PYMoV bằng kỹ thuật PCR (hình 1) và One-Step RT-PCR (hình 2) đã cho thấy cả 4 cặp mồi này đều cho sản phẩm sắc nét với kích thước tương ứng với kích thước đã thiết kế. Cả 4 cặp mồi này đều không cho phản ứng “dương tính giả“ trên mẫu đối chứng cây khỏe, cả ở phản ứng PCR và RT-PCR. Từ kết quả này, đề xuất sử dụng cả 4 cặp mồi trên (bảng 1) trong việc giám định PYMoV trên mẫu lá cây hồ tiêu nhi m bệnh bằng kỹ thuật PCR hoặc RT-PCR. Tuy nhiên, chi phí cho kỹ thuật PCR luôn rẻ tiền hơn, độ nhạy cao hơn sẽ là sự lựa chọn hợp lý. Trong nghiên cứu của Nguy n Xuân Dũng và Dương Hoa Xô (2017), phản ứng PCR sử dụng đối chứng âm là “nước cất” là không chính xác, sẽ không kiểm chứng được khả năng dương tính giả của các cặp mồi đã sử dụng bởi đặc tính “endogenous” của PYMoV (Deeshma et al. 2017). 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Các qui trình tách chiết DNA tổng số và RNA tổng số trên mẫu lá hồ tiêu đã đem lại chất lượng DNA và RNA tốt, cho kết quả rõ nét ở các phản ứng PCR và RT-PCR. - Việc sử dụng đồng thời cả 4 cặp mồi PYMoV-1F/R, PYMoV-2F/R, PYMoV-3F/R và PYMoV-4F/R đã cho kết quả dương tính rõ nét trên mẫu đối chứng dương thu tại Ấn Độ và mẫu nhi m bệnh thu tại Bình Phước (Việt Nam) nhưng âm tính trên mẫu đối chứng âm khi sử dụng kỹ thuật PCR và One-Step RT-PCR. 4.2 Đề nghị - Có thể sử dụng 4 cặp mồi nêu trong bảng 1 để giám định vi-rút gây bệnh khảm vàng trên hồ tiêu (PYMoV). - Cần giải trình tự hoàn chỉnh bộ gene PYMoV của Việt Nam và phân tích các đặc điểm phân tử căn bản cũng như so sánh mức độ đa dạng với isolate của Ấn Độ và các nước khác đã có trên GenBank. Từ đó, xác định các cặp mồi mới đặc hiệu cho các isolate của Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tạ Hoàng Anh, Ngô Vĩnh Vi n, Nguy n Tuấn Anh, Nguy n Thu Huyền, Nguy n Văn Chung và Nguy n Doãn Phương, 2009. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật one-step RT-PCR chẩn đoán nhanh vi-rút gây bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá hại lúa. Tạp chí Bảo vệ thực vật, 5: 21-26. 2. Nguy n Xuân Dũng và Dương Hoa Xô, 2017. Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán Piper yellow mottle virus gây hại hồ tiêu (Piper nigrum L.) ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 6: 59-63. 3. Bhat, A. I., Devasahayam, S., Venugopal, M. N. and Suseela Bhai, R., 2005. Distribution and incidence of viral diseases of black pepper in Karnataka and Kerala, India. J. Plantation Crops, 33: 59-64. 4. Bhat A. I., Devasahayam S., Sarma Y. R. and Pant R. P. 2003. Association of a badnavirus in black pepper (Piper nigrum L.) transmitted by mealybug (Ferrisia virgata) in India. Current Science, 84(12): 1547-1550. 5. Bhat A.I. and Siju S. 2007. Development of a single tube multiplex RT-PCR for the simultaneous detection of Cucumber mosaic virus and Piper yellow mottle virus associated with stunt disease of black pepper. Current Science 93: 973-976. 6. Duarte M. L. R., Albuquerque F. C. and Chu E. Y., 2001. New diseases affecting black pepper crop in Brazil. Int. Pepper Bull., pp. 51–57. M A H A H A H A H ---Primer-1--- ---Primer-4--- ---Primer-3--- ---Primer-2--- (340 bp) (420 bp) (540 bp) (352 bp) 500 bp