Nghiên cứu và phát triển các giống đậu tương biến đổi gen sử dụng các gen kháng sâu có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

, cry1Ab, cry2Ab2, cry2Ae, cry1C, cry1F, vip3Aa, cry1A, CpTI (cowpea trypsin inhibitor) Khoai tây (Solanum tuberosum) 30 cry3a Đậu tương (Glycine max) 4 cry1Ac, cry1Ab2, cry1F Lúa (Oryza sativa) 3 cry1Ac, cry1Ab Bạch dương (Populus sp.) 2 cry1Ac, API (arrowhead protease inhibitor) Cà tím (Solanum melongena) 1 cry1Ac Cà chua (Lycopersicon esculentum) 1 cry1Ac Tổng cộng 191 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG GEN MÃ HÓA PROTEIN ĐỘC TỐ ĐỂ TẠO CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG KHÁNG SÂU Phương pháp phát hiện và phân lập gen mã hóa các protein độc tố từ vi khuẩn B. thuringiensis Có nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để phân lập các gen mã hóa cho độc tố mới từ Bt. Phương pháp PCR được Carozzi và đồng tác giả (1991) sử dụng đầu tiên để dự đoán hoạt tính diệt côn trùng của các chủng Bt chưa được nghiên cứu trước đây. Tiếp theo sau là các phương pháp cải biến dựa trên PCR như lai PCR (Kalman et al., 1993), PCR-RFLP (Kuo, Chak, 1996), E-PCR (Juarez-Perez et al., 1997) và PCR-SSCP (Lin et al., 2007). Việc xây dựng các thư viện DNA của Bt trong E. coli và sàng lọc bằng phương pháp lai Western (Schnepf, Whiteley, 1981; McLinden et al., 1985), phương pháp dựa vào lai khác (Masson et al., 1992; Lee, Gill, 1997; Balasubramanian et al., 2002; Kongsuwan et al., 2005), hoặc phát triển thư viện DNA trong chủng Bt đột biến không hình thành tinh thể Cry và quan sát dưới kính hiển vi cũng đã được sử dụng để phát hiện các gen cry mới. Tuy nhiên, các phương pháp dựa trên PCR được sử dụng phổ biến để phân lập các gen cry mới. Các mồi nhân gen được thiết kế chủ yếu dựa vào các trình tự bảo thủ được công bố bởi Höfte và Whiteley (1989). Mặc dù vậy, phương pháp này tồn tại nhiều hạn chế như khó tìm được gen cry mới (gen có ít hơn 45% trình tự amino acid tương đồng với gen cry đã biết) và khó thu nhận được trình tự hoàn chỉnh của gen Lê Thị Thu Hiền et al. 10 cry. Thành công trong việc giải trình tự hệ gen người năm 2003 đã mở ra một giai đoạn phát triển mới trong nghiên cứu về khoa học sự sống, kỷ nguyên hậu genome hay kỷ nguyên omics với nhiều kỹ thuật mới được phát triển và ứng dụng. Một trong những kỹ thuật được phát triển rất mạnh là kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) cho phép giải trình tự hệ gen hiệu quả và nhanh hơn rất nhiều so với kỹ thuật trước đây. Với các tiến bộ về thiết bị và hóa chất, hiện nay giải trình tự hệ gen của một cơ thể sống có thể được thực hiện tại các phòng thí nghiệm được cấp kinh phí vừa phải với thiết bị đọc trình tự thế hệ mới như solid, solexa, ion-proton, 454, trong thời gian ngắn (có thể chỉ trong 24h) và giá thành rẻ. Trình tự hệ gen vi khuẩn hay virus có thể được xác định dễ dàng với các thiết bị có công suất nhỏ khoảng 6-10 Gb. NGS là một công cụ mạnh nhất để phát hiện được các tác nhân gây bệnh, các đột biến với tỷ lệ thấp. Chính vì vậy, giải trình tự gen thế hệ mới là công cụ không thể thiếu trong phát hiện và định lượng các đột biến trong ung thư, bệnh di truyền Do có tác động rất lớn đến sản xuất nông nghiệp cũng như tính đa dạng cao về gen của từng chủng Bt nên các nghiên cứu về hệ gen của chúng trên thế giới rất được quan tâm. Các gen mới có hoạt tính kháng sâu mạnh hơn và phổ diệt sâu rộng hơn được phát hiện và tính đa dạng gen của các chủng được xác định. Việc sử dụng kỹ thuật PCR đã cho phép phân lập số lượng lớn các gen Bt diệt côn trùng đặc hiệu. Đến nay, công nghệ NGS mới cho phép sàng lọc nhanh, nhiều, hiệu quả, với chi phí thấp các protein diệt sâu Bt. Trong các năm qua, nhiều trình tự hệ gen của các chủng Bt đã được công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế GenBank. Năm 2015, Li và đồng tác giả đã công bố trình tự hệ gen của chủng B. thuringiensis HD521. Chủng này vừa có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh bạc lá (Rhizoctonia solani AG1 IB) và vừa có thể hình thành các tinh thể độc tố Bt hình lưỡng tháp gồm ba gen cry7 diệt ấu trùng sâu Henosepilachna vigintioctomaculata (Bộ cánh cứng). Hệ gen của HD521 có 1 nhiễm sắc thể 5.429.688 bp (tỷ lệ G + C của các nhiễm sắc thể là 35,28%) và 6 plasmid: pBTHD521-1, pBTHD521-2, pBTHD521-3, pBTHD521-4, pBTHD521-5 và pBTHD521-6 (GenBank: CP010106, CP010107, CP010108, CP010109, CP010110, CP010111, CP010112), trong đó với chiều dài gen mã hóa protein độc tố là 4.544.493 bp. Plasmid pBTHD521-5 chứa 3 gen cry7, có thể hình thành các tinh thể độc tố hình lưỡng tháp. Trong số 3323 các gen dự đoán, 25 là gen chức năng COG chung. Palma và đồng tác giả (2014) đã giải trình tự hệ gen của 2 chủng Bt sử dụng hệ thống Illumina thế hệ mới. Chủng Hu4-2, diệt nhiều loài côn trùng cánh phấn và một số loài muỗi, mang gen cry1Ia và cry9Ea mã hóa 2 tinh thể độc tố diệt côn trùng và một gen mã hóa protein diệt côn trùng Vip (vip3Ca2). Chủng Leapi01 chứa các gen mã hóa cho 7 protein Cry (cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry2Ab, cry9Ea và hai biến thể gen cry1Ia) và một gen vip3 (vip3Aa10). Một gen dài 1.143 bp dự đoán là gen độc tố mới đã được tìm thấy trong cả hai chủng. Protein dự đoán có 57% tương đồng với protein 72 của chủng Bt đã cấp bằng sáng chế (US8318900) và 100% tương ứng với 41,9 kDa độc tố diệt côn trùng từ vi khuẩn B. cereus. Độc tố 41,9 kDa được biểu hiện trong E. coli và được biết chống lại bốn loài bướm (Mamestra brassicae, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda và S. littoralis) và rệp hại đào Myzus persicae ở liều khoảng 4,8 mg/mL và 1,5 mg/mL và không gây tử vong hoặc triệu chứng ảnh hưởng đến các côn trùng thử nghiệm (Porcar, Caballero, 2000). Điều này cho thấy những protein gây độc đặc hiệu chỉ với côn trùng đích. Sheppard và đồng tác giả (2013) đã công bố trình tự hệ gen của chủng Bt subsp. 407 Cry diệt côn trùng bộ Cánh vảy. Hệ gen của chủng này bao gồm 1 nhiễm sắc thể 5,5 Mb (GenBank: CP003889) và 9 plasmid: BTB_2p, BTB_5p, BTB_6p, BTB_7p, BTB_8p, BTB_9p, BTB_15p, BTB_78p, và BTB_502p (GenBank: từ CP003890 - CP003898); kích thước plasmid từ 2.062 bp đến 501.911 bp. BTB_502p là plasmid lớn nhất của B. thuringiensis 407 Cry theo các công bố cho đến nay và là hoàn toàn Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 1-21, 2020 11 mới, với các tìm kiếm trên ngân hàng gen cho thấy 95% khác biệt với trình tự các plasmid đã được công bố. Tỷ lệ G + C của nhiễm sắc thể là 35,4% và của plasmid từ 29,7% đến 35,7%. Tổng số gen dự đoán là 6.635 trong đó 5.714 gen nằm trên nhiễm sắc thể và 921 gen trên plasmid. Năm 2013, Liu và đồng tác giả đã xác định trình tự hệ gen của chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki HD73 diệt côn trùng cánh vẩy. Hệ gen của chủng Bt HD-73 chứa 8 replicons, trong đó có một nhiễm sắc thể và 7 plasmid (GenBank: CP004069 (nhiễm sắc thể), CP004070 (pHT73), CP004071 (pHT77), CP004073 (pHT11), CP004074 (pHT8_1), CP004075 (pHT8_2) và CP004076 (pHT7)). Nhiễm sắc thể dài 5,6 Mb với tỉ lệ GC 31,4%, chứa 5.892 gen, 104 tRNA và 36 operon rRNA. Chiều dài 7 plasmid là từ 8 - 77 kb, với tỉ lệ GC từ 29,73% - 34,66%, mang 235 ORFs. Năm 2011, He và đồng tác giả đã công bố trình tự hệ gen của chủng thuộc dưới loài B. thuringiensis subsp. chinensis CT-43 (GenBank: CP001907.1 - CP001917.1) có độc tính cao đối với côn trùng bộ cánh vẩy và Hai cánh (Helicoverpa armigera, Plutella xylostella, Musca domestica, Meloidogyne incognita). Chủng này có thể tạo thành các protein tinh thể độc tố khác nhau bao gồm Cry1Aa3, Cry1Ba1, Cry1Ia14, Cry2Aa9, và Cry2Ab1 và tạo ra protein độc tố Vip3Aa10 trong quá trình lên men. Phân tích trình tự trên máy Genome Sequencer FLX (454) đã xác định được bộ gen của chủng B. thuringiensis CT-43 dài 6,15 Mb, chứa 11 replicons, một nhiễm sắc thể (5.486.830 bp) mã hóa 5.596 dự đoán khung đọc mở (ORFs), trong đó có 5.489 chuỗi mã hóa (CDS), 10 plasmid (có kích thước từ 6.880 đến 281.231 bp và được đặt tên là pCT6880, pCT8252, pCT8513, pCT9547, pCT14, pCT51, pCT72, pCT83, pCT127 và pCT281 theo kích thước) và mang tổng cộng 737 ORFs. Tỷ lệ G + C của nhiễm sắc thể là 35,38%, plasmid là từ 30,79% đến 34,97%. Plasmid pCT281 chứa bốn gen gây độc là cry1Aa3 (CT43_P281270), cry1Ia14 (CT43_P281271), cry2Aa9 (CT43_P281278), cry2Ab1 (CT43_P281265) và một gen vip3Aa10 (CT43_P281262). Những gen độc tố này nằm gần nhau và tạo thành một vùng tác nhân gây độc tố lớn. Plasmid pCT127 chứa gen cry1Ba1 (CT43_P127021) và một cụm gen cho quá trình sinh tổng hợp từ CT43_P127037 đến CT43_P127041. Số liệu đến năm 2019 cho thấy đã có 52 hệ gen của B. thuringiensis được giải trình tự toàn bộ ( /486?). Phổ diệt sâu hại đậu tương của các gen Bt mã hóa protein độc tố kháng sâu Tùy điều kiện địa lý, khí hậu mà sâu hại đậu tương ở mỗi một nước có đặc trưng về loài và mức độ phá hoại riêng. Vùng Đông Nam nước Mỹ, đậu tương bị phá hại bởi 4 loài sâu chính: sâu đo Pseudoplusia includens, sâu xanh Helicoverpa zea, sâu đục thân Elasmopalpus lignosellus, sâu ăn lá Anticarsia gemmatalis (Walker et al., 2000). Vùng Đông và Đông Nam châu Á, đậu tương bị tấn công bởi nhiều loài sâu chính: H. armigera, Spodoptera litura, S. exigua phá hại lá giai đoạn đầu vụ; rệp Bemisia tabaci, Megalurothrips usitatus và Edwardsiana avescens chích hút lá; sâu cuốn lá Omiodes indicata gây hỏng lá nghiêm trọng; và sâu đục quả E. zinckenella, Maruca vitrata phá hại nghiêm trọng năng suất đậu vào cuối vụ (Srinivasan et al., 2009). Ở Việt Nam, theo thống kê thì có 3 nhóm sâu chính: sâu Bộ Cánh vẩy (Sâu đục quả E. zinckenella, M. vitrata; sâu ăn lá hoa: sâu xanh H. armigera, sâu xanh da láng S. exigua, sâu khoang S. litura, sâu cuốn lá Omiodes indicata), sâu bộ Hai cánh (dòi đục gốc Ophiomyia phaseoli, dòi đục thân Melanagromyza sojae) và bộ Cánh nửa (rệp Aphis craccivora Koch, Aphis glycines Matsumura). Theo thống kê kết quả công bố trên thế giới, các gen độc tố từ vi khuẩn Bt diệt các loại sâu hại đậu tương tập trung chủ yếu ở các nhóm gen cry1, cry2 và vip. Các gen có phổ diệt sâu khá rộng (Bảng 2): gen cry1Ab có thể diệt được các loài sâu Cánh vẩy M. vitrata, S. exigua; gen cry1Ac có thể diệt các loài E. zinckenella, S. exigua, S. litura, Omiodes indicata, H. armigera, Lê Thị Thu Hiền et al. 12 H. zea, Pseudoplusia includens; gen vip3C có thể diệt S. litura, H. armigera ... (Estruch et al., 1996; Strizhov et al., 1997; Walker et al., 2000; Ibargutxi et al., 2008; Hernández et al., 2008; Onstad et al., 2012; Palma et al., 2012; Rodrigues-Silva et al., 2019). Bảng 2. Phổ diệt sâu hại đậu tương của một số gen kháng sâu Bt. Côn trùng Tên khoa học Bộ Gen Bt Sâu đục quả Etiella zinckenella Cánh vẩy cry1Ac Maruca vitrata Cánh vẩy cry1Ab Sâu xanh da láng Spodoptera exigua Cánh vẩy cry1Ab, cry1Ac, cry1Ca, cry1Da, cry1Fa, cry1C, vip3A Sâu khoang Spodoptera litura Cánh vẩy cry1Ac, cry1C, vip3C Sâu cuốn lá đậu Omiodes indicata Cánh vẩy cry1Ac, cry1Fa Sâu xanh Helicoverpa armigera Cánh vẩy cry1Ac, cry1Fa, cry2Ab, vip3A, vip3C Helicoverpa zea Cánh vẩy cry1Ac Sâu đo Pseudoplusia includens Cánh vẩy cry1Ac Sâu đục thân Epinotia aporema Cánh vẩy cry1Ac Elasmopalpus lignosellus Cánh vẩy cry1Ab, cry1Ac, cry1F, cry9C Rệp đậu Aphis craccivora Cánh nửa cry4Aa, cry11Aa, B. thuringiensis subsp. kurstaki Aphis glycines Cánh nửa cyt2Aa Ruồi (dòi) đục thân Melanagromyza sojae Hai cánh B. thuringiensis subsp. kurstaki Ruồi (dòi) đục gốc Ophiomyia phaseoli Hai cánh cry2Ab Protein Bt có hoạt tính mới thông qua biến đổi di truyền Ngoài những protein gốc phân lập trực tiếp từ Bt, những protein Cry mới có thể được tạo ra thông qua kỹ thuật di truyền dựa trên những protein dạng dại. Những protein mới dạng này được biết sẽ tăng cường khả năng kháng của cây và ngăn ngừa tính kháng với các protein Cry của côn trùng, vì chúng có thể mang nhiều vị trí gắn với các thụ thể khác nhau trong ruột của côn trùng. Tuy nhiên, việc thiết kế hợp lý các protein Cry mới đòi hỏi kiến thức đầy đủ về trình tự gen, cấu trúc và cơ chế hoạt động của các protein Cry. Protein Cry hoạt động trong ruột côn trùng đích theo hai bước: trước hết gắn với các thụ thể, tiếp theo là gắn và tích hợp với màng tế bào ruột và hình thành lỗ rò. Điểm mấu chốt của độc tính không chỉ nằm ở vị trí gắn, mà còn bao gồm khả năng gắn kết chặt vào màng, hình thành lỗ gắn liền với độc tính. Domain I liên quan đến sự hình thành của các kênh ion trong màng ruột của côn trùng đích, trong đó domain II tham gia liên kết đặc hiệu với các thụ thể và domain III chịu trách nhiệm điều chỉnh hoạt động của kênh ion (Schnepf et al., 1998). Một vài gốc amino acid có tính quyết định đến việc hình thành tinh thể của protein Cry. Điển hình như Tyrosine 268 chuỗi xoắn a7 của Cry3A được biết có vai trò quan trọng trong giữ cấu trúc đặc thù của chuỗi xoắn a7, cần thiết cho việc ổn định và tinh thể hóa (Park, Federici, 2004). Vì Cry có trình tự domain III và I tương đối giống nhau giữa các protein, nên các protein Cry khác nhau có thể có cấu trúc xoắn gập tương tự. Những khác Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 1-21, 2020 13 biệt đáng kể trong trình tự các các protein là ở domain II, domain gắn thụ thể, chịu trách nhiệm cho hoạt động đặc hiệu của protein Cry. Việc hoán đổi giữa các domain và đột biến trong vùng này có thể tạo ra protein có độc tính mới với phổ diệt côn trùng rộng hơn hoặc độc tính cao hơn; hay có thể thiết kế một loại độc tố mang domain đặc hiệu cho côn trùng đích và domain hình thành lỗ rò hiệu quả hơn. Việc khác nhau về trình tự giữa các độc tố vi khuẩn có cùng kiểu hoạt động là kết quả của sự tái tổ hợp giữa các gen này trong tự nhiên (deMaagd et al., 2003). Thêm vào đó, việc xác định các epitope liên quan đến tương tác protein Cry và thụ thể sẽ cung cấp cơ sở phân tử của tính đặc hiệu côn trùng, đồng thời cho phép thiết kế các độc tố mới có khả năng diệt côn trùng kháng với độc tố dạng dại. Ngoài ra, protein Cry có độc tính thay đổi có thể được tạo ra bằng cách trao đổi trình tự các gen cry khác nhau. Phần lớn sự đa dạng của gen cry tự nhiên có thể là kết quả đa dạng trình tự do việc trao đổi các domain thông qua tái tổ hợp giữa các trình tự tương đồng (deMaagd et al., 2003). Dựa vào điều này, các gen cry đa domain đã được thiết kế bằng cách trao đổi giữa các domain đặc trưng loài, tạo ra các domain có tính đặc hiệu từ các gen cry khác nhau để mở rộng hoạt tính kháng sâu của các chủng Bt. Việc phân tích chức năng của các protein lai sẽ cung cấp thông tin hữu ích về tương tác giữa các domain chức năng của các độc tố này. Kết hợp các domain độc tính của cry1Ab từ subsp B. thuringiensis subsp. aizawai và cry1Ac từ B. thuringiensis subsp. entomocidus, đã tạo ra một gen lai có độc tính của cả hai gen. Hoạt tính của protein Cry trong Pseudomonas fluorescens đã được cải thiện bằng cách sử dụng các gen tái tổ hợp có chứa một phần đáng kể của vùng C của cry1Ab (Thompson et al., 1995). Gen cry tái tổ hợp mới bao gồm miền độc tính của gen cry3Aa đối với sâu bộ Cánh cứng Leptinotarsa texana và vùng C của cry1Ac tạo ra protein Cry tái tổ hợp có kích thức 140 kDa trong E. coli (Carmona, Ibarra, 1999). Phiên bản tổng hợp của Cry tái tổ hợp mới có hiệu quả cao chống lại S. litura và H. armigera trong thuốc lá chuyển gen và diệt 100% S. litura. Nghiên cứu thay thế vùng xoắn a7 của protein Cry1Ac với đoạn độc tố bạch hầu B sử dụng đột biến hướng đích đã tạo ra các độc tố đột biến có khả năng diệt H. armigera cao hơn so với Cry1Ac (Chandra et al., 1999). Một hướng tiếp cận khác trong việc tạo ra protein Bt có hoạt tính mới là phân tích chức năng của các protein. Thật vậy, bằng cách trao đổi các vùng mã hóa cho domain I hoặc domain III của các protein Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1C và Cry1E cho thấy tầm quan trọng của domain III của độc tố Cry1Ab trong việc tạo ra độc tính mạnh hơn của độc tố Cry1C (Rang et al., 1999). Protein Cry mang domain I và II của một vài độc tố Cry1 kết hợp với domain III của Cry1Ca cho thấy hoạt tính tăng cường diệt S. exigua (deMaagd et al., 2000). Tuy nhiên, có những trao đổi như giữa các vùng của domain I của gen cry1 có thể gây mất độc tính (Rang et al., 1999). Thay đổi trình tự amino acid tại những vị trí chủ chốt có chức năng gắn với các epitope của thụ thể có thể thu được các protein độc tố mới. Đồng thời, bằng cách loại bỏ các vị trí cắt không có hoạt lực trong khi vẫn giữ các vị trí cần thiết để tạo ra quá trình xuyên sâu vào màng cũng có khả năng tăng cường độc tính của protein Cry. Nghiên cứu tạo giống đậu tương kháng sâu Việc ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra cây đậu tương biến đổi gen, mang gen kháng côn trùng có nguồn gốc từ Bt góp phần tăng năng suất, hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, tạo điều kiện canh tác an toàn bền vững. Những thập kỷ đầu tiên của công nghệ tạo cây trồng biến đổi gen đã khẳng định hiệu quả và sự cần thiết của công nghệ đối với an ninh lương thực và bảo vệ môi trường. Trong số các cây trồng biến đổi gen, đậu tương luôn chiếm vị trí cao nhất về diện tích, với 50% tổng diện tích cây trồng biến đổi gen toàn cầu vào năm 2017 (ISAAA, 2017). Mặc dù vậy, các giống đậu tương biến đổi gen có khả năng kháng sâu chưa nhiều mà tập trung chủ yếu vào tính trạng kháng thuốc diệt cỏ. Thực tế cho thấy trong 94,1 triệu ha trồng đậu tương biến đổi Lê Thị Thu Hiền et al. 14 gen, có 69,7 triệu ha trồng đậu tương có khả năng kháng thuốc diệt cỏ và chỉ có 24,4 triệu ha dành cho đậu tương có tính trạng kết hợp kháng sâu và kháng thuốc diệt cỏ. Đậu tương có tính trạng kết hợp này đã được triển khai thành công ở Argentina, Paraguay và Uruguay. Ở Brazil, từ năm 2013 đến 2017, chính phủ đã phê duyệt 11 sự kiện đậu tương công nghệ sinh học được phép sử dụng cho thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và canh tác, trong đó có 2 sự kiện đậu tương có tính trạng kết hợp kháng sâu (bộ Cánh vẩy) và kháng thuốc diệt cỏ (glyphosate) (ISAAA, 2017). Về đặc điểm kháng sâu của đậu tương, hiện nay chỉ có hai công ty sản xuất giống cây trồng biến đổi gen là Monsanto và Dow AgroSciences tạo ra giống đậu tương có tính kháng sâu đặc hiệu được phép canh tác trên thế giới. Cụ thể là sự kiện chuyển gen đậu tương Bt MON 87701 × MON 89788 (Monsanto) có tên thương mại Intacta™ Roundup Ready™ 2 Pro nhắm mục tiêu hiệu quả vào một số các loài sâu bướm nhung Anticarsia gemmatalis Hübner [Lepidoptera: Erebidae] và Chrysodeixis includens Walker [Lepidoptera: Noctuidae] (Bernardi et al., 2012) nhờ có chứa gen mã hóa protein tổng hợp TIC 107, gần giống với protein Cry1Ac tự nhiên (Macrae et al., 2005). Sự kiện MON 87751 ở đậu tương mang hai gen Bt giống như ngô chuyển gen kháng sâu MON89034 là gen tái tổ hợp cry1A.105 và gen cry2Ab2, được cấp phép canh tác vào năm 2016. Tiếp nối sự phát triển của hai giống đậu tương trên, Công ty Monsanto đã chọn lọc sự kiện MON 87751 × MON 87701 × MON 87708 × MON 89788 mang tất cả các gen Bt của các giống đậu tương thành phần, và được 2 quốc gia là Đài Loan và Hàn Quốc cho phép canh tác (Bengyella et al., 2018). Tương tự, sự kiện đậu tương biến đổi gen DAS-81419-2 (Dow AgroSciences) đã được phát triển thông qua phương pháp sử dụng Agrobacterium để biểu hiện các protein Cry1Ac, Cry1F và phosphinothricin acetyltransferase (PAT) có nguồn gốc tương ứng từ B. thuringiensis subsp. kurstaki, B. thuringiensis subsp. aizawai và Streptomyces viridochromogenes. Sự kiện DAS-81419-2 kết hợp hai protein Bt trong đậu tương giúp cho các nhà sản xuất nông nghiệp Nam Mỹ được bảo vệ khỏi thiệt hại do một số loài sâu hại bộ Cánh vẩy chính (Marques et al., 2017). Bên cạnh đó, một số quốc gia phát triển cũng đẩy mạnh các nghiên cứu sử dụng độc tố Bt mới để chọn tạo giống đậu tương có khả năng kháng nhiều loài sâu khác nhau. Qin và đồng tác giả (2019) tiến hành chuyển gen cry8 có nguồn gốc từ chủng Bt HBF-18 vào giống đậu tương Jinong 28 giúp cây kháng được sâu Holotrichia parallela [Coleoptera: Scarabaeoidae]. Nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen là lĩnh vực được quan tâm nghiên cứu ở Việt Nam. Tạo giống cây trồng biến đổi gen đòi hỏi có sự đầu tư cao, sự gắn kết chặt chẽ của nhiều lĩnh vực công nghệ cao như: công nghệ tế bào, sinh học phân tử... Trước năm 2000, lực lượng nghiên cứu chủ yếu là một số cán bộ khoa học ở các viện nghiên cứu, trường đại học có tham gia vào các dự án hợp tác quốc tế tạo cây trồng biến đổi gen và hầu như chưa có các nghiên cứu cũng như chưa chuẩn bị một cách có hệ thống cho việc tạo giống cây trồng biến đổi gen như: nguồn gen để tạo giống cây trồng, nhân lực khoa học công nghệ, trang thiết bị, kỹ thuật. Chỉ đến sau năm 2000, một vài đề tài nghiên cứu đầu tiên về tạo giống cây trồng biến đổi gen đã được triển khai thực hiện trong Chương trình Công nghệ sinh học quốc gia KC04, Chương trình Giống cây trồng, vật nuôi do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quản lý. Mặc dù nghiên cứu tuyển chọn, sàng lọc và chọn giống truyền thống trên thế giới cho thấy đã thành công trong việc tạo ra các dòng đậu tương kháng sâu nhưng ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đi theo hướng này. Cho đến nay, hầu hết các giống đậu tương kháng sâu trên thế giới được tạo ra thông qua con đường chuyển gen. Ở Việt Nam, nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương đã được thực hiện thành công ở nhiều trung tâm, viện nghiên cứu như Viện Di truyền nông nghiệp (Nguyễn Văn Đồng et al., 2013a, b), Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, Viện Công nghệ sinh học. Tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen kháng sâu mới chỉ được triển khai tại Viện Di truyền nông nghiệp (Nguyễn Văn Đồng et al., 2010a, b) và Viện Lúa đồng bằng Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 1-21, 2020 15 sông Cửu Long (Trần Thị Cúc Hoà et al., 2013). Các đề tài nghiên cứu liên quan đến phân lập và cải biến gen có nguồn gốc từ Bt, thiết kế vector biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật (Lê Thị Thu Hiền et al., 2002a, b; Lê Thị Minh Thành et al., 2005, 2008, 2009, 2011, 2012a, b; Ngô Đình Bính et al., 2008, 2010; Trần Thị Ngọc Diệp et al., 2010). Bên cạnh đó, các đề tài cũng tập trung vào việc chuyển các gen cry1Ac, cry2Aa, cry4A và vip3A vào giống đậu tương nhập nội Williams 82, Maverick và giống đậu tương Việt Nam MTĐ176 (Nguyễn Văn Đồng et al., 2010a, b; Trần Thị Cúc Hoà et al., 2013). Việc phân lập các gen từ vi sinh vật bản địa (Bt) và thiết kế vector biểu hiện được các gen kháng hiệu quả một số loài sâu đục quả gây hại chính góp phần tạo giống đậu tương biến đổi gen có năng suất cao, chất lượng tốt, kháng sâu có thể áp dụng được cho sản xuất, góp phần đáp ứng nhu cầu thực tiễn, đồng thời giảm ảnh hưởng của việc sử dụng thuốc trừ sâu đến môi trường và sức khỏe con người. KẾT LUẬN Việt Nam được công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, vì thế việc khai thác nghiên cứu sàng lọc và lựa chọn các chủng Bt bản địa mang các gen đặc hiệu diệt côn trùng đích có ý nghĩa khoa học và triển vọng ứng dụng thực tiễn. Việc phân lập, tách chiết các gen kháng sâu từ các vi sinh vật bản địa và thiết kế tổng hợp các gen kháng sâu mới trên cơ sở các kết quả nghiên cứu ở trong nước và quốc tế là khởi đầu quan trọng, cho phép Việt Nam chủ động tạo được các giống đậu tương biến đổi gen kháng sâu đặc hiệu có tiềm năng thương mại, đóng góp cho sự phát triển nông thôn dựa trên nền tảng các công nghệ hiện đại. Lời cảm ơn: Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài "Nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương kháng sâu" (2017- 2020) thuộc chương trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdullah M, Sarnthoy O, Isichaiku S, Tantakom S (2001) Efficacy of cypermethrin, neem extract and Bacillus thuringiensis for controlling insect pests of vegetables soybean. TH2005000374. Asano S, Yamashita C, Iizuka T, Takeuchi K, Yamanaka S, Cerf D, Yamamoto T (2003) A strain of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae containing a novel cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea (Coleoptera: Scarabaeidae). Biol Control 28: 191- 196. Balasubramanian P, Jayakumar R, Shambharkar P, Unnamalai N, Pandian SK, Kumaraswami NS, Ilangovan R, Sekar V (2002) Cloning and characterization of the crystal protein-encoding gene of Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis. Appl Environ Microbiol 68: 408-411. Baoua I, Ba NM, Agunbiade TA, Margam V, Binso- Dabiré CL, Antoine S, Pittendrigh BR (2011) Potential use of Sesbania pachycarpa (Fabaceae: Papilionoideae) as a refugia for the legume pod borer Maruca vitrata (Lepidoptera: Crambidae). Int J Trop Insect Sci 31: 212-218. Barton K, Whitely H, Yang NS (1987) Bacillus thuringiensis δ-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to Lepidopteran insects. Plant Physiol 85: 1103-1109. Bengyella L, Yekwa EL, Iftikhar S, Nawaz K, Jose RC, Fonmboh DJ, Tambo E, Roy P (2018). Global challenges faced by engineered Bacillus thuringiensis Cry genes in soybean (Glycine max L.) in the twenty-first century. 3 Biotech 8(11): 464. Bernardi O, Malvestiti GS, Dourado PM, Oliveira WS, Martinelli S, Berger GU (2012) Assessment of the high-dose concept and level of control provided by MON 87701 × MON 89788 soybean against Anticarsia gemmatalis and Pseudoplusia includens (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. Pest Manag Sci 68: 1083-1091. Betz F, Hammond B, Fuchs R (2000) Safety and advantages of Bacillus thuringiensis protected plants to control insect pests. Regul Toxicol Pharmacol 32: 156-173. Bravo A, Gill SS, Soberón M (2007) Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and Lê Thị Thu Hiền et al. 16 their potential for insect control. Toxicon 49: 423- 435. Carlson CR, Caugant DA and Kolsto AB (1994) Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains. Appl Environ Microbiol 60: 1719-1725. Carlson CR, Kolsto AB (1993) A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome. J Bacteriol 175: 1053-1060. Carmona AA, Ibarra JE (1999) Expression and crystallization of a Cry3Aa–Cry1Ac chimerical protein of Bacillus thuringiensis. World J Microbiol Biotechnol 15: 455-463. Carozzi NB, Kramer VC, Warren GW, Evola S and Koziel M (1991) Prediction of insecticidal activity Bacillus thuringiensis strain by polymerase chain reaction product profiles. Appl Environ Microbiol 57: 353-356. Crickmore N, Zeigler DR, Schnepf E, van Rie J, Lereclus D, Baum J, Bravo A, Dean DH (2013) Bacillus thuringiensis toxin nomenclature. sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/. Chandra A, Ghosh P, Mandaokar AD, Bera AK, Sharma RP, Das S, Kumar PA (1999) Amino acid substitution in alphahelix 7 of Cry1Ac deltaendotoxin of Bacillus thuringiensis leads to enhanced toxicity to Helicoverpa armigera Hubner. FEBS Lett. 458(2): 1759. Cục Chăn nuôi (2013) de Maagd RA, WeemenHendriks M, Stiekema W, Bosch D (2000) Domain III substitution in Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C domain III can function as a specific determinant for Spodoptera exigua in different, but not all, Cry1-Cry1C hybrids. Appl Environ Microbiol 66: 1559-1563. de Maagd RA, WeemenHendriks M, Molthoff JW, Naimov S (2003) Activity of wildtype and hybrid Bacillus thuringiensis delta-endotoxins against Agrotis ipsilon. Arch Microbiol 179(5): 363- 367. Estruch JJ, Warren GW, Mullins MA, Nye GJ, Craig JA, Koziel MG (1996) Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proc Natl Acad Sci USA 93: 5389-5394. Fernandes AP, Bueno AF, Sosa-gómez DR (2015) Helicoverpa armigera: current status and future perspectives in Brazil. Curr Agric Sci Technol 21(1): 1-7. Fitt GP (1989) The ecology of Heliothis in relation to agroecosystems. Annu Rev Entomol 34: 17-52. Ge AZ, Rivers D, Milne R, Dean DH (1991) Functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins: refinement of Heliothis virescens and Trichoplusiani specificity domains on Cry1A(c). J Biol Chem 266: 17954-17958. Grochulski P, Masson L, Borisova S, PusztaiCarey M, Schwartz JL, Brousseau R, and Cygler M (1995) Bacillus thuringiensis CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation. J Mol Biol 254: 447-464. He J, Wang J, Yin W, Shao X, Zheng H, Li B, Zhao Y, Sun M, Wang S, Yu Z (2011) Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis subsp. chinensis strain CT-43. J Bacteriol 193(13): 3407-3408. Hernández M P, Ferré J, Escriche B (2008) Susceptibility of Spodoptera exigua to 9 toxins from Bacillus thuringiensis. J Invertebr Pathol 97(3): 245- 250. Höfte H, Whiteley HR (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol Rev 53: 242-255. Huỳnh Thị Thu Huệ, Trần Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải (2008) Thiết kế vector và kiểm tra biểu hiện của gen cryIA(c) trên lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(4): 453-458. https://apps.fas.usda.gov/psdonline/circulars/productio n.pdf Ibargutxi MA, Muñoz D, Ruiz de Escudero I, Caballero P (2008) Interactions between Cry1Ac, Cry2Ab, and Cry1Fa Bacillus thuringiensis toxins in the cotton pests Helicoverpa armigera (Hübner) and Earias insulana (Boisduval). Biol Control 47: 89-96. ISAAA (2014) Global status of commercialized biotech/GM crops in 2014. ISAAA Brief No. 49. ISAAA: Ithaca, NY ISAAA (2017) Global status of commercialized biotech/GM crops in 2017: Biotech crop adoption Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 1-21, 2020 17 surges as economic benefits accumulate in 22 years. ISAAA Brief No. 53. ISAAA: Ithaca, NY. ISAAA (2018) Global status of commercialized biotech/GM crops in 2018. ISAAA Brief No. 54. ISAAA: Ithaca, NY Juarez-Perez VM, Ferrandis MD, Frutos R (1997) PCR-based approach for detection of novel Bacillus thuringiensis cry genes. Appl Environ Microbiol 63: 2997-3002. Kalman S, Kiehne KL, Libs JL, Yamamoto T (1993) Cloning of a novel cryIC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae. Appl Environ Microbiol 59: 1131-1137. Karel AK (1993) Effects of intercropping with maize on the incidence and damage caused by pod borers of common beans. Environ Entomol 22: 1076-1083. Knowles BH, Dow JAT (1993) The crystal d- endotoxin gene of Bacillus thuringiensis: modes of action on the insect gut. BioEssays 15: 469-476. Kongsuwan K, Gough J, Kemp D, McDevitt A, Akhurst R (2005) Characterization of a new Bacillus thuringiensis endotoxin, Cry47Aa, from strains that are toxic to the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina. FEMS Microbiol Lett 252: 127-136. Kumar S, Chandra A, Pandey KC (2008) Bacillus thuringiensis (Bt) transgenic crop: an environment friendly insectpest management strategy. J Environ Biol 29(5): 64-153. Kuo WS, Chak KF (1996) Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA. Appl Environ Microbiol 62: 1369-1377. Le Thi Minh Thanh, Nguyen Thi Hue, Ngo Dinh Binh, Tran Duy Quy (2012a) Expression and purification of Cry8Da recombinant protein against Coleopteran insects of Bacillus thuringiensis in E. coli. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50 (3): 309- 318. Le Thi Minh Thanh, Pham Kieu Thuy, Asano Shinichiro, Hori Hidetaka, Donald Dean and Ngo Dinh Binh (2009) Characterization of cry8Da genes isolated fromBacillus thuringiensisstrains in Viet Nam. Proceedings of the 3rd International Meeting for Deverlopment of IPM in Asia and Africa, Published by the University of Lampung Press, Indonesia 3: 186-192. Le Thi Minh Thanh, Pham Kieu Thuy, Nguyen Anh Nguyet, Ngo Thi Tuyet Nhung, Nguyen Dinh Tuan, Ngo Dinh Binh (2008) Cloning and sequencing of gene encoding Cry8Da protein of Bacillus thuringiensis subp. galleriae strains isolated from sugar cane farming soil in Vietnam. Proceedings of the 3rd International Meeting for Deverlopment of IPM in Asia and Africa, Science and Technics Publishing House, Vietnam, 2: 165-174. Le Thi Minh Thanh, Tran Quoc Trong, Tran Duy Quy, Ngo Dinh Binh (2011) Construction of Tiplasmid vectơ containing cry8Da gene against Coleopteran insects from Bacillus thuringiensis strains isolated in Vietnamto transfer into plant. Proceedings of the 4rd International Meeting for Deverlopment of IPM in Asia and Africa. Published by IPM Lab of Bangladesh Agricultural University, Mymensingh, Bangladesh 4: 87-91. Le Thi Thu Hien, Lam Dai Nhan, Kieu Huu Anh, Nong Van Hai, Le Tran Binh (2002c) Construction of Agrobacterium tumefaciens strains carrying Bt pesticidal genes. Advances in Natural Sciences 3(2): 175-180. Lee HK, Gill SS (1997) Molecular cloning and characterization of a novel mosquitocidal protein gene from Bacillus thuringiensis subsp. fukuokaensis. Appl Environ Microbiol 63: 4664-4670. Lee MK, Walters FS, Hart H, Palekar N, Chen JS (2003) The mode of action of the Bacillus thuringiensis Vegetative Insecticidal Protein Vip3A differs from that of Cry1Ab {delta}Endotoxin. Appl Environ Microbiol 69: 4648-4657. Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngô Đình Bính (2005) Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ. Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, 4: 29-34. Lê Thị Minh Thành, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Trần Duy Quý, Ngô Đình Bính (2012b) Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng côn trùng bộ Cánh cứng cry8Da bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 188(5): 15-19. Lê Thị Thu Hiền, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2002a) Thiết kế vector mang gen độc tố cryIA(c) dưới sự điều khiển của đoạn khởi động Lê Thị Thu Hiền et al. 18 của gien tổng hợp đường phân lập từ giống lúa C71. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 40: 135-141. Lê Thị Thu Hiền, Trịnh Công Sự, Trần Thị Phương Liên, Phạm Bích Ngọc, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2002b) Thiết kế vector và biểu hiện gen mã hóa protein độc tố cryIA(c) có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis bằng vi khuẩn Escherichia coli. Tạp chí Sinh học 24(3): 39-46. Li J, Carroll J, Ellar DJ (1991) Crystal structure of insectidal d-endotoxin from Bacillus thuringiensis. Nature 25: 353-815. Li Q, Xu LZ, Zou T, Ai P, Huang GH, Li P, Zheng AP (2015) Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis strain HD521. Stand Genomic Sci 10: 62. Lin Y, Fang G, Peng K (2007) Characterization of the highly variable cry gene regions of Bacillus thuringiensis strain ly4a3 by PCR-SSCP profiling and sequencing. Biotechnol Lett 29: 247-251. Liu G, Song L, Shu C, Wang P, Deng C, Peng Q, Lereclus D, Wang X, Huang D, Zhang J, Song F (2013) Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD73. Genome Announc 1(2): e0008013. Macrae TC, Baur ME, Boethel DJ, Fitzpatrick BJ, Gao AG, Gamundi JC (2005) Laboratory and field evaluations of transgenic soybean exhibiting high- dose expression of a synthetic Bacillus thuringiensis cry1A gene for control of Lepidoptera. J Econ Entomol 98: 577-587. Marques LH, Santos AC, Castro BA, Moscardini VF, Rossetto J, Silva OAN (2017) Field evaluation of soybean transgenic event DAS-81419-2 expressing Cry1F and Cry1Ac proteins for the control of secondary lepidopteran pests in Brazil. Crop Prot 96: 109-115. Masson L, Moar WJ, van Frankenhuyzen K, Bosse M, Brousseau R (1992) Insecticidal properties of a crystal protein gene product isolated from Bacillus thuringiensis subsp. kenyae. Appl Environ Microbiol 58: 642-646. McLinden JH, Sabourin JR, Clark BD, Gensler DR, Workman WE, Dean DH (1985) Cloning and expression of an insecticidal k-73 type crystal protein gene from Bacillus thuringiensis var. kurstaki into Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 50: 623-628. Ngo Dinh Binh, Nguyen Dinh Tuan, Trinh Thi Thu Ha, Le Thi Minh Thanh, Vu Thi Nhung, Nguyen Thi Anh Nguyet, Pham Kieu Thuy, Ohba Michio, Bando Hisanori, Hori Hidetaka (2008) Screening, evaluation and exploiting of insecticidal genes of Bacillus thuringiensis of Vietnam. Proceedings of the 3rd International Meeting for Deverlopment of IPM in Asia and Africa, Science and Technics Publishing House, Vietnam, 2: 347-353. Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến (2010) 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis tại Việt Nam. Hội nghị Khoa Học kỷ niệm 35 năm thành lập Việt Khoa Học và Công nghệ Việt Nam 1975 – 2010, Nhà xuất bản Khoa Học tự nhiên và Công nghệ: 288-300. Nguyen Thi Hoa, Tang Thi Chinh, Dang Thi Mai Anh, Ngo Dinh Binh, Le Thi Minh Thanh (2014) Optimization of fermentation medium compositions from dewatered wastewater sludge of beer manufactory for Bacilus thuringiensis delta endotoxin production. AJAF 2(5): 219-225. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ (2013a) Phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen liên quan đến khả năng chịu hạn GmMyb ở đậu tương. Tạp chí Khoa học và Công nghệ nông nghiệp Việt Nam 2(41): 49- 54. Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Nguyễn Hữu Kiên, Dương Tuấn Bảo (2013b) Nghiên cứu biến nạp gen liên quan đến khả năng kháng hạn và thuốc trừ cỏ vào giống đậu tương ĐT22. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (11): 03-09. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạm Kim Nhung, Trịnh Thị Mình Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010a) Kết quả bước đầu trong nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIA(c) vào phôi non các dòng ngô mô hình. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(2): 173-180. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Trần Minh Thu, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Huy Hàm, Lê Thị Thu Hiền (2010b) Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen kháng sâu cryIA(c) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của một số dòng ngô Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam 6(19): 36-41. Oatman ER (1967) An ecological study of the lima- bean pod borer, Etiella zinckenella (Lepidoptera: Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 1-21, 2020 19 Phycitidae), in Southern California. Ann Entomol Soc Am 60(3): 552-555. Oerke EC (2006) Crop losses to pests. J Agric Sci 144(1): 31-43. Onstad DW, Kang J, Ba NM, Dabire C, Pittendrigh BR (2012) Modeling evolution of resistance by Maruca vitrata (Lepidoptera: Crambidae) to transgenic insecticidal cowpea in Africa. Environ Entomol 41(5): 1255-1267. Palma L, Hernández-Rodríguez CS, Maeztu M, Hernández-Martínez P, Ruiz de Escudero I, Escriche B, Muñoz D, Van Rie J, Ferré J, Caballero P (2012) Vip3C, a novel class of Vegetative Insecticidal Proteins from Bacillus thuringiensis. Appl Environ Microbiol 78(19): 716-735. Palma L, Muñoz D, Berry C, Murillo J, Caballero P (2014) Draft genome sequences of two Bacillus thuringiensis strains and characterization of a putative 41.9-kDa insecticidal toxin. Toxins 6: 1490- 1504. Panbangred W, Panjaisee S, Tantimavanich S (2000) Expression of the mosquitocidal cryIVB gene under the control of different promoters in Bacillus sphaericus 2362 and acrystalliferous Bacillus thuringiensis subsp. israelensis c4Q272. World J Microbiol Biotechnol 16: 163-169. Park HW, Federici BA (2004) Effect of specific mutations in helix α7 of domain I on the stability and crystallization of Cry3A in Bacillus thuringiensis. Mol Biotechnol 27(2): 89-100. Permana AD, Johari A, Putra RE, Sastrodihardjo S, Ahmad I (2012) The influence of trichome characters of soybean (Glycine max Merrill) on oviposition preference of soybean pod borer Etiella zinckenella Treitschke (Lepidoptera: Pyralidae) in Indonesia. J Entomol Nematol 4(3): 15-21. Porcar M, Caballero P (2000) Molecular and insecticidal characterization of a Bacillus thuringiensis strain isolated during a natural epizootic. J Appl Microbiol 89(2): 309-316. Qin D, Liu X, Miceli C, Zang Q, Wang P (2019) Soybean plants expressing the Bacillus thuringiensis cry8-like gene show resistance to Holotrichia parallela. BMC Biotechnol 19(1): 66. Rahayu M, Bande LOS, Hasan A, Yuswana A, Rinambo F (2018) Contribution of pod borer pests to soybean crop production (case in Pondidaha, Konawe District, Southeast Sulawesi). IOP Conf. Ser.: Earth Environ Sci 122: 012-039. Rajamohan F, Cotrill JA, Gould F, Dean DH (1996) Role of domain II, loop 2 residues of Bt CryIAb δ- endotoxin in reversible and irreversible binding to Manduca sexta and Heliothis virescens. J Biol Chem 271: 2390-2397. Rang C, Vachon V, de Maagd RA, Villalon M, Schwartz JL, Bosch D, Frutos R, Laprade R (1999) Interaction between functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins. Appl Environ Microbiol 65(7): 2918-2925. Rodrigues-Silva N, Canuto AF, Oliveira DF, Teixeira AF, Santos-Amaya OF, Picanco MC, Pereira EJG (2019) Negative cross-resistance between structurally different Bacillus thuringiensis toxins may favor resistance management of soybean looper in transgenic Bt cultivars. Sci Rep 9: 199. https://doi.org/10.1038/s41598-018-35965-5. Rogers DJ, Brier HB (2010) Pest-damage relationships for Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) on vegetative soybean. Crop Prot 29: 39-46. Ronald BH, Michel A, Eisley JB (2009) Soybean aphid. Agriculture and natural resources factsheet. https://aginsects.osu.edu/sites/aginsects/files/imce/E NT_37_14%20soybean%20aphid.pdf Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum JR, Feitelson J (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev 62: 705-806. Schnepf HE, Whiteley HR (1981) Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 78: 2893-2897. Sharma HC (1998) Bionomics, host plant resistance, and management of the legume pod borer, Maruca vitrata - a review. Crop Prot 17: 373-386. Sharma P, Nain V, Lakhanpal S, Kumar PA (2010) Synergistic activity between Bacillus thuringiensis Cry1Ab and Cry1Ac toxins against maize stem borer (Chilo partellus Swinhoe). Lett Appl Microbiol 51: 42-47. Sheppard AE, Poehlein A, Rosenstiel P, Liesegang H, Schulenburg H (2013) Complete genome Lê Thị Thu Hiền et al. 20 sequence of Bacillus thuringiensis strain 407 Cry-. Genome Announc 1(1): e00158-12. Shirin B, Katharina EL, Jakob L (2003) Genetically modified (GM) crops: molecular and regulatory details. The BATSreport 2003 on genetically modified crops, version 2: 1192. Srinivasan R, Su FC, Huang CC, Lin M, Hsu Y (2009) Integrated pest management in organic vegetable soybean production. Conference on International Research on Food Security, Natural Resource Management and Rural Development. University of Hamburg. Stacke RF, Arnemann JA, Rogers J, Stacke RS, Strahl TT, Perini CR, Dossin MF, Pozebon H, Cavallin LA, Guedes JVC (2018) Damage assessment of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in soybean reproductive stages. Crop Prot 112: 10-17. Strizhov N, Keller M, KonczKálmán Z, Regev A, Sneh B, Schell J, Koncz C, Zilberstein A (1997) Mapping of the entomocidal fragment of Spodopteraspecific Bacillus thuringiensis toxin CryIC. Mol Gen Genet 53(6): 777. Taghizadeh R, Talebi A, Fathipour Y, Khalghani J (2012) Effect of ten soybean cultivars on development and reproduction of lima bean pod borer, Etiella zinckenella (Lepidoptera: Pyralidae) under laboratory conditions. Appl Ent Phytopath 79: 15-28. Tilmon KJ, Hodgson EW, O’Neal ME, Ragsdale (2011) Biology of the Soybean Aphid, Aphis glycines (Hemiptera: Aphididae) in the United States. J Integr Pest Manag 2(2): A1-A7. Thompson IP, Lilley AK, Ellis RJ, Bramwell PA, Bailey MJ (1995) Survival, colonization and dispersal of a genetically modified Pseudomonas fluorescens (SBW25) in the phytosphere of field grown sugar beet. Biotechnology 13: 1493-1497. Traore F, Dabire-Binso CL, Ba NM, Antoine S, Pittendrigh BR (2013) Feeding preferences of the legume pod borer Maruca vitrata (Lepidoptera: Crambidae) larvae and suitability of different flower parts for larval development. Int J Trop Insect Sci 33: 107-113. Trần Thị Cúc Hòa, Nguyễn Trần Hải Bằng, Trần Thanh Hải, Hồ Thị Huỳnh Như, Hà Minh Luân, Nguyễn Quang Vinh, Trần Như Ngọc, Võ Thị Kiều Trang, Đoàn Thị Mến, Phạm Thị Hường, Nguyễn Đức Cương (2013) Nghiên cứu chọn tạo các giống đậu tương chuyển gen kháng ruồi đục thân và sâu đục quả. Hội thảo Quốc gia về Khoa học cây trồng lần thứ nhất, 441-449. Trần Thị Ngọc Diệp, Huỳnh Thị Thu Huệ, Kim Thị Phương Oanh, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải (2010) Modification of vip3A gene to improve its expression in plants. Tạp chí Công nghệ sinh học 8(3): 309-316. Tổng cục thống kê (2018) https://www.gso.gov.vn/ Van Den Berg H, Shepard BM, Nasikin (1998b) Damage incidence by Etiella zinckenella in soybean in East Java, Indonesia. J Integr Pest Manag 44(3): 153-159. Van Den Berg, Shepard BM, Nasikin (1998a) Response of soybean to attack by stemfly Melagagromyza sofiae in farmers’ fields in Indonesia. J Appl Ecol 35: 514-522. Võ Thị Thứ, Nguyễn Thị Hoa, Raj Bhatnagar (2000) Tách dòng và biểu hiện gen mã hoá protein diệt ấu trùng muỗi từ chủng Bacillus thuringiensis israelensis phân lập ở Việt Nam. Hội nghị sinh học quốc gia: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học: Báo cáo khoa học, 167-171. Walker DR, John NA, McPherson RM, Parrott WP, Boerma HR (2000) Field evaluation of soybean engineered with a synthetic cry1Ac transgene for resistance to corn earworm, soybean looper, velvetbean caterpillar (Lepidoptera: Noctuidae), and lesser cornstalk borer (Lepidoptera: Pyralidae). J Econ Entomol 93(3): 613-622. Wolfersberger (1996) Sitedirected mutations in the third domain of Bacillus thuringiensis deltaendotoxin CryIAa affect its ability to increase the permeability of Bombyx mori midgut brush border membrane vesicles. Appl Environ Microbiol 62(1): 279-282. Yamaguchi T, Sahara K, Bando H, Asano (2008) Discovery of a novel Bacillus thuringiensis Cry8D protein and the unique toxicity of the Cry8D class proteins against scarab beetles. J Invertebr Pathol 99(3): 257-262. Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 1-21, 2020 21 RESEARCH AND DEVELOPMENT OF GENETICALLY ENGINEERED SOYBEAN USING INSECT-RESISTANCE GENES DERIVED FROM Bacillus thuringiensis Le Thi Thu Hien1,2, Pham Le Bich Hang1, Nguyen Tuong Van3, Le Thi Minh Thanh3, Dao Thi Hang4, Nguyen Hai Ha1,2, Ha Hong Hanh1, Huynh Thi Thu Hue1,2, Nguyen Nhat Linh1, Nguyen Thi Thanh Hoa1, Dinh Thuy Hang5, Nguyen Van Dong6 1Institute of Genome Research, Vietnam Academy of Science and Technology 2Graduate University of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology 3Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology 4Plant Protection Research Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences 5Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 6Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences SUMMARY Soybean (Glycine max) is one of the crops which have high economic value and serve for food, feed and process of many countries around the world. However, there are many factors affecting the productivity of soybean, of which insect pests and diseases are the most harmful agents. Therefore, an application of biotechnology to transfer insect resistance genes derived from a species of bacteria Bacillus thuringiensis can contribute to increase soybean yield and significantly reducing pesticide use. Currently, there are many insecticidal proteins detected from B. thuringiensis such as Cry, Cyt and Vip with a broad and specific spectrum belonged to several orders Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Homopera, and Nematoda. Numerous studies have been implemented over the world to transfer genes encoding these proteins in combination or modified forms to increase their toxicity. Several events of genetically engineered soybean with stacked traits of insect resistance and herbicide tolerance are commercialized and approved to be cultured in many countries such as MON 87701 × MON 89788 or DAS-81419-2. In Vietnam, studies on genetically engineered soybean with insect resistance trait has been carried out. Moreover, the exploitation, screening and selection of high biodiversity and indigenous B. thuringiensis strains which habors specific genes capable of killing targeted insects and serve as materials for plant transformation are great scientific meaning and potential practical application. This will be an important source of materials to create many soybean cultivars with good ability of insect resistance in order to meet specific needs. Keywords: Bacillus thuringiensis, genetically engineered crop, soybean, insecticidal protein, insect-resistance gene