Nghiên cứu xác định đặc điểm sinh học phân tử vi khuẩn Salmonella phân lập từ mẫu thực phẩm tại Việt Nam

55 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 1 - 2019 NGHIEÂN CÖÙU XAÙC ÑÒNH ÑAËC ÑIEÅM SINH HOÏC PHAÂN TÖÛ VI KHUAÅN SALMONELLA PHAÂN LAÄP TÖØ MAÃU THÖÏC PHAÅM TAÏI VIEÄT NAM Lê Hà Thu1, Đặng Thị Thanh Sơn2, Trương Thị Qúy Dương2, Trương Thị Hương Giang2, Trần Thị Nhật2, Chu Thị Huyền Trang,3, Đào Thu Thảo3, Lê Quang Huấn3 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm sinh học gen đặc trưng (gen InvA và Omp) của Salmonella phân lập được từ thực phẩm (thịt lợn, thịt gà) tại Việt Nam bằng giải trình tự sản phẩm PCR. Kết quả nghiên cứu cho thấy các đoạn gen đã khuếch đại có trình tự nucleotide tương đồng cao (> 99,9 %) so với trình tự nucleotide của các gen tương ứng đã công bố trong Ngân hàng gen quốc tế. Trình tự nucleotide của đoạn gen của các chủng Salmonella phân lập được từ mẫu thực phẩm tại Việt Nam có những vị trị sai khác nhau so với công bố quốc tế, bao gồm 1 vị trí đối với gen Omp và 3 vị trí đối với gen InvA. Từ khóa: Salmonella, gen InvA và Omp, đặc điểm sinh học phân tử. Study on molecular-biological characteristics of Salmonella bacteria isolated from food in Viet Nam Le Ha Thu, Dang Thi Thanh Son, Truong Thi Quy Duong, Truong Thi Huong Giang, Tran Thi Nhat, Chu Thi Huyen Trang, Dao Thu Thao, Le Quang Huan SUMMARY The study was conducted to identify and characterize specific genomes (InvA and Omp genes) of Salmonella that was isolated from food (pork, chicken meat) in Viet Nam by sequencing PCR products. The studied results showed that sequences of the amplified genomes possessed a high homologous nucleotide sequence (>99.9%) compared to the nucleotide sequences of the corresponding genes reported in the GenBank. The nucleotide sequence of Salmonella isolated from food samples in Viet Nam presented two different locations compared to the corresponding sequences in the international publications: 01 different location for the Omp gene and three different locations for the InvA gene. Keywords: Salmonella, InvA and Omp genes, molecular-biological characteristic. 1. Đại học Đà Lạt 2. Viện Thú y 3. Viện Công nghệ Sinh học I. ĐẶT VẤN ĐỀ Salmonella do Daniel E. Salmon (1850 - 1914) phát hiện năm 1885. Năm 1880, Grafhy đã mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và là người đầu tiên phân lập được S. typhi vào năm 1884. Vi khuẩn Salmonella có sức đề kháng cao, sống sót trong nước và canh trùng có thể đến vài tháng, trong phân từ 1-5 tuần, trong nước đá 2 - 3 tháng. Loài vi khuẩn này có thể sống sót ở nhiệt độ 600C từ 20 - 30 phút. Salmonella có ba loại kháng nguyên gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K. Vi khuẩn thương hàn (S. typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn phát triển bên trong tế bào bạch cầu. Cho đến nay đã xác định được 2339 serotype (kiểu huyết thanh) thuộc giống Salmonella. Các serotype này được chia theo hệ thống Koffman–White dựa trên công thức kháng nguyên O (kháng nguyên Somantie) và kháng nguyên tiên mao H (Flagella). Ngoài một số serotype được đặt tên riêng, cụ thể: Enteritidis (S.enteritidis), Typhi (S.typhi), Paratyphi (S.paratyphi), 56 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 1 - 2019 Typhimurium (S.typhimurium). Hầu hết các serotype khác được ký hiệu bằng công thức kháng nguyên. Toàn bộ loài Salmonella đều có khả năng gây bệnh chủ yếu theo đường tiêu hóa. Tùy từng loài, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người, chỉ gây bệnh cho động vật và vừa lây bệnh cho người, vừa lây bệnh cho động vật. Kết quả nghiên cứu từ nhiều công trình khoa học trên thế giới đã khẳng định Salmonella rất phổ biến ô nhiễm trong các loại thực phẩm tươi có nguồn gốc động vật như thịt lợn, thịt gia cầm (Antunesa et al., 2003; Tanaka et al., 2014; Bai et al., 2015). Vì vậy việc phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm là hết sức cần thiết, nhằm ngăn chặn các vụ ngộ độc thực phẩm, đảm bảo sức khỏe cộng đồng. Theo ước tính, có 75% trường hợp ở người mắc phải bệnh do Salmonella là do ăn phải những thức ăn bị nhiễm khuẩn bao gồm thịt lợn và thịt gà (Kent et al., 1981). Thống kê theo thời gian từ 1990- 2000, S. enteritidis, S. typhimurium chiếm khoảng 70% tổng số Salmonella được phân lập trên toàn thế giới (Herikstad, Tauxe, 2002). Tại Hà Lan, từ năm 1996 đến năm 2001, có 13.970 trường hợp bị ngộ độc do Salmonella, trong đó S. enteritidis chiếm tới 43,6%, S. typhimurium chiếm 32%. Kết quả khảo sát của Liên minh châu Âu cũng cho thấy gà và lợn là nguồn lây nhiễm Salmonella sang người ở châu Âu với 42,4%. Tại Đức, khoảng 20% số ca nhiễm bệnh do Salmonella ở người có nguồn gốc lây nhiễm từ lợn. Tính riêng tại Trung Quốc, bệnh do Salmonella là bệnh chính gây tử vong ở người, chiếm tới 75% với khoảng 30 triệu ca mắc (Wu, 2013). Phân tích trình tự toàn bộ hệ gen đã mang lại những hiểu biết mới về phân loại Salmonella. Cây phát sinh loài của S. enterica cho thấy rằng các serovar nằm ở các nhánh sâu, bắt rễ trong cấu trúc liên kết hình ngôi sao (Hình 1). Chiều dài của mỗi nhánh tỷ lệ thuận với số lượng đa hình đơn nucleotide (SNP) và đại diện cho mức độ phân kỳ. Hình 1. Mối quan hệ phát sinh loài S. enterica và S. typhimurium S. enteritidis và S. gallinarum có liên quan chặt chẽ, nhưng chúng thể hiện sự khác biệt đáng kể trong phạm vi chủ và gây bệnh, là phạm vi chủ rộng và chủ thể thích nghi với các loài chim Galliformes, làm nổi bật tiềm năng tiến hóa trong thời gian tương đối ngắn (Thomson, 2008; Langridge, 2015). S. typhimurium nằm trên nhánh xa gốc, tách biệt với các serovar khác, với sự đa dạng hóa ở mức độ di truyền. Công nghệ xác định trình tự gen thế hệ mới (Next-generation-sequencing technologies) là đột phá trong việc giải trình tự gen và nhờ đó có thể xác định được trình tự toàn bộ hệ gen của hàng chục nghìn vi khuẩn gây bệnh. Các biến thể trong bộ gen, SNP, sự chèn và xóa các nucleotide dễ dàng được nhận diện, nhờ đó cho phép phân biệt các chủng đã phân lập ở độ phân giải cao nhất có thể và quan sát sự phát sinh loài trong thời gian ngắn (Bentley và Parkhill, 2015). Các nghiên cứu trước đây đã xác định các gen đích hữu ích (các chỉ dấu di truyền) trong việc xác định Salmonella. Chúng bao gồm gen fimA (Cohen và cộng sự, 1996), hilA (Guo và cộng sự, 2000), invA (Malorny et al., 2003), ttr (Malorny và cộng sự, 2004), và ssaN (Chen và cộng sự, 2010). Các chỉ dấu hiệu khác và các kết hợp chúng đã được phát triển để sử dụng trong RT-PCR (Postollec và cộng sự, 2011), và khuếch đại đẳng nhiệt vòng lặp (Kokkinos và cộng sự, 2014). Choleraesuis Paratyphi C Newport Paratyphi B Java Dublin Enteritidis Gallinarium Heidelberg LT2 Typhimurium D23580 14028 DT2 SL1344 Paratyphi A Typhi Schwarzengrund Weltevreden Agona 57 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 1 - 2019 Ngoài ra, việc xác định các serovar dựa trên biến thể allel trong các gen soma và flagellar cũng đã được tiến hành (Yoshida và cộng sự, 2014), và các xét nghiệm sinh hóa (Salmonella Serogenotyping Assay, Check & Trace Salmonella và xMAP Salmonella serotyping Assay) có khả năng xác định trên 100 serovar Salmonella enterica phổ biến nhất trong một số trường hợp (Yoshida và cộng sự, 2016a; Yoshida và cộng sự, 2016b). Mặc dù các phương pháp nêu trên đã được sử dụng để định tính và bán định lượng, nhưng chỉ sử dụng tối đa kết quả so sánh 100 chủng Salmonella, trong khi đó kết quả nghiên cứu của Laing và cộng sự (2017) đã sử dụng kết quả so sánh của gần 5000 chủng. Nghiên cứu này phân tích toàn bộ hệ gen với các chỉ dấu (marker) dự đoán và xác định được trên 400 chỉ dấu cụ thể cho các loài, cũng như những chỉ dấu khác được dự đoán cho cả hai phân loài và serovar. Để tiếp tục hoàn thiện các phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella trong mẫu thịt lợn/ thịt gà, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: ”Nghiên cứu xác định đặc điểm sinh học phân tử vi khuẩn Salmonella phân lập từ mẫu thực phẩm tại Việt Nam”. Kết quả nghiên cứu đặc điểm gen đặc trưng các chủng Salmonella phân lập từ các địa phương khác nhau tại Việt Nam là bước quan trọng để hoàn thiện quy trình phát hiện nhanh loài vi khuẩn này. II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tách chiết DNA của một số chủng Salmonella phân lập được từ thịt lợn, thịt gà tại một số địa phương - Thiết kế gen mồi (primer) và khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR - Xác định trình tự nucleotide của một số gen đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella ô nhiễm trong thịt lợn/thịt gà tại Việt Nam. III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu và thời gian nghiên cứu - Tổng số 18 chủng Salmonella phân lập được từ thịt lợn/ thịt gà thu thập tại chợ nhỏ lẻ/ lò mổ ở Nghệ An và Hà Nội - Thời gian thực hiện nghiên cứu: Từ tháng 04 - 10/ 2018 - Địa điểm nghiên cứu: Viện Thú y và Viện Công nghệ sinh học. 3.2. Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp tách chiết DNA của vi khuẩn Salmonella: Sử dụng Bộ Kit GeneJET Genomic DNA Purification Kit * Phương pháp PCR khuếch đại gen: PCR được thiết lập với 2,5 µl dung dịch DNA, 5 units GoTaq DNA polymerase (Promega Corp., USA), 1× GoTaq PCR dung dịch đệm (chứa 1,5 mM MgCl 2 ), 0,2 mM PCR hỗn hợp nucleotide (dNTP) (Promega Corp., USA), và 0,6 µM DNA primers và nước cất đủ tới thể tích 50 µl. Mẫu đối chứng âm sử dụng dung dịch PBS thay cho dung dịch DNA. Chu trình nhiệt của PCR cụ thể: Một chu kỳ, 95°C trong 2 phút, sau đó thực hiện 30 chu kỳ phản ứng nhiệt: biến tính (95°C, 30s), bắt cặp (50°C, 30s), kéo dài (72 °C, 45s). Tiếp theo, một chu kỳ: 72°C thời gian 7 min, sau cùng lưu giữ ở 4oC. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng điện di trên gel agarose và sau đó sử dụng QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Ltd, UK). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được sử dụng để xác định trình tự nucleotide. IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tách chiết DNA các chủng Salmonella đại diện phân lập được 18 chủng Salmonella đại diện cho các type huyết thanh phân lập được từ mẫu thịt lợn/thịt gà tại Nghệ An và Hà Nội, bao gồm các serovar S. typhimurium: 2 chủng; S. derby: 2 chủng; S. agona: 3 chủng; S. weltevreden: 1 chủng; S. rissen: 1 chủng; S. london: 4 chủng; S. newport: 1 chủng; S. anatum: 1 chủng; 58 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 1 - 2019 S. bargny: 2 chủng; và 1 chủng chuẩn ATCC S. typhimurium) được tách chiết DNA bằng Bộ Kit GeneJET Genomic DNA Purification Kit. Kết quả được thể hiện tại biểu đồ 1. Biểu đồ 1. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA của các chủng Salmonella phân lập được Kết quả cho thấy tất cả các mẫu được tách chiết đảm bảo nồng độ DNA dùng cho phản ứng PCR. Hệ số pha loãng đạt được tại bước sóng 260/230 của các mẫu từ 1,61 - 2,35, so với hệ số chuẩn từ 1,7- 2,0. Mẫu tách chiết đạt độ tinh sạch cao (biểu đồ 1), không bị tạp nhiễm. 4.2. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR, Realtime-PCR Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình thường quy và sản phẩm PCR được tinh sạch bằng điện di trên gel agarose và sau đó là QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN Ltd, UK). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được sử dụng để xác định trình tự nucleotide. Kết quả PCR và tinh sạch sản phẩm PCR được thể hiện trên hình 2 và bảng 1. Phân tích trình tự toàn bộ hệ gen đã mang lại những hiểu biết mới về phân loại Salmonella. Cây phát sinh loài của S. enterica cho thấy rằng các serovar nằm ở các nhánh sâu bắt rễ trong cấu trúc liên kết hình ngôi sao (hình 2). Chiều dài của mỗi nhánh là tỷ lệ thuận với số lượng đa hình đơn nucleotide (SNP) và đại diện cho mức độ phân kỳ. S. enteritidis và S. gallinarum có liên quan chặt chẽ, nhưng chúng thể hiện sự khác biệt đáng kể trong phạm vi chủ và gây bệnh, là phạm vi chủ rộng và chủ thể thích nghi với các loài chim Galliformes, làm nổi bật tiềm năng tiến hóa trong thời gian tương đối ngắn (Thomson, 2008; Langridge, 2015). S. Typhimurium nằm trên nhánh xa gốc, tách biệt với các serovar khác, với sự đa dạng hóa ở về mức độ di truyền. Công nghệ xác định trình tự gen thế hệ mới (Next- generation-sequencing technologies) là đột phá trong việc giải trình tự gen và nhờ đó có thể xác định được trình tự toàn bộ hệ gen của hàng chục nghìn vi khuẩn gây bệnh. Các biến thể trong bộ gen, SNP, sự chèn và xóa các nucleotide dễ dàng được nhận diện, nhờ đó cho phép phân biệt các chủng đã phân lập ở độ phân giải cao nhất có thể và quan sát sự phát sinh loài trong thời gian ngắn (Bentley và Parkhill, 2015). 59 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 1 - 2019 Hình 2b. Ảnh điện di kiểm tra PCR gen InvA trên gel agarose Hình 2a. Ảnh điện di kiểm tra PCR gen InvA và gen OmP trên gel agarose Bảng 1. Kết quả xác định nồng độ DNA sau khi tinh sạch sản phẩm PCR STT Tên mẫu Tên gen được khuếch đại PCR Nồng độ DNA sau tinh sạch (ng/µl) STT Tên mẫu Tên gen được khuếch đại PCR Nồng độ DNA sau tinh sạch (ng/µl) 1 S6 Omp 4813 1 InS6 Inva 4830 2 S10 Omp 4787 2 InS10 Inva 4868 3 S15 Omp 4768 3 InS15 Inva 4864 4 S27 Omp 4826 4 S27 Inva 4670 5 S50 Omp 4806 5 S50 Inva 4819 6 PS39 Omp 4759 6 PS39 Inva 4790 7 PS41 Omp 4779 7 PS41 Inva 4927 8 PS76 Omp 4767 8 PS76 Inva 4831 9 PS90 Omp 4819 9 PS90 Inva 4752 10 PS161 Omp 4903 10 PS161 Inva 4827 11 PS384 Omp 4829 11 PS384 Inva 4840 12 PS431 Omp 4849 12 PS431 Inva 4845 13 SC1 Omp 4776 13 SC1 Inva 4731 14 SC4 Omp 4813 14 SC4 Inva 4810 15 SC10 Omp 4712 15 SC10 Inva 4710 16 SC28 Omp 4782 16 SC28 Inva 4817 17 SC30 Omp 4847 17 SC30 Inva 4794 18 Styp ATCC Omp 4855 18 STyp Inva 4732 Các nghiên cứu trước đây đã xác định các gen đích hữu ích (các chỉ dấu di truyền) trong việc xác định Salmonella. Chúng bao gồm gen fimA (Cohen và cộng sự, 1996), hilA (Guo và cộng sự, 60 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 1 - 2019 2000), invA (Malorny et al., 2003), ttr (Malorny và cộng sự, 2004; Chen và cộng sự, 2010). Các chỉ dấu hiệu khác và các kết hợp chúng đã được phát triển để sử dụng trong RT-PCR (Postollec và cộng sự, 2011), và khuếch đại đẳng nhiệt vòng lặp (Kokkinos và cộng sự, 2014). Ngoài ra, việc xác định các serovar dựa trên biến thể allel trong các gen soma và flagellar cũng đã được tiến hành (Yoshida và cộng sự, 2014), và các xét nghiệm sinh hóa (Salmonella Serogenotyping Assay, Check & Trace Salmonella và xMAP Salmonella serotyping Assay) có khả năng xác định trên 100 serovar Salmonella enterica phổ biến nhất trong một số trường hợp (Yoshida và cộng sự, 2016a; Yoshida và cộng sự, 2016b). Mặc dù các phương pháp nêu trên đã được sử dụng để định tính và bán định lượng, nhưng chỉ sử dụng tối đa kết quả so sánh 100 chủng Salmonella, trong khi đó kết quả nghiên cứu của Laing và cộng sự (2017) đã sử dụng kết quả so sánh của gần 5000 chủng. Nghiên cứu này phân tích toàn bộ hệ gen với các chỉ dấu (marker) dự đoán và xác định được trên 400 chỉ dấu cụ thể cho các loài, cũng như những chỉ dấu khác được dự đoán cho cả hai phân loài và các serovar. 4.3. Xác định trình tự nucleotide của một số gen đặc trưng của vi khuẩn Salmonella spp ô nhiễm trong thịt lợn/thịt gà tại Việt Nam Gen InvA Gen Omp Kết quả sequence một số mẫu và so sánh với trình tự nucleotide đã công bố trong Ngân hàng gen quốc tế. Kết quả cho thấy các đoạn gen đã khuếch đại có trình tự nucleotide tương đồng cao (> 99,9 %) so với trình tự nucleotide của các gen tương 61 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ 1 - 2019 ứng đã công bố trong Ngân hàng gen quốc tế. Không có sự sai khác giữa gen InvA và Omp giữa các chủng phân lập tại Việt Nam. Tuy nhiên, trình tự nucleotide của các gen đặc trưng cho Salmonella spp. phân lập được tại Việt Nam có những vị trị sai khác: 1 vị trí đối với gen Omp và 3 vị trí đối với gen InvA. V. KẾT LUẬN Sản phẩm DNA đạt nồng độ và độ tinh sạch cần thiết phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Hai cặp mồi được thiết kế để khuếch đại PCR cho 2 gen: InvA và Omp đặc trưng Salmonella có tính đặc hiệu và độ nhạy cao Sản phẩm PCR có độ tinh sạch cao, đảm bảo cho xét nghiệm về xác định trình tự các InvA và Omp Các đoạn gen đã khuếch đại có trình tự nucleotide tương đồng cao (> 99,9 %) với trình tự nucleotide của các gen tương ứng đã công bố trong Ngân hàng gen quốc tế. Trình tự nucleotide của các gen đặc trưng cho Salmonella spp. phân lập được tại Việt Nam có những vị trị sai khác: 1 vị trí đối với gen Omp và 3 vị trí đối với gen InvA. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lunguya O, Lejon V, Phoba M- F, Bertrand S, Vanhoof R, Glupczynski Y, et al. 2013. Antimicrobial resistance in invasive non- typhoid Salmonella from the Democratic Republic of the Congo: Emergence of decreased fluoroquinolone susceptibility and extended-spectrum Beta lactamases. PLoS neglected tropical diseases; 7: e2103. pmid:23516651 2. Majowicz SE, Musto J, Scallan E, Angulo FJ, Kirk M, O’Brien SJ, et al. 2010. The global burden of nontyphoidal Salmonella gastroenteritis. Clinical Infectious Diseases; 50: 882–889. pmid:20158401 3. M’ikanatha NM, Sandt CH, Localio AR, Tewari D, Rankin SC, Whichard JM, et al. 2010. Multidrug-resistant Salmonella isolates from retail chicken meat compared with human clinical isolates. Foodborne pathogens and disease. 7: 929–934 4. Cohen, H., Mechanda, S., and Lin, W. (1996). PCR amplification of the fimA gene sequence of Salmonella typhimurium, a specific method for detection of Salmonella spp. Appl. Environ. Microbiol. 62, 4303–4308. 5. Guo, X., Chen, J., Beuchat, L. R., and Robert, E. (2000). PCR detection of Salmonella enterica serotype montevideo in and on raw tomatoes using primers derived from hilA. Appl. Environ. Microbiol. 66, 5248–5252. doi: 10.1128/AEM.66.12.5248-5252.2000.Updated 6. Kokkinos, P. A., Ziros, P. G., Bellou, M., and Vantarakis, A. (2014). Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for the detection of Salmonella in food. Food Anal. Methods 7, 512–526. doi: 10.1007/s12161- 013-9748-8 7. Laing C.R., Whiteside M.D., and Gannon V.P.J., (2017). Pan-genome Analyses of the Species Salmonella enterica, and Identification of Genomic Markers Predictive for Species, Subspecies, and Serovar. Front. Microbiol. 8:1345. doi: 10.3389/fmicb.2017.01345 8. Langridge GC, Fookes M, Connor TR, Feltwell T, et al., 2015. Patterns of genome evolution that have accompanied host adaptation in Salmonella. Proc Natl Acad Sci USA 112: 863– 868. https://doi.org/10.1073/ pnas.1416707112. 9. McDonald, N. D., Lubin, J. B., Chowdhury, N., and Boyd, E. F. (2016). Host-derived sialic acids are an important nutrient source required for optimal bacterial fitness in vivo. mBio 7:e02237-15. doi: 10.1128/mBio.02237-15 10. Ng, K. M., Ferreyra, J. A., Higginbottom, S. K., Lynch, J. B., Kashyap, P. C., Gopinath, S., et al. (2013). Microbiota-liberated host sugars facilitate postantibiotic expansion of enteric pathogens. Nature 502, 96–99. doi: 10.1038/nature12503 Ngày nhận 24-11-2018 Ngày phản biện 5-12-2018 Ngày đăng 1-1-2019