Nghiên cứu xác định đoạn DNA barcode cho loài hoàng đàn (cupressus tonkinensis) phục vụ giám định loài

Công nghệ sinh học & Giống cây trồng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 3 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐOẠN DNA BARCODE CHO LOÀI HOÀNG ĐÀN (Cupressus tonkinensis) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LOÀI Hà Văn Huân1, Hoàng Minh Trang1, Bùi Thị Mai Hương1 1Trường Đại học Lâm nghiệp TÓM TẮT Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis) là các loài cây được đánh giá là có giá trị kinh tế cao, gỗ tốt, gỗ có mùi hương. Hiện nay các loài này đang bị khai thác khá nhiều. Do đó, loài này đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng. Vì vậy, việc xác định các đoạn DNA barcode cho loài Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis Silba) phục vụ giám định loài là cần thiết. ADN tổng số được phân lập từ lá cây Hoàng đàn. Các đoạn DNA barcode (ITS, rbcL, trnH-psbA and ITS2) được nhân bản từ ADN tổng số của cây Cupressus tonkinensis bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR chỉ ra rằng các băng thu được có kích thước giống với kích thước dự kiến, sau đó sản phẩm PCR được xác định trình tự. Kết quả phân tích trình tự đã chỉ ra, đoạn ITS có 1643 nucleotide, đoạn rbcL có 573 nucleotide, đoạn trnH-psbA có 507 nucleotide và đoạn ITS2 có 349 nucleotide. Các trình tự này sau đó được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI đã tìm ra sự khác biệt với các loài Hoàng đàn khác: đoạn gen ITS tương đồng 94% với loài Cupressus funebris, đoạn gen rbcL tương đồng 97% với loài Cupressus funebris, đoạn gen ITS2 tương đồng 99% với loài Cupressus funebris, đoạn gen TrnH-psbA tương đồng 99% với loài Cupressus funebris. Sau đó, chúng tôi đăng ký trên DNABank.vn với mã số: CCT0001; CCT0002; CCT0003; CCT0004. Sử dụng chỉ thị ITS làm mã vạch ADN để giám định loài Hoàng đàn Cupressus tonkinensis ở Việt Nam. Từ khóa: Giám định loài, Hoàng đàn, mã vạch ADN. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Hoàng đàn có tên khoa học là Cupressus tonkinensis Silba, phân bố hẹp ở các dải núi đá vôi cao chót vót chạy từ Hữu Lũng, Chi Lăng, Văn Quan đến Bắc Sơn (Lạng Sơn), Thạch An (Cao Bằng), Na Hang (Tuyên Quang), nhưng Hoàng đàn tập trung lớn nhất, lượng tinh dầu nhiều nhất là ở vùng núi đá vôi Hữu Lũng (Lạng Sơn). Hoàng đàn là cho gỗ thẳng, có vân gỗ đẹp, chịu mối mọt, gỗ thường sử dụng làm đồ thủ công mỹ nghệ và đồ gỗ cao cấp. Gỗ Hoàng đàn có chứa tinh dầu có mùi thơm đặc trưng, tinh dầu trong gỗ có tác dụng xua đuổi Gián, Chuột, Nhện và chống mối mọt rất hiệu quả. Mang mùi hương gỗ nồng ấm êm dịu giúp giảm căng thẳng, kích thích nhẹ nhàng, giúp sảng khoái, tạo cảm giác bình yên, thư thái, giảm mệt mỏi, giảm căng thẳng thần kinh, giúp tái tạo nâng cao cảm giác hưng phấn (Võ Văn Chi, 2004; Pham Van The, 2013). Và hiện nay các loài này đang bị khai thác khá nhiều, do vậy chúng đang nằm trong danh sách loài thực vật cần được bảo tồn của quốc gia. Hoàng đàn là loài đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996, 2007) và Danh mục Động thực vật rừng nguy cấp quý hiếm nhóm I (nhóm IA) trong nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ nước cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu xác định các đoạn DNA barcode cho loài Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis Silba) phục vụ giám định loài là cần thiết và cấp bách cho việc định danh và bảo tồn loài. Việc ứng dụng các gen mã vạch, xác định các đoạn DNA barcode là một phương pháp định danh, sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu quả cao trong thời gian ngắn, góp phần không nhỏ vào sự định danh và bảo tồn các loài thực vật trên thế giới. Phương pháp xác định các đoạn DNA barcode là một công cụ hữu hiệu bổ trợ cho phương pháp phân loại dựa vào hình thái (Aron J.F. et al., 2008; Kress J.W. et al., 2008). Ở động vật, đoạn DNA barcode được sử dụng cho phần lớn các loài là đoạn gen ở ty thể cytochrome C oxidase (CO1). Ở thực vật, tốc độ tiến hóa của các đoạn gen ty thể không nhanh như ở động vật, do đó đoạn CO1 không được sử dụng. Thay vào đó, một số gen lục lạp như matK, rbcL; gen vùng nhân như ITS, ITS2; vùng xen trnH-psbA, psbK-psbI được sử dụng kết hợp để giám định các loài thực vật (Anders R., 2012; Alvarez I.W.J.F., 2003; Aron J.F., 2008; Chase M.W. et al., 2005; Von Crautlein M.K.H. et al., 2011). Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 4 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành lựa chọn bốn đoạn trình tự ADN để sử dụng làm mã vạch ADN là: ITS, rbcL, trnH-psbA và ITS2. Trong số đó, các đoạn rbcL, trnH-psbA là các đoạn ADN nằm ở hệ gen lục lạp, đoạn ITS, ITS2 nằm ở hệ gen nhân (Chen S.Y.H. et al., 2010; Ford C.S. et al., 2009; Hamilton M.B., 1999). Tuy có vị trí và mức độ phân hóa khác nhau, các đoạn trình tự này đều có tính đặc trưng cao cho loài, có thể đem lại kết quả khả quan nhằm phân loại, giám định và xác định mối quan hệ di truyền, từ đó góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn và phát triển loài Hoàng đàn ở Việt Nam. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất Đối tượng nghiên cứu: loài Hoàng đàn Cupressus tonkinensis Silba ở Lạng Sơn. Vật liệu nghiên cứu: mẫu lá bánh tẻ của cây Hoàng đàn, lấy 3 mẫu lá từ 3 cây khác nhau. Sau khi thu, mẫu được bảo quản trong túi nilon có chứa hạt silica gel hút ẩm, sau đó được bảo quản ở -20oC để tách chiết ADN phục vụ nghiên cứu. Kí hiệu các mẫu Hoàng đàn được lấy theo chữ viết tắt họ và tên khoa học của loài: CCT12.1; CCT12.2; CCT12.3. Mồi được sử dụng để nhân các đoạn trình tự được thiết kế dựa trên các tài liệu đã được công bố. Hóa chất: Kit tách chiết DNA tổng số (Plant DNA Isolation Kit) của hãng Norgen, Canada; Hóa chất cho phản ứng PCR nhân bản các đoạn mã vạch ADN: Master mix của hãng Intron Biotechnology, Hàn Quốc; Kit tinh sạch sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) của Norgen, Canada; Hóa chất cho điện di trên gel Agarose: Agarose, DNA marker, Redsafe 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá của cây Hoàng đàn theo hướng dẫn của Kit (Plant DNA Isolation Kit). Xác định nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch ADN tổng số bằng phương pháp quang phổ kế. Nhân bản đoạn gen ITS, rbcL, trnH-psbA và ITS2 từ các mẫu ADN tổng số bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ), mỗi phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 μl, bao gồm: H2O deion (7 µl), 2x PCR Master mix Solution (10 µl), 10 pmol/µl mồi xuôi (1,0 µl), 10 pmol/µl mồi ngược (1,0 µl) và 50 ng/µl ADN khuôn (1 µl). Chương trình phản ứng PCR: 95oC trong 5 phút; (95oC: 30 giây, 55oC: 30 giây, 72oC: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72oC trong 5 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC. Nhiệt độ gắn mồi các phản ứng khác nhau phụ thuộc và cặp mồi sử dụng. Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Trình tự các cặp mồi ITS (IsP2F: ACGAATTCATGTCCGGTGAAGTGTTCG; IsP2R: TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC); mồi rbcL (rP1F: ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC; rP1R: GTAAAATCAAGTCCACCTCG); mồi trnH-psbA (trnPF1: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC; psbPR1: GTTATGCATGACGTAATGCTC); mồi ITS2 (IsP1F: ATGCGATACTTGGTGTGAAT; IsP1R: TCCTCCGCTTATTGATATGC). Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, quan sát kết quả dưới đèn cực tím (UV) và chụp ảnh bằng hệ thống Dolphin - Doc Image system của hãng Wealtec (Mỹ). Sản phẩm PCR được tinh sạch theo hướng dẫn của kit tinh sạch sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) của Norgen, Canada. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR được gửi cho phòng thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xử lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng như DNAClub, Biohit, Mega6... Trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ADN sau khi xử lý được đăng ký trong ngân hàng cơ sở dữ liệu ADN của Việt Nam (DNABank.vn). Trình tự mã vạch DNA sau xử lý được xử lý trên hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự tương đồng loài Hoàng đàn nghiên cứu so với các loài khác và trên cơ sở đó xây dựng cây phân loại. Công nghệ sinh học & Giống cây trồng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 5 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá cây Hoàng đàn ADN tổng số sau khi được tách chiết từ các mẫu lá cây Hoàng đàn bằng Kit tách chiết của hãng Norgen được pha loãng để xác định nồng độ và độ tinh sạch. Kết quả xác định nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch ADN tổng số cho thấy, dung dịch ADN tổng số có nồng độ dao động từ 3 - 5 µg/µl; Tỷ số OD260nm/OD280nm trong khoảng từ 1,7 - 2,05, kết quả này khẳng định đã tách chiết được ADN với nồng độ cao và đảm bảo độ tinh sạch. Sau đó, chúng tôi tiến hàng điện di để kiểm tra sự nguyên vẹn của sản phẩm. Kết quả điện di cho thấy các băng ADN khá sắc nét, không có sản phẩm phụ, điều này khẳng định ADN tổng số còn nguyên vẹn, ít đứt gãy và sạch. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số đảm bảo yêu cầu kỹ thuật làm khuôn cho nhân bản các đoạn ADN quan tâm bằng kỹ thuật PCR. 3.2. Kết quả nhân bản các đoạn mã vạch ADN bằng kỹ thuật PCR ADN tổng số tách chiết từ các mẫu lá của cây Hoàng đàn được sử dụng làm khuôn để nhân bản các đoạn gen ITS, rbcL, trnH-psbA và ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu. Hình A: Đoạn gen ITS Hình B: Đoạn gen ITS2 Hình C: Đoạn gen rbcL Hình D: Đoạn gen trnH-psbA Hình 1. Kết quả PCR nhân gen các đoạn mã vạch ADN (CCT12.1: Hoàng đàn mẫu 1; CCT12.2: Hoàng đàn mẫu 2; CCT12.3: Hoàng đàn mẫu 3) Phản ứng PCR được lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Kết quả PCR sau khi kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 1) cho thấy, xuất hiện băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước của các đoạn mã vạch ADN dự kiến. Sản phẩm PCR các đoạn mã vạch ADN ở hình 1 cũng cho thấy, không có băng ADN phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn PCR rất đặc hiệu, sau khi tinh sạch có thể sử dụng trực tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide. 3.3. Kết quả xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn mã vạch ADN Kết quả xác định trình tự nucleotide của các sản phẩm PCR, sau khi phân tích cho thấy trình tự nucleotide của mỗi đoạn ADN ở cả 3 lần lặp không có sự khác biệt về trình tự nucleotide của mỗi đoạn ở các lần lặp lại và Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 6 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 các mẫu trong cùng một loài. Trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ITS, rbcL, trnH-psbA và ITS2 đã được đăng ký trong ngân hàng dữ liệu ADN Việt Nam (DNABank.vn), với các mã số (Barcode ID) tương ứng là: rbcL: CCT0001; trnH-psbA: CCT0002; ITS2: CCT0003; ITS: CCT0004. Bảng 1. Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS, gồm 1643 bp (Barcode ID:CCT0004) CCTATCAAGCTCGCACGGCGATTGATGTCGGCAACGCTCACGAGAAGTTCATTGAACCTTATCATTTAGA GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTACCGTAGGTGAACCTGCGGTAGGATCATTGTCGGTTCGAGACCCT GAATCGTGTAGGGGATGGAGCTGGCCTCCTCCCCGCCCCCAAAATCTCGGCGACGTGCGGACACTTGGC CCTGCAGCGATGTGCTGGACGGCCAAGCTACGGGTCCAGCGCCGTCAAGGTGGAGGGTCACATCGAATG CCGTGATCGAAAGCGTGGATTCCCCGCGGGGCGAAGAGACTCGGATGCAAATCTGGATTACGATCGGTG CCTTCGAACGACGTCTGCGTCGGAGCGAGGGGTCCCTGCTCGGTTGTAGTTCAGAGGGGGTCCGGGCCT CGTCCCCCGTTGAGATTTCATGGCCCGGTCGCGTGCGCGGCGCTGTGCCAGGGATCCGTCGTTTCGACGG CGGCAAGTCGGGACTGCCGCAACCCCCCGTTGCCTTGCCCAGGTGTGTTAACTCGTCGCTCGGAGCGTTC TGTGTCTAGGATGGGTGCACTCGCAAGATTTGCGGGGCAGGGGCCCCGTCCGATGACACGGCTCTCCCA TGCGTCGACTCACACCTTTGCGAGGTGATGGGGCGGGGACACACCAGAGCGTTCCTCGTCGCACCCATT GGGTGCTCGGGGTTCGGGATGTGTCAACACCCAACACACGGGGTGCATCGCGCACCTTAGAAAATCCAA AGAATGAAACCGCGAATCCAGCGCCCTTGCGCGGCTCGGGTTCGCCCGAAAAGACAAAAACCTTAACCA AAATTCACGGACTCTTCGGGCAACGGAATATTCTCGGCCTCTCGCCCACGAATGAAAGAATGTTAACCG AAAATGCCGAATACTTTAAGTGGTGAAATTGGCAGAAATCCCCGGGGAAATCCATCCAAGTCCTTTTGA AACGCCAAGTTTGGCGCCCCCGAAGGCCCTCCGGCCCAAAGGGGCCACCGTTCCTGGCTTTGGGGGCGT CCCCCAACTAACAAAAAATTGCCCCCTTCCCCCCAAGCCGAAGGGAAACGGGAAAAAATGGGGCCCTTT CCCCGGTGGTCTCCTCCAAATTTGGGCCCCCGGTTTCCTGTGCTTGTAAATATGTAAGCTCACCTAAATG GTTCCTCTTTCCCTAGATCCTTCGTTCTCCCTGTAACATAAACGCGGTGGTGGGGGCCTCGCCCCTTAAA AGAATGGTTCCCGTTGGTCCGGTGTTGTGGATTTGTGTTGCCCCCCCCCTTGTGAAACGCTTAAAGACCA AGGAGTGTTATACCCGCTGCCCGCGTCATAAGAGAAAAAAACTTTTTTTGTAAATCTTACCTCCGCAGAG TGGGGCTCTCGCTCAACTCGTGGGGGTTGCCACTCTTGTTCCACTCGTCCTCTATAGGTTATGAAGGTGT GGGAGTGACTTTCAGCCGGTTCCTACTTCATAGAGTTCTACCAATGTATGATTATCGCTCGCGTGTATAT GCGCACTCTCCTCAAAAATTTTTATTTTAACGTGAGTTGTTGTAGGATATATAGTATATCACCCTCGTGTG TGTGTTAGATTTTACTATTGTAGAGCACGTGGGTTATGTGGCGCG Các trình tự này sau đó được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác biệt giữa các loài có trình tự tương đồng theo đoạn gen ITS ở loài Hoàng đàn bằng cách sử dụng công cụ BLAST. Một số loài có trình tự gen tương đồng dùng so sánh với loài Hoàng đàn được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện ở hình 2. Hình 2. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ITS tạo bởi NCBI Công nghệ sinh học & Giống cây trồng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 7 Bảng 2. Trình tự nucleotide của đoạn gen rbcL, gồm 573bp (Barcode ID:CCT0001) GCCTCATGCTGCATGCTCGTTACTAAGATTACAGATTGACTTATTATACTCCGGACTAT CAGACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTGC CCCCCGAAGAAGCGGGGGCCGCGGTAGCTGCCGAATCTTCCACTGGTACATGGACCA CTGTTTGGACCGATGGTCTTACCAGTCTTGATCGCTACAAGGGGCGATGCTACGATAT TGAACCCGTTCCTGGAGAAGAAACTCAATTTATTGCCTATGTAGCTTACCCTTTAGAC CTTTTTGAAGAAGGTTCTGTGACTAACCTGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGG ATTCAAAGCCTTGCGGGCTCTACGTCTGGAAGATTTACGAATTCCTCCTGCTTATTCAA AAACTTTTCAAGGACCACCTCATGGTATTCAAGTTGAAAGAGATAAATTAAACAAAT ATGGTCGTCCTTTGTTGGGATGTACTATCAAACCTAAATTGGGTCTATCTGCCAAGAA TTATGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGGATTTTACA Các trình tự này sau đó được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác biệt giữa các loài. Một số loài có trình tự gen tương đồng theo đoạn rbcL dùng so sánh với loài Hoàng đàn được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện ở hình 3. Hình 3. Cây phân loại dựa trình tự trên đoạn vào rbcL tạo bởi NCBI Bảng 3. Trình tự nucleotide của đoạn trnH-psbA, gồm 507 nucleotide (Barcode ID:CCT0002) CGCCCAACTAATTGACAGTCTCTGTCTACGGTCATTCCATTTCAAGAATGGATGGTTCT AAGCCCCGAAAACCAACTAATAATGAAACTATTCTATTATTTAGAATAGTTATTAATT TGTTGCACTTGCAATGCAACTCTCACACAAGTTAGTGACATTGACATTTTTTTTTTTTA ATAGTTTTGTTTTGGGTATTAAAAAAAAGATCTGAGCCAATACTCGCTACAAATTAAT AATTGATATTATGTATCCATGGCTAAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAG TCGCGGGTTCAATTCCGGCTGGATGCACAGTTATAGTTATTGGGCTCTGTTCGCTCGC AATAACTATAAAATTAGACGGAAAAAGCAGTACCAAATTGGCACTGCTTTCTTTTTAG GATTGAAATACACTAACAATCCACCTTGAATAATTAGCCGTTTATAGAATTACC Các trình tự thu được này sau đó được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác biệt giữa các loài. Một số loài có trình tự gen tương đồng theo đoạn trnH-psbA dùng so sánh với loài Hoàng đàn được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện ở hình 4. Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 8 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 Hình 4. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn TrnH-psbA tạo bởi NCBI Bảng 4. Trình tự nucleotide của đoạn ITS2, gồm 349 nucleotide (Barcode ID:CCT0003) AGACGGGGATCTCAGTCTTTGACGCAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCAAGGGCACGT CTGCTTGGGCGTCGCACTACAAAATTGCCCTCCCCAGCGAGGAGCGGAGATGGCCGT CCGTGTCCCCAAGTGGCGCGGTCGGCTGAAATGAGCACGAGGTCCGTCGATCCGTCG CGACGAGCGGTGGCTCCCAAAAGGCCGGCGTTGGTTTGCGCTGATCGAACGATTCCTC GCGAGGAACTTTATTCTGGGTCCAGCGGCCCGCCGCAGTGCGGGCATGCCGCATCTCT ACCGCGTCCCCAAGTCAGGCGTGAATACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGG AGGAA Các trình tự này sau đó cũng được xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác biệt giữa các loài. Một số loài có trình tự gen tương đồng theo đoạn trnH-psbA dùng so sánh với loài Hoàng đàn được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện ở hình 5. Hình 5. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ITS2 tạo bởi NCBI Công nghệ sinh học & Giống cây trồng TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 9 Từ cây phát sinh chủng loại của 4 đoạn gen ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA cho thấy loài Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis) có sự tương đồng cao nhất với cùng một loài Cupressus funebris. Vì vậy Cupressus tonkinensiscó quan hệ họ hàng gần nhất với loài Cupressus funebris. Do đó, chúng tôi lựa chọn loài Cupressus funebris làm tham chiếu so sánh để tìm ra khả năng phân biệt tốt nhất của 4 đoạn gen mà chúng tôi lựa chọn. Dựa vào kết quả so sánh trình tự các đoạn ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA của Cupressus tonkinensis với trình tự gen của loài Cupressus funebris, chúng tôi lập được bảng so sánh khả năng phân biệt của đoạn trình tự ITS, rbcL, ITS2, và trnH-pbsA như ở bảng 5. Bảng 5. Bảng so sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA Tên đoạn gen ITS rbcL ITS2 trnH-psbA Số điểm sai khác 54 17 5 9 Kích thước trình tự 865 548 296 466 Tỷ lệ sai khác 6,2% 3,1% 1,6% 1,9% Từ kết quả phân tích trên cho thấy khi so sánh đoạn trình tự ITS của loài Cupressus tonkinensis với loài Cupressus funebris có 54 điểm sai khác, nhiều hơn 3 đoạn gen còn lại. Tỷ lệ sai khác của đoạn trình tự này cũng cao hơn 3 đoạn còn lại với tỷ lệ 6,2%. Như vậy, đoạn ITS có khả năng phân biệt cao hơn so với đoạn rbcL, ITS2 và trnH-pbsA khi so sánh loài Cupressus tonkinensis với loài Cupressus funebris. THẢO LUẬN Từ kết quả so sánh của 4 chỉ thị cho thấy đoạn ITS là đoạn cho khả năng phân biệt tốt nhất với 54 điểm sai khác, và tỷ lệ sai khác 6,2%. Kết hợp tỷ lệ tương đồng và cây phân loại dựa vào đoạn ITS được xây dựng bởi ngân hàng quốc tế NCBI cho thấy (hình 2): Trong cùng chi Hoàng đàn: loài Cupressus tonkinensis có tỷ lệ tương đồng cao nhất với Cupressus funebris là 94%, với Cupressus chengiana và Cupressus gigantean là 92%, với Cupressus dupreziana là 90%. Hơn nữa, tỷ lệ tương đồng này càng giảm so với các loài thuộc chi khác như: loài Cupressus tonkinensis có tỷ lệ tương đồng thấp nhất với các loài thuộc chi Bách xù Juniperus martinezii, Juniperus flaccid, Juniperus oxycedrus, Juniperus cedrus là 87%. Do vậy, đoạn ITS là đoạn phù hợp để sử dụng là DNA barcode cho loài Hoàng đàn mà chúng tôi nghiên cứu. 4. KẾT LUẬN Đã tách chiết được 3 mẫu ADN tổng số của Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis Silba). Nhân gen thành công các đoạn gen ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA từ ADN tổng số của loài Hoàng đàn bằng kỹ thuật PCR. Kết quả xác định trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ADN cho thấy đoạn gen ITS có kích thước là 1643bp, đoạn rbcL có 573bp, đoạn trnH-psbA có 507 bp và đoạn ITS2 có 349 bp. Trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ITS, rbcL, trnH-psbA và ITS2 đã được đăng ký trong ngân hàng dữ liệu ADN Việt Nam với các mã số (Barcode ID) tương ứng là: rbcL: CCT0001; trnH-psbA: CCT0002; ITS2: CCT0003; ITS: CCT0004. So sánh trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ADN (rbcL, ITS, trnH-psbAvà ITS2) của loài Hoàng đàn với trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch tương ứng của các loài Hoàng đàn khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI đã chỉ ra: đoạn gen ITS tương đồng 94% với loài Cupressus funebris, đoạn gen rbcL tương đồng 97% với loài Cupressus funebris, đoạn gen ITS2 tương đồng 99% với loài Cupressus funebris, đoạn genTrnH-psbA tương đồng 99% với loài Cupressus funebris. Sau đó, so sánh trình tự các đoạn ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA của loài Hoàng đàn nghiên cứu (Cupressus tonkinensis) với loài Cupressus funebris tìm ra được chỉ thị ITS làm mã vạch có khả năng phân biệt cao hơn so với đoạn rbcL, ITS2 và trnH-pbsA. Công nghệ sinh học & Giống cây trồng 10 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anders R. (2012). DNA barcoding as a tool for the identifcation of unknown plant material: A case study on medicinal roots traded in the medina of Marrakech. M.SC thesis, Uppsala University CBOL ABS Brochure. 2. Alvarez I.W.J.F. (2003). Ribosomal ITS sequences and plant phylogenic inference. Molecular phylogentics and Evolution 29: 417-434. 3. Aron J.F, Kevin S.B, Prasad R.K, Kevin S. Burgess, Prasad R. Kesanakurti, Sean W. Graham, Steven G. Newmaster, Brian C. Husband, Diana M. Percy, Mehrdad Hajibabaei, Spencer C. H. Barrett. (2008). Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well. PLoS ONE. 3(7): e2802. 4. Chase M.W, Salamin N., Wilkinson M., Dunwell J.M., Kesanakurthi R.P., Haider N., Savolainen V. (2005). Land plants and DNA barcodes: Short-term and long-term goals. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360:1889-1895. 5. Chen S.Y.H, Han J., Liu C., Song J., shi L., Zhu Y., Ma X., Gao X., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Leon C. (2010). Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcodes for identifying medicinal plant species. Plos one 5: e8613. 6. Ford C.S, Ayres K.L, Toomey N., Haider N., Stahl J.V.A., Kelly L.J., Wikström N., Hollingsworth P.M., Duff R.J., Hoot S.B., Cowan R.S., Chase M.W., Wilkinson M.J. (2009). Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on ADN plants. Botanical Journal of the Linnean Society. 159 (1): 1-11. 7. Hamilton M.B. (1999). Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation. Molecular Ecology 8: 513-525. 8. Kress J.W, Erickson D.L. (2008). DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics. Proc Natl Acad Sci U S A. 105(8):2761-2762 9. Kress J.W, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt L.A, Janzen D.H., (2005). Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23): 8369–74. 10. Pham Van The, Phan Ke Loc, Nguyen Tien Hiep and John Silba. (2013). The Status of Wild and Cultivated Populationsof Cupressus tonkinensis Silba in Vietnam. Bull. CCP 2 (1): 10-16. 11. Von Cräutlein M. Pietiläinen M., Korpelainen H., Rikkinen J. (2011). DNA barcoding: a tool for improved taxon identification and detection of species diversity. Biodiversity and conservation 20: 373-389. 12. Võ Văn Chi (2004). Từ điển thực vật thông dụng, tập 2. NXB Khoa học và Kỹ thuật. STUDY ON IDENTIFICATION OF DNA BARCODE SEQUENCE OFCupressus tonkinensis TO IDENTIFY PLANT SPECIES Ha Van Huan1, Hoang Minh Trang1, Bui Thi Mai Huong1 1Vietnam National University of Forestry SUMMARY Cupressus tonkinensis is a species of high economic value with good wood and fragrant wood. Nowaday, these species are being exploited quite a lot. Therefore, these species are still facing extinction. So, it is necessary to identify DNA barcode fragments of the Cupressus tonkinensis for species identification. The genomic DNA was extracted from leaf tissue of Cupressus tonkinensis. The DNA barcodes (ITS, rbcL, trnH-psbA and ITS2) were amplified from total DNA of Cupressus tonkinensis by PCR technique. The PCR products indicated that all the bands have the size similar to the theoretical size of ITS, rbcL, trnH-psbA and ITS2. Results nucleotide sequencing of PCR product samples showed that the size of the isolated ITS gene fragment is1643 bp, rbcL fragment is 573 bp, trnH-psbA fragment is 507 bp and ITS2 fragment is 349 bp. And then, these sequences were compared with Cupressus funebris in NCBI we found that: ITS gene fragment is similar to 99%, rbcL gene fragment is similar to 100%, ITS2 gene fragment is similar to 98%, TrnH-psbA gene fragment is similar to 99%. The nucleotide sequences of ITS, rbcL, ITS2, TrnH-psbA have been registered on the DNABank.vn with Barcode ID CCT0001; CCT0002; CCT0003 and CCT0004. Recommendation for using ITS molecular marker as DNA barcode to identify Cupressus tonkinensis in Viet Nam. Keywords: Cupressus tonkinensis, DNA barcoding, identify species. Ngày nhận bài : 15/02/2020 Ngày phản biện : 16/3/2020 Ngày quyết định đăng : 23/3/2020