Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella bằng kỹ thuật tiêu cơ

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 145 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG TRICHINELLA BẰNG KỸ THUẬT TIÊU CƠ Nguyễn Tiến Dũng*, Dương Thị Hân* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng và đánh giá quy trình phát hiện Trichinella trong thịt. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng kỹ thuật tiêu cơ bằng pepsin và HCl. Kết quả: Kết quả nghiên cứu cho thấy các yếu tố pH, nhiệt độ, thời gian và nồng độ pepsin trong dịch thủy phân có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thủy phân và khả năng phát hiện Trichinella. Phương pháp phát hiện Trichinella bằng kỹ thuật tiêu cơ đã được xây dựng thành công với các đặc điểm kỹ thuật như sau: tỉ lệ giữa khối lượng mẫu và dịch thủy phân là 1:300; pH của dịch thủy phân là 1,5; nồng độ pepsin trong dịch thủy phân là 6 FIP-U/ml; nhiệt độ cho giai đoạn thủy phân là 35oC, thời gian thủy phân khoảng 25 - 30 phút. Kết quả đánh giá hiệu lực cho thấy phương pháp được xây dựng có giới hạn phát hiện là 2 ấu trùng Trichinella/50g mẫu thịt, độ nhạy là 100%, độ đặc hiệu là 100%, độ chính xác là 94,4%, tỉ lệ dương tính giả là 0%, tỉ lệ âm tính giả là 9,1%. Kết luận: Phương pháp đã xây dựng có các thông số kỹ thuật tương đương với phương pháp của Trung tâm Ký sinh trùng và Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm thuộc Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada với độ tin cậy 95%. Phương pháp này có thể áp dụng tại các phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm. Từ khóa: Ký sinh trùng, pepsin, thịt heo, thủy phân, Trichinella. ABSTRACT RESEARCH METHODS OF DETECTION PARASITES TRICHINELLAWITHDIGESTION OF MEAT Nguyen Tien Dung, Duong Thi Han * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 1 - 2013: 145 - 150 Objective: The objective of this study was developing the method for the detection of Trichinella in pork Methods: Digestion of meat by enzyme pepsin and hydrochloric acid. Results: The study results show that several factors affect to analysis process such as pH, temperature, time, digestive enzyme concentration affect to analysis process. The method for the detection of Trichinella in pork by the digestion principle has been set up successfully. The new method have the specifications as follows: The rate of sample volume/hydrolyte volume is 1:300; pH of hydrolyte is 1.5; pepsin concentration in hydrolyte is 6 FIP- U/ml; temperature for hydrolysis stage is in 35°C, hydrolysis time is in 25 - 30 minutes. The method validation results of the set up method show that the limit of detection are 2 Trichinella larvae/50g, sensitivity is 100%, specificity is 100%, accuracy is 94.1%, false positive rate is 0% and false negative rate is 9.1%. Conclusions: The effectiveness of set up method for detection of Trichinella in pork is equivalent to the reference method from Centre for Food-borne and Animal Parasitology of Canadian Food Inspection Agency. The similarity of the reference method and the set up method is 95% of confidence. This method can be applied at food laboratory to detect Trichinella in meat. * Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4 Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Tiến Dũng, ĐT: 0918044558, Email: dungnt.nafi4@mard.gov.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 146 Keywords: Parasite, pepsine, pork, digestion, Trichinella. ĐẶT VẤN ĐỀ Trichinella là ký sinh trùng gây bệnh cho người và động vật. Bệnh Trichinellosis do Trichinella gây ra còn được gọi là bệnh sán heo đã được ghi nhận ở các động vật nuôi nhưng chúng chiếm tỉ lệ lớn trên heo. Tỉ lệ mắc bệnh này trên toàn thế giới là gần 10.000 người/năm, tỉ lệ tử vong khoảng 0,2%. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thịt heo là nguồn chủ yếu lây truyền bệnh Trichinellosis cho người(3). Tại các nước Châu Âu, Mỹ, Canada và một số nước khác yêu cầu phải kiểm tra Trichinella trong thịt trước khi đưa ra thị trường tiêu thụ hoặc xuất khẩu(2). Tại Việt Nam, các nghiên cứu về Trichinella trên thực phẩm còn rất ít, chưa xây dựng được phương pháp đủ độ nhạy và độ tin cậy để phân tích ký sinh trùng này trong thực phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện Trichinella trong thực phẩm là cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu này nhằm xác định các yêu cầu kỹ thuật để xây dựng phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella trong thịt bằng kỹ thuật tiêu cơ kết hợp khuấy từ. Đánh giá hiệu lực qui trình đã xây dựng để xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp như: giới hạn phát hiện, độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, tỉ lệ âm tính giả, tỉ lệ dương tính giả, đồng thời xác định phạm vi và điều kiện áp dụng của phương pháp. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Dòng ký sinh trùng sử dụng trong nghiên cứu: Dòng Trichinella spiralis được cung cấp bởi Trung tâm Ký sinh trùng động vật và Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm (Centre for Food-borne and Animal Parasitology), thuộc Cơ quan Thanh tra thực phẩm của Canada (Canadian Food Inspection Agency). Ấu trùng T. spiralis được giữ trong mẫu thịt viên. Mẫu sử dụng trong nghiên cứu: là thịt heo tươi. Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu và dịch thủy phân Chuẩn bị dung dịch thủy phân: Dùng HCl 37% để chuẩn bị các dung dịch thủy phân có pH là 1; 1,25; 1,5; 1,75; 2. Làm nóng các dung dịch đến nhiệt độ thủy phân xác định, thêm pepsinvào để được nồng độ pepsin trong các dung dịch thủy phânlà 6; 8; 10 FIP-U/ml. Chuẩn bị mẫu: Lấy 50g mẫu (hoặc một lượng mẫu xác định) cho vào máy xay, xay nhuyễn mẫu trong 5-10 phút, nếu cần thiết có thể cho một ít dịch thủy phân đã chuẩn bị vào mẫu để dễ xay nhuyễn. Thủy phân mẫu Chuyển mẫu đã xay nhuyễn vào cốc thủy tinh có dung tích 3 lít chứa hỗn hợp thủy phân (3.2.1). Rửa sạch lồng và nắp máy bằng dịch thủy phân để lấy toàn bộ phần thịt còn sót lại. Đậy cốc thủy phân bằng giấy nhôm, đặt cốc lên bếp khuấy từ, giữ ở các nhiệt độ khảo sát là: 30±1; 35±1; 40±1; 45±10C, bếp được đặt trong tủ ấm có cùng nhiệt trên, điều chỉnh tốc độ khuấy để đảm bảo dịch thủy phân phải tạo thành một xoáy sâu mà không bị bắn ra ngoài(4). Tiến hành thủy phân trong 30 phút để thịt được thủy phân hoàn toàn. Dịch sau thủy phân được cho qua rây lọc có đường kính lỗ rây là 180µm để vào bình lắng thứ nhất có dung tích 2 lít, rửa rây lọc 2-3 lần bằng nước ấm, toàn bộ dịch rửa cũng được cho vào bình lắng. Quá trình thủy phân đạt yêu cầu nếu hiệu suất thủy phân lớn hơn 95%(2). Lắng mẫu Dịch thủy phân trong bình lắng thứ nhất được để yên trong 30 phút(6). Lấy nhanh khoảng 125ml phần lắng từ bình lắng thứ nhất vào bình lắng thứ hai có thể tích 500ml, thêm nước ấm đến đầy bình. Để yên dịch trong bình lắng thứ hai ít nhất 10 phút(6). Lấy nhanh khoảng 22-27ml phần lắng từ bình lắng thứ hai ra đĩa petri Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 147 đường kính 90mm có chia ô, để yên dịch lắng trong đĩa petri khoảng 10 phút sau đó quan sát và đếm ấu trùng Trichinella. Xác định kết quả Trichinellacủa mẫu dưới kính hiển vi soi nổi Đĩa petri chứa dịch mẫu lắng được kiểm tra bằng kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại 15-20 lần. Ấu trùng Trichinella có thể xuất hiện ở dạng cuộn khi lạnh, di động nhiều hơn khi nóng, hoặc hình chữ C khi chết. Trong một số trường hợp ấu trùng Trichinella vẫn còn nằm trong kén. Trong trường hợp nghi ngờ, ấu trùng phải được quan sát ở độ phóng đại cao hơn. Đánh giá hiệu lực để xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp Chuẩn bị mẫu gây nhiễm: Lấy 5g mẫu chuẩn đã xác định mật độ Trichinella trộn với 45g thịt heo đã được kiểm tra và khẳng định âm tính với ký sinh trùng này. Tiến hành phân tích mẫu theo các bước của quy trình đã xây dựng. Xác định giới hạn phát hiện (Limit of detection - LOD) Mẫu chuẩn bị cho quá trình xác định giới hạn phát hiện có mật độ Trichinella như sau: 1-2; 2-3; 3-4 ấu trùng Trichinella/50g. Chuẩn bị 6 mẫu cho mỗi mật độ gây nhiễm(7). Giá trị LOD được xác định theo hướng dẫn của ISO 16140:2003(7). + Xác định giá trị ước lượng tới hạn (Level criteria - LC)(7): từ kết quả phát hiện Trichinella ở các lần lặp lại với các mật độ gây nhiễm khác nhau như trên, xác định tỷ lệ phát hiện n/6. Giá trị ước lượng tới hạn là mật độ ký sinh trùng trong mẫu mà tại đó cho tỷ lệ phát hiện tương đương 50% (có tỷ lệ phát hiện trong khoảng 2/6 – 4/6). Từ giá trị ước lượng tới hạn (LC), xác định giá trị ngưỡng phát hiện (S0) theo biểu thức sau: S0= LC/1,65. Giá trị LOD (ký sinh trùng/50g mẫu) được tính như sau: 50 3,3 0    m S LOD Trong đó: m là khối lượng mẫu thử nghiệm (m = 50g). Xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp Các thông số khác đã được xác định bao gồm: độ đặc hiệu, độ nhạy, độ chính xác, tỉ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả(1,7). Quá trình xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp được thực hiện theo hướng dẫn tại tiêu chuẩn ISO 16140:2003. Quá trình đánh giá được thực hiện trên 18 mẫu, trong đó có 7 mẫu không gây nhiễm Trichinella, 11 mẫu gây nhiễm với mật độ trung bình là 3 ấu trùng Trichinella/50g mẫu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu xây dựng phương pháp Xác định pH tối ưu cho quá trình thủy phân Khảo sát được tiến hành ở các pH: 1,00; 1,25; 1,50; 1,75; 2,00. Mẫu được thủy phân ở 45±10C trong 30 phút với nồng độ enzym là 10 FIP- U/ml. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần ở mỗi pH khảo sát. Kết quả khảo sát cho thấy khả năng thủy phân của pepsin thay đổi theo pH môi trường: trong khoảng pH 1,00– 1,50 hiệu suất thủy phân đạt yêu cầu đặt ra của quy trình là ≥ 95% và đạt cực đại là 98,50% tại pH 1,5 (Biểu đồ 1), dịch lắng đục đều, đồng nhất, không phân tầng, dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi. Tại pH 1,75 hiệu suất thủy phân đạt yêu cầu đặt ra của quy trình tuy nhiên dịch sau thủy phân còn nhiều mảnh, sợi thịt có kích thước lớn gây khó khăn cho việc phát hiện ấu trùng (Hình 1). Tại pH 2,0 hiệu suất thủy phân thấp hơn hiệu suất yêu cầu của quy trình, dịch thủy phân sau khi lắng phân thành 2 lớp, rất đục không thể quan sát dưới kính hiển vi. Như vậy pH hoạt động tối ưu của pepsin trong khoảng 1,0-1,5. Trong khoảng pH này hầu như không có sự khác biệt về hiệu suất thủy phân của pepsin cũng như không ảnh hưởng đến việc đếm kết quả trong dịch lắng dưới kính hiển vi soi nổi. Do đó để tiết kiệm chi phí, giảm giá thành cho quá trình phân tích, giá trị pH 1,50 được chọn là pH tối ưu để thực hiện phản ứng thủy phân mẫu. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 148 Hình 2. Các dạng ấu trùng Trichinella thu được khi thủy phân với nồng độ pepsin là 6 FIP-U/ml Xác định nồng độ pepsin tối ưu cho giai đoạn thủy phân mẫu Khảo sát được tiến hành ở pH 1,50, mẫu được thủy phân ở 45±20C trong 30 phút, nồng độ enzym trong dịch thủy phân được thay đổi trong khoảng 6-10 FIP-U/ml. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần tại mỗi nồng độ enzym. Kết quả khảo sát cho thấy trong khoảng nồng độ pepsin 6-10 FIP-U/ml hiệu suất thủy phân thay đổi không đáng kể, đạt khoảng 98%. Kết quả quan sát dịch sau lắng dưới kính hiển vi đều rất tốt. Tuy vậy, nghiên cứu này không khảo sát ở các nồng độ pepsin thấp hơn vì: (1) trong quá trình thủy phân, pepsin không chỉ thủy phân cơ thịt của mẫu mà còn thủy phân lớp vỏ nang của ấu trùng. Khả năng thủy phân của pepsin với vỏ nang collagen của ấu trùng thấp hơn so với các protein khác của cơ thịt. Do đó pepsin cần phải có hoạt độ đủ lớn để thủy phân hoàn toàn cơ thịt mẫu và vỏ nang ấu trùng. (2) Khi tiến hành phân tích mẫu chuẩn chứa ấu trùng Trichinella với nồng độ pepsin trong dịch thủy phân dưới 6 FIP-U/ml thì khả năng thủy phân vỏ nang ấu trùng bắt đầu giảm, một số nang ấu trùng chưa bị thủy phân hoàn toàn nên ấu trùng còn nằm trong nang (Hình 2). Do đó nồng độ pepsin được chọn là 6 FIP-U/ml dịch thủy phân. Biểu đồ 2. Sự thay đổi hiệu suất thủy phân theo nồng độ pepsin Xác định nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn thủy phân mẫu Biểu đồ 3. Sự thay đổi hiệu suất thủy phân theo nhiệt độ thủy phân Khảo sát được tiến hành ở pH 1,50; nồng độ pepsin 6 FIP-U/ml, nhiệt độ thủy phân ở các điểm 30, 35, 40, 45oC; thời gian thủy phân 30 Hình 1. Kết quả quan sát dưới kính hiển vi sau lắng tại độ phóng đại 40 lần Mảnh, sợi gân thịt Ấu trùng Trichine Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 149 phút. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần tại mỗi nhiệt độ khảo sát. Kết quả khảo sát cho thấy trong khoảng 35–45oC hiệu suất thủy phân có sự khácbiệt không đáng kể, đạt khoảng 97,8–98,0% (Biểu đồ 3). Trong khoảng nhiệt độ này, hiệu suất thủy phân cũng ổn định khi thử nghiệm với các loại thịt khác nhau. Vì vậy để thuận tiện cho thao tác phân tích và tiết kiệm điện năng gia nhiệt trong quá trình kiểm nghiệm, nhiệt độ tối ưu của quá trình thủy phân được chọn là 350C. Biểu đồ 4. Sự thay đổi hiệu suất thủy phân theo thời gian Xác định thời gian thủy phân tối ưu Khảo sát được tiến hành với dịch thủy phân có pH 1,50, nồng độ pepsin 6 FIP-U/ml, quá trình thủy phân ở 350C trong các khoảng thời gian 15, 20, 25, 30 phút. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần tại mỗi giá trị thời gian khảo sát. Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng thời gian, hiệu suất thủy phân tăng dần (Biểu đồ 4). Sau 20 phút, hiệu suất thủy phân trung bình đạt trên 95%. Nhưng khi tiến hành thủy phân ở 20 phút, sự thủy phân không ổn định đối với các loại mẫu khác nhau, một số mẫu chứa nhiều collagen gân và lipid có hiệu suất thấp hơn so với yêu cầu. Khi tăng thời gian thủy phân lên 25 phút và 30 phút, hiệu suất thủy phân đạt yêu cầu với tất cả các loại mẫu khác nhau. Vì vậy thời gian tốt nhất cho quá trình thủy phân của qui trình phân tích Trichinella được xác định là 25-30 phút. Đề xuất phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella trong thịt bằng kỹ thuật tiêu cơ Trên cơ sở các thông số đã xác định tại 4.1, quy trình phát hiện ký sinh trùng Trichinella trong sản phẩm thịt được thiết lập như sau: 50g mẫu thịt được xay nhuyễn, thủy phân, lắng và đếm kết quả Trichinella được thực hiện như 3.2.1 đến 3.2.4 với các yêu cầu kỹ thuật của quy trình như sau: pH dịch thủy phân là 1,5; nồng độ pepsin trong dịch thủy phân là 6 FIP-U/ml; nhiệt độ thủy phân là 350C; thời gian thủy phân trong khoảng 25 - 30 phút. Đánh giá các thông số kỹ thuật của phương pháp phát hiện Trichinella đã được xây dựng Các thông số được đánh giá là: giới hạn phát hiện, độ chọn lọc, độ đặc hiệu, tỉ lệ dương tính giả, tỉ lệ âm tính giả(1,7). Các thông số này được xác định dựa theo ISO 16140:2003. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp Quá trình xác định giới hạn phát hiện của phương pháp được thực hiện như 3.2.5. Kết quả phân tích các mẫu đã gây nhiễm như Bảng 1. Bảng 1. Kết quả khảo sát để xác định LOD của phương pháp Mẫu Mật độ Trichinella /50g mẫu Số mẫu lặp lại Số lần cho kết quả dương tính Tỉ lệ phát hiện dương tính T1 1 6 3/6 50% T2 2 6 4/6 67% T4 4 6 6/6 100% Từ các kết quả nhận được trên Bảng 1, các giá trị được xác định như sau: Giá trị ước lượng tới hạn của phương pháp LC = 1 ấu trùng/50g mẫu; Giá trị ngưỡng S0 = 0,61; Giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 2 ấu trùng/50g mẫu. Xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp Các thông số kỹ thuật của phương pháp mới xây dựng được xác định trên 18 mẫu, trong đó có 7 mẫu không gây nhiễm Trichinella, 11 mẫu gây nhiễm với mật độ trung bình là 3 ấu trùng Trichinella/50g mẫu. Kết quả đánh giá các thông số được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp Thông số đánh giá Độ nhạy (%) Độ đặc hiệu (%) Độ chính xác (%) Dương tính giả (%) Âm tính giả (%) Kết luận Phươn g pháp tiêu cơ 100 100 94,4 9,1 0 Đạt Yêu cầu ≥ 98,0 ≥ 90,1 ≥ 94,4 ≤ 9,6 ≤ 2,0 Tham chiếu(*) (*Tham chiếu theo MMC-Microbiology Methods Committee, Canada) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 150 Các thông số kỹ thuật của phương pháp tiêu cơ phát hiện Trichinella trong Bảng 2 cho thấy chúng hoàn toàn đáp ứng yêu cầu của phương pháp phân tích tiêu chuẩn. Đồng thời cũng cho thấy có sự tương đồng giữa kết quả phân tích Trichinella bằng phương pháp mới xây dựng và kết quả trên mẫu chuẩn của Trung tâm Ký sinh trùng động vật và Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm, thuộc Cơ quan Thanh tra thực phẩm của Canada. KẾT LUẬN Đã nghiên cứu và xây dựng thành công phương pháp phát hiện ký sinh trùng Trichinella trong thịt bằng kỹ thuật tiêu cơ trên nguyên tắc thủy phân hoàn toàn cơ thịt mẫu bằng enzym pepsin và acid hyhrochloric, dịch sau thủy phân được lắng 2 lần bằng bình lắng và đọc kết quả dưới kính hiển vi soi nổi. Phương pháp được xây dựng có các đặc điểm kỹ thuật như sau: tỉ lệ khối lượng mẫu/dịch thủy phân là 1:300; pH của dịch thủy phân là 1,5; nồng độ pepsin trong dịch thủy phân là 6 FIP-U/ml; nhiệt độ thích hợp cho giai đoạn thủy phân là 35oC, thời gian thủy phân 25-30 phút. Các thông số kỹ thuật của phương pháp mới xây dựng được xác định như sau: giới hạn phát hiện (LOD) là 2 ấu trùng Trichinella/50g mẫu, độ nhạy (Sensitivity - SE) là 100%, độ đặc hiệu (Specificity - SP) là 100%, độ chính xác (Accuracy - AC) là 94,4%, tỉ lệ âm tính giả là 9,1%, tỉ lệ dương tính giả là 0%. Các thông số này cho phép khẳng định phương pháp mới xây dựng đáp ứng yêu cầu để áp dụng tại các phòng kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Community Reference Laboratory for Parasite. Guideline for the detection of Trichinella larvae at the slaughterhouse or connected laboratory in a Quality Assurance System, Istituto Superiore di Sanità, 2006. 2. European Community. Regulation (EC) No 2075/2005 of the European Parliament and of the Council of 5 December 2005 laying down specific rules on official controls for Trichinella in meat, Off. J. EC, L 338, pp. 60-82, 2005. 3. FAO/WHO/OIE. Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of Trichinellosis. World Organisation for Animal Health (OIE), 2007. 4. Forbes L.B. & Gajadhar, A.A. A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat, Journal of Food Protection, Vol. 62, pp. 1308-1313, 1999. 5. Forbes, L. B.,et al. Complete Validation of a Unique Digestion Assay To DetectTrichinella Larvae in Hors e Meat Demonstrates the Reliability of this Assay for Meeting Food Safety and Trade Requirements. Journal of Food Protection, Vol. 71, pp. 558-563, 2008. 6. Gajadhar, A. A., et al. The double separatory funnel technique for the detection of Trichinella larvae in pork, Version 1.0, Official protocol. Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Canada, 1996. 7. ISO 16140:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative method, first edition, 2003.