Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây mía tím Kim Tân

56 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Văn Chi, 2012. Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 1, trang 288. NXB Y học. Phạm Tiến Dũng, 2008. Thiết kế thí nghiệm và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê IRRISTAT. NXB Nông nghiệp. Nguyễn Thị Lan, 2006. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng. NXB Nông nghiệp. Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung bộ - Viện Dược liệu, 2013. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật trồng Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) đạt năng suất, chất lượng cao tạo nguyên liệu làm thuốc tại Thanh Hóa. Viện Dược Liệu, 2003. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1 + 2. NXB Khoa học và kỹ thuật. Study on growing density and fertilizer doses for Solanum hainanense in Phu Tho province Nguyen Huu Thien, Nguyen Thi Hanh, Đinh Thi Thu Trang Abstract The study was carried out in Tam Nong - Phu Tho with the aim of providing the most appropriate density and fertilizer doses for Solanum hainanense cultivated on two main types of local agricultural lands (hilly land and riverside land). The results showed that: Density and fertilizer effected growth, development and yield of S. hainanense in Phu Tho. In particular, S. hainanense grew and developed well and the yield was highest on both types of land when growing with density of 50,000 plants/ha, growing distance of 40 ˟ 50 cm. The most appropriate fertilizer dose for S. hainanense grown on riverside land was 20 tons of Manure + 180 kg N + 150 kg P2O5 + 125 kg K2O, the dried yield reached 4.35 tons/ha. The most suitable fertilizer dose for S. hainanense grown on hilly land was 20 tons of Manure + 220 kg N + 150 kg P2O5 + 125 kg K2O, the dried yield reached 4.03 ton/ha. Keywords: Solanum hainanense, growing density, growing space, fertilizer dose Ngày nhận bài: 28/11/2018 Ngày phản biện: 9/12/2018 Người phản biện: TS. Nguyễn Thế Yên Ngày duyệt đăng: 11/1/2019 1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY MÍA TÍM KIM TÂN Mai Thị Tân1, Vũ Thị Hoài1, Lê Thị Thu Hằng1 TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho cây mía tím Kim Tân từ vật liệu ban đầu là mắt mầm. Môi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi mía tím Kim Tân là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 500 mg/l THT + 7,0 g/l agar cho hệ số nhân cụm chồi là 4,30 cụm chồi/ mẫu/4 tuần và chiều cao trung bình chồi đạt 2,0 cm. Trong khi đó, hệ số nhân chồi đạt cao nhất 8,56 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 7,33 cm sau 4 tuần nuôi cấy trên nền môi trường MS + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar + 500 mg/l THT bổ sung 0,75 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA. Môi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro là nền môi trường có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA cho tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 11,36 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 1,21 cm sau 4 tuần nuôi cấy. Giá thể tiếp nhận cây mía in vitro là đất cho tỷ lệ sống sót của cây là 83,3% sau 2 tuần, cây sinh trưởng khỏe mạnh, bộ lá phát triển tốt. Từ khóa: Mía, quy trình, nhân giống, in vitro I. ĐẶT VẤN ĐỀ Mía tím Kim Tân (Saccharum officinarum) có nguồn gốc từ huyện Thạch Thành - Thanh Hóa, là một giống mía đặc sản nổi tiếng ở vùng đất xứ Thanh. Giống mía này có đặc điểm thân màu tím tròn đều, mềm, ngọt. Với những ưu điểm của nó, giống mía tím Kim Tân được trồng ở nhiều địa phương trên cả nước. Hiện tại, phương pháp nhân giống bằng hom là phương pháp nhân giống chủ yếu cho giống mía tím Kim Tân. Bên cạnh đó giống mía tím Kim Tân được canh tác trong thời gian dài với tình trạng không kiểm soát được nguồn giống ban 57 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 đầu dễ dẫn đến giống bị hỗn tạp, bị nhiễm và lây lan bệnh, cây dễ bị già sinh lý gây thoái hóa giống. Vì vậy, để góp phần bảo tồn, phục tráng giống mía tím Kim Tân phục vụ sản xuất hàng hóa, mang lại hiệu quả kinh tế cao, rất cần sử dụng tiến bộ kỹ thuật trong nhân giống in vitro cho cây mía. Các công trình nghiên cứu đã khẳng định sử dụng phương pháp nhân giống mía bằng in vitro mang lại hiệu quả kinh tế và là phương pháp sử dụng khá phổ biến trong sản xuất mía ở quy mô lớn. Phương pháp này cho phép nhân nhanh, tạo ra một số lượng cây giống lớn trong một thời gian ngắn đặc biệt cây giống có chất lượng tốt, đồng nhất về mặt di truyền, sạch bệnh. Tuy nhiên mỗi giống mía khác nhau có phản ứng với điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau (Mulugeta et al., 2018). Do đó, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho cây mía tím Kim Tân nhằm góp phần tạo cây giống đồng đều có chất lượng cao cho sản xuất là rất cần thiết. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Cây mía tím Kim Tân được lấy tại vườn thí nghiệm thu thập mẫu thuộc xã Thành Trực, huyện Thạch Thành, tỉnh Thanh Hóa. Môi trường nuôi cấy sử dụng là môi trường cơ bản MS. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chọn mẫu mía Thời điểm lấy mẫu mía là khi cây được 8 tháng tuổi, cây mía có nhiều đặc tính như không bị sâu bệnh đổ ngã, ít đốt, lóng mía dài. Lấy khi thời tiết không mưa, khô ráo được ít nhất một tuần, chặt lấy phần trên, cách gốc khoảng 10 lóng. Cắt hết tai lá xung quanh, buộc thành bó dựng ngược xuống để nước không đọng trong bẹ lá. 2.2.2. Phương pháp khử trùng mẫu - Ngoài tủ cấy vô trùng: Lau toàn bộ mẫu bằng cồn 70o, bóc lá già, lau sạch phấn, cắt phần dài của bẹ mía. Lau mẫu bằng nước cất sạch, sau đó lau lại bằng cồn và cho vào tủ cấy. - Trong tủ cấy cấy vô trùng: Dùng tay bóc từng lớp bẹ, khi bóc không được cho tay qua mẫu, bóc hết lớp bẹ bao bọc bên ngoài. Dùng dao cắt mắt 1 ˟ 1 cm và cắt đỉnh sinh trưởng cấy vào môi trường MS + 2 mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar để khởi động tạo vật liệu ban đầu. 2.2.3. Nội dung nghiên cứu - Giai đoạn lựa chọn chồi vào mẫu: mắt ngủ và đỉnh sinh trưởng tái sinh trên môi trường MS + 2 mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar sau khoảng 2 - 3 tuần; các chồi này sẽ trải qua 3 lần cấy chuyển, sau khoảng 2 - 3 tháng chồi hình thành các cụm chồi nhỏ, các cụm chồi này sẽ được sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho giai đoạn nhân nhanh chồi mía in vitro. - Giai đoạn nhân nhanh chồi mía: Chồi mía sau giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu tạo cụm chồi, gồm 2 - 3 chồi đơn nhỏ phát triển tốt được sử dụng làm vật liệu cho các thí nghiệm nhân nhanh. Môi trường thí nghiệm có bổ sung các chất điều tiết BA, Kinetin, BA kết hợp Kinetin và BA kết hợp với IBA ở các nồng độ khác nhau. - Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi mía in vitro cao 6 - 7 cm, lá xanh, phát triển tốt được cấy chuyển trên môi trường có α-NAA với nồng độ từ 0; 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0 mg/l để kích thích ra rễ. Tất cả các môi trường nuôi cấy in vitro có thành phần cơ bản gồm MS + 30 g/l sucrose + 7,0 g/l agar + 500mg/l THT được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16 h sáng/8 h tối, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC. Trước khi bố trí các thí nghiệm thì cấy chuyển mẫu ra môi trường MS + 30 g/l đường + 7 g/l agar ít nhất một tuần để mẫu không bị ảnh hưởng bởi các chất điều tiết sinh trưởng. - Giai đoạn thích ứng cây ngoài tự nhiên: Tiêu chuẩn cây ra ngoài vườn ươm là cây phát triển tốt cao 7 - 10 cm, lá xanh tốt 4 - 5 lá, bộ rễ khỏe mạnh, số rễ trung bình khoảng 10 - 11 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình 1,1 - 1,2 cm. Huấn luyện cây: Thí nghiệm ra cây in vitro được tiến hành vào tháng 8 - 9 khi nhiệt độ khá cao, nắng nhiều. Trước khi ra cây in vitro, các bình cây in vitro được mang ra vườn ươm trước 2 - 3 ngày để tập nắng, cho cây quen với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ bên ngoài. Cây con mới ra cây được che bằng lưới đen, ngày tưới 2 lần vào sáng sớm và chiều tối, sau khoảng 1 tuần có thể bỏ lưới che ra. Chuẩn bị giá thể: Cát lọc sạch rác bẩn, phơi khô, khử trùng; giá thể đất được lấy trực tiếp vườn thí nghiệm trồng mẫu mía tại huyện Thạch Thành, Thanh Hóa; đất được tán nhỏ; giá thể đất:cát được trộn với tỉ lệ 1 : 1. 58 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu Các thí nghiệm trong phòng được bố trí nhắc lại 3 lần mỗi công thức, 10 bình/nhắc lại/công thức, mỗi bình cấy một mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm sau 4 tuần đối với các thí nghiệm nhân nhanh và ra rễ. Thí nghiệm ngoài vườn ươm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 30 mẫu, theo dõi sau một tháng ra cây. Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel và IRRISTAT 4.0. 2.2.5. Các chỉ tiêu theo dõi Hệ số nhân (chồi/mẫu) = ∑ số chồi tạo thành/ ∑ số mẫu nuôi cấy; Chiều cao chồi (cm) = ∑ chiều cao chồi/∑ số mẫu nuôi cấy; Tỉ lệ hình thành chồi (%) = ∑ số chồi/∑ số mẫu cấy; Tỉ lệ hình thành rễ (%) = Số cây sống/Tổng số cây đưa ra trồng; Số rễ (rễ/mẫu) = ∑ số rễ/∑ số mẫu; Chiều dài rễ (cm) = ∑ chiều dài rễ/∑ số mẫu nuôi cấy; Tỉ lệ cây sống (%) = ∑ cây sống/∑ cây đưa ra trồng. Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống mía tím Kim Tân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 11/2016 đến tháng 11/2017 tại Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro Để tiến hành xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu là tiền đề quan trọng để quyết định sự thành công của nghiên cứu. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ BA cao trong môi trường nuôi cấy có hiệu quả tốt đối với việc vào mẫu mía trong giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mía VN84-4137 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhóm tác giả Lê Phi Long và Phan Thị Thu Hiền (2013) cũng cho thấy sử dụng môi trường vào mẫu mía từ đỉnh sinh trưởng là MS + 10 g/l agar + 20 g/l đường + 2 mg/l BA. Hơn nữa, từ kết quả thăm dò trên nền một số môi trường tái sinh chồi từ mắt mầm và đỉnh sinh trưởng, môi trường MS + 2 mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7 g/l agar được sử dụng để tạo vật liệu khởi đầu trên hai loại vật liệu là mắt ngủ và đỉnh sinh trưởng của cây mía. Kết quả quan sát được minh họa ở Hình 1. 59 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Hình 1. Sự phát triển của chồi mía sau khi vào mẫu Mắt mầm 1 tuần 2 tuần 3 tuần Khi vào mẫu trên hai nguồn vật liệu kết quả cho thấy cả hai vật liệu là mắt ngủ và đỉnh sinh trưởng của cây mía đều phát sinh chồi sau 2 - 3 tuần. Tuy nhiên, các chồi này chưa được tận dụng để làm vật liệu khởi đầu cho quá trình nhân nhanh. Các chồi này trải qua 2 - 3 lần cấy chuyển, sau khoảng 2 - 3 tháng các chồi hình thành các cụm chồi nhỏ, các cụm chồi này sẽ được sử dụng làm vật liệu khởi đầu. Mặt khác, vật liệu là đỉnh sinh trưởng khá ít, trong khi đó số lượng mắt mầm mía nhiều. Trên cơ sở đó mắt mầm mía được lựa chọn là nguồn vật liệu thích hợp để tạo vật liệu khởi đầu cho quy trình nhân nhanh. 3.2. Giai đoạn nhân chồi mía in vitro 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro BA là chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng của mô phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào. Trong nhân giống in vitro, BA có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc kích thích sự hình thành chồi non, quyết định hệ số nhân và chất lượng chồi (Hoàng Minh Tấn và ctv., 2006). Bảng 1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro sau 4 tuần CTTD CT BA (mg/l) HSN (cụm chồi/mẫu) Chiều cao TB (cm) Nhận xét CT1 (ĐC) 0,00 2,00 1,12 + CT2 0,25 3,67 1,36 ++ CT3 0,50 4,30 1,64 +++ CT4 0,75 3,00 1,52 ++ CT5 1,00 2,30 1,32 ++ LSD0,05 0,16 0,24 CV (%) 2,70 1,60 Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT+ 7 g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, lá xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp hoặc trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, các chồi khá mập, hệ số nhân chồi cao. Qua kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy: BA có tác dụng tích cực trong việc nhân nhanh mía tím Kim Tân trong nuôi cấy in vitro. Các công thức có bổ sung BA đều cho hệ số nhân đạt trên 2,3 cụm chồi/mẫu, cao hơn so với công thức đối chứng không bổ sung BA (2,0 cụm chồi/mẫu). Trong các công thức có bổ sung BA, hệ số nhân đạt cao nhất ở công thức có bổ sung 0,5 mg/l BA (4,3 cụm chồi/mẫu), sau đó giảm dần xuống ở công thức có bổ sung 0,75 - 1,0 mg/l BA tương ứng là 3,0 và 2,3 cụm chồi/mẫu. Các cụm chồi phát triển tốt, trong cụm chồi lại có những chồi đơn sinh trưởng mạnh, nhưng do phát triển thành cụm nên chiều cao trung bình khá thấp dao động từ 1,12 - 1,64 cm. Kết quả thu được có sự khác biệt đối với một số kết quả công bố trước đâycho rằng nồng độ BA cao thích hợp đối với nhân nhanh mía. Điển hình như công bố của nhóm tác giả Hà Thị Thúy và cộng tác viên (2013) đã chỉ ra môi trường nhân nhanh tốt nhất của cây mía đó là MS bổ sung 1,5 mg/l BA cho hệ số nhân chồi là hơn 4 lần. Như vậy, công thức cho hệ số nhân chồi cao nhất là công thức 3: MS + 0,5 mg/l BA + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT+ 7 g/l agar với hệ số nhân đạt 4,30 cụm chồi/mẫu, chiều cao trung bình cụm chồi là 1,64 cm. 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro Bên cạnh BA, Kinetin cũng có ảnh hưởng tích cực đến khả năng nhân nhanh chồi của một số cây trồng. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của Kinetin đến sinh trưởng và hệ số nhân chồi lại có những đặc trưng riêng. Các cụm chồi được cấy trên môi trường có bổ sung Kinetin với nồng độ thay đổi từ 0 - 1,0 mg/l. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2. 60 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng 2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro sau 4 tuần CTTD CT Kinetin (mg/l) HSN (Cụm chồi/mẫu) Chiều cao TB (cm) Nhận xét CT1(ĐC) 0,00 2,00 1,12 + CT2 0,25 2,67 1,83 + CT3 0,50 3,20 2,17 +++ CT4 0,75 2,10 1,72 ++ CT5 1,00 1,67 1,53 + LSD0.05 0,16 0,54 CV% 3,50 1,70 Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose +500 mg/l THT+ 7 g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, lá xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp hoặc trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, các chồi khá mập, hệ số nhân chồi cao. Qua kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy: Tương tự như BA, Kinetin có tác dụng trong việc nhân nhanh mía nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên, hệ số nhân khá thấp, các chồi đơn lẻ trong cụm chồi có xu hướng phát triển mạnh về chiều cao và số lá. Trong các công thức thí nghiệm có bổ sung Kinetin, hệ số nhân đạt cao nhất (3,20 cụm chồi/mẫu) trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin. Khi nồng độ Kinetin tăng lên hệ số nhân của chồi và chiều cao chồi có xu hướng giảm. Như vậy, Kinetin có tác dụng nhân chồi mía Kim Tân ở nồng độ thấp (0,5 mg/l Kinetin), 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin và nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro Một số kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết hợp giữa BA, Kinetin và nước dừa rất thích hợp cho sự nhân nhanh chồi mía (Hà Thị Thúy và ctv., 2000). Hơn nữa, BA và Kinetin ở nồng độ 0,5 mg/l thích hợp hơn đối với việc nhân nhanh giống mía tím Kim Tân. Trên cơ sở đó, các thí nghiệm về nước dừa được sử dụng trên nền môi trường có bổ sung BA, Kinetin ở nồng độ 0,5 mg/l kết hợp với việc bổ sung nước dừa ở các nồng độ 0%; 5%; 10%; 15% nhằm xác định nồng độ nước dừa có hiệu quả nhất trong việc tăng hệ số nhân chồi, chất lượng chồi cũng như sự sinh trưởng cây mía in vitro. Thí nghiệm sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro sau 4 tuần CTTD CT Nước dừa (%) HSN (cụm chồi/mẫu) Chiều cao TB (cm) Nhận xét CT1(ĐC) 0,0 3,56 1,38 ++ CT2 5,0 5,33 1,51 +++ CT3 10 6,30 2,00 +++ CT4 15 4,30 1,48 ++ LSD0,05 0,29 0,38 CV (%) 3,30 1,30 Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT + 7 g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, lá xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp hoặc trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, các chồi khá mập, hệ số nhân chồi cao. Kết quả cho thấy rằng sự kết hợp giữa BA, Kinetin và nước dừa có ảnh hưởng đến sự nhân nhanh của chồi mía tím Kim Tân. Hệ số nhân chồi cũng như chiều cao và chất lượng chồi tăng lên đáng kể khi kết hợp giữa BA, Kinetin và nước dừa. Ở tất cả các công thức có bổ sung nước dừa hệ số nhân chồi và chiều cao chồi đều cao hơn so với đối chứng. Hệ số nhân chồi đạt cao nhất 6,30 cụm chồi/mẫu ở nồng độ nước dừa 10%. Tại nồng độ nước dừa này các cụm chồi có chiều cao trung bình xanh, mập, chất lượng chồi tốt. Ở nồng độ nước dừa 15% hệ số nhân chồi, chiều cao chồi đều giảm. Điều này chứng tỏ việc nồng độ nước dừa cao bổ sung vào môi trường nuôi cấy không thích hợp cho việc nhân chồi ở mía tím Kim Tân. Hình 2. Chồi mía in vitro trên môi trường có bổ sung nước dừa sau 4 tuần 61 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Như vậy, công thức nhân cụm chồi tốt nhất là: MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 500 mg/l THT + 30 g/l đường+ 7 g/l agar. 3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro Trong giai đoạn nhân cụm chồi, hệ số nhân thu được ở các thí nghiệm khá cao, tuy nhiên các chồi chỉ có chiều cao trung bình dao động trong khoảng 2 cm. Với chiều cao chồi thấp không đáp ứng được tiêu chuẩn của cây khi bố trí thí nghiệm ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Trên cơ sở đó, các cụm chồi này tiếp tục được sử dụng để bố trí thí nghiệm nhằm tăng hệ số nhân và chất lượng chồi. Trong thí nghiệm này, các cụm chồi gồm 2 - 3 chồi đơn, chiều cao trung bình từ 2 - 3 cm được sử dụng để bố trí thí nghiệm tăng hệ số nhân và chất lượng chồi. Trong thí nghiệm này nồng độ BA từ 0,25 - 0,75 mg/l kết hợp với nồng độ IBA từ 0,1 - 0,3 mg/l đã được sử dụng. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện ở bảng 4. Bảng 4. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro CTTD CT Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) HSN chồi (chồi/ mẫu) Chiều cao TB chồi (cm) Hình thái chồi CT1 (ĐC) 0 0 6,19 7,23 +++ CT2 0,25 0,1 5,56 7,66 ++ CT3 0,5 6,1 7,89 +++ CT4 0,75 8,56 7,33 +++ CT5 0,25 0,2 4,89 7,4 + CT6 0,5 6,89 7,12 ++ CT7 0,75 6,67 7,29 ++ CT8 0,25 0,3 4,78 6,38 + CT9 0,5 6,23 7,17 +++ CT10 0,75 5,44 6,38 ++ Nồng độ BA 0,25 5,08 7,15 0,5 6,41 7,39 0,75 6,89 7,00 Nồng độ IBA 0,1 6,74 7,63 0,2 6,15 7,27 0,3 5,48 6,64 LSD0,05 (BA)     0,24 0,29   LSD0,05 (IBA) 0,24 0,29 LSD0,05 (BA*IBA) 0,41 0,51 CV (%)     3,9 4,1   Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 7 g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, lá xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp hoặc trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, các chồi khá mập, hệ số nhân chồi cao. Qua bảng 4 cho thấy việc bổ sung BA và IBA có ảnh hưởng tốt đến khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro, hệ số nhân chồi cũng như chiều cao chồi tăng lên đáng kể, cụ thể là: Khi kết hợp BA với IBA (ở nồng độ 0,1 mg/l) thì HSN chồi tăng khi tăng nồng độ BA. Nồng độ BA ở mức 0,25 - 0,5 mg/l cho HSN chồi thấp hơn công thức đối chứng là 6,19 chồi/mẫu, tuy nhiên mức độ chênh lệch không lớn. Khi tăng nồng độ BA lên 0,75 mg/l thì HSN chồi đạt giá trị cao nhất 8,56 chồi/ mẫu, chiều cao chồi đạt 7,33 cm, các chồi mập, cao, lá xanh tốt. Khi kết hợp BA với tăng nồng độ IBA lên 0,2 mg/l thì HSN chồi giảm, dao động từ 4,89 - 6,89 chồi/mẫu. Khi kết hợp BA với 0,3 mg/l IBA thì HSN chồi ở tất cả các công thức đã giảm đi đáng kể. Điều này chứng tỏ nồng độ IBA càng cao thì càng ức chế khả năng nhân nhanh chồi mía tím in vitro. Vậy việc kết hợp giữa BA và IBA là có tác động tới khả năng nhân nhanh chồi mía in vitro. Môi trường nhân nhanh tối ưu nhất là: MS + 0,75 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA + 10% nước dừa + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + 7 g/l agar cho HSN chồi 8,56 chồi/ mẫu, chiều cao chồi đạt 7,33 cm chồi/mẫu, chất lượng chồi tốt, bộ lá xanh tốt (Hình 3). 3.3. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh Sự phát triển khỏe mạnh của hệ rễ cây con trong nuôi cấy in vitro là điều kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà lưới và trên đồng ruộng. Trong số các chất kích thích sinh trưởng α-NAA được biết đến là chất kích thích hình thành rễ. Để xác định được nồng độ thích hợp của α-NAA bổ sung vào môi trường, thí nghiệm đã được tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình hình thành rễ cây mía Kim Tân nuôi cấy in vitro. Vật liệu thí nghiệm này là những chồi đơn, cao từ 6 - 7 cm, phát triển tốt, được tách ra từ những cụm chồi nhân nhanh. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 5. Từ số liệu bảng 5 có thể thấy ảnh hưởng rõ rệt của α-NAA đến sự ra rễ của chồi mía. Các công thức có bổ sung α-NAA đều cho tỉ lệ ra rễ là 100%, rễ xuất hiện sớm, chất lượng tốt. Khi tăng nồng độ từ 0,25 mg/l đến 0,5 mg/l α-NAA thì số rễ/mẫu tăng từ 7,4 rễ/mẫu đến 11,9 rễ/mẫu. Công thức cho số rễ/mẫu đạt giá trị cao nhất được quan sát ở nồng độ 0,5 mg/l α-NAA. Tuy nhiên khi tăng nồng độ α-NAA lên 0,75 và 1,0 mg/l thì số rễ/mẫu và chiều dài rễ có xu hướng giảm xuống. Điều đó có thể nhận thấy rằng nồng độ cao của α-NAA ức chế sự hình thành 62 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 rễ in vitro của chồi mía. Kết quả của thí nghiệm thu được cũng tương ứng với các kết quả của một số công bố trước đây của nhóm tác giả Nguyễn Thị Lan Hương và cộng tác viên (2011). Nhóm tác giả cũng chỉ ra rằng bổ sung 0,5 mg/l α-NAA vào môi trường nuôi cấy sẽ giúp cây ra rễ tốt hơn. Bên cạnh đó tác giả Hà Thị Thúy và cộng tác viên (2013) cũng nhận định môi trường có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA là thích hợp nhất cho sự ra rễ in vitro ở cả 2 giống ROC 26 và BH1. Bảng 5. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của chồi mía in vitro sau 4 tuần CTTD CT Nồng độ α-NAA (mg/l) Tỉ lệ ra rễ (%) Số rễ TB/ mẫu Chiều dài rễ TB/ mẫu (cm) CT1 (ĐC) 0,00 90 7,10 1,40 CT2 0,25 100 7,40 1,00 CT3 0,50 100 11,90 1,21 CT4 0,75 100 8,60 0,78 CT5 1,00 100 7,20 0,59 LSD0,05 0,34 0,75 CV (%) 2,20 3,30 Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT + 7 g/l agar, pH = 5,8. Tóm lại môi trường ra rễ tối ưu đối với giống mía Kim Tân là MS + 0,5 mg/l α-NAA + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + 7 g/l agar, các rễ xuất hiện sớm, số rễ/ mẫu nhiều, chất lượng rễ tốt. 3.4. Thích nghi cây ngoài vườn ươm Trước khi đưa cây vào sản xuất việc thích nghi cây trong vườn ươm để đảm bảo tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng và phát triển tốt là một khâu quan trọng. Nhằm hạn chế số lượng cây chết do môi trường thay đổi đột ngột, thời gian cho cây thích ứng thích hợp nhất là 2 - 3 ngày. Trong thí nghiệm này cây mía in vitro có chiều cao từ 6 - 7 cm, có bộ lá xanh sinh trưởng tốt, được trồng trực tiếp trên các giá thể khác nhau, đặt trong nhà lưới có che và được che bớt 50% ánh sáng. Qua bảng 6 cho thấy, các giá thể khác nhau thì tỷ lệ sống và trạng thái của cây là khác nhau. Trên giá thể đất cho tỷ lệ cây mía sống cao nhất đạt 83,3%. Trên giá thể đất + cát với tỷ lệ 1 : 1 và giá thể cát tỷ lệ sống đạt 70% - 73,3%, tuy nhiên cây sinh trưởng kém hơn, lá nhanh bị úa vàng. Do vậy giá thể tốt nhất để thích ứng cây ngoài vườm ươm là giá thể đất, cho tỷ lệ cây sống sót cao nhất, cây sinh trưởng khỏe mạnh. Hình 3. Chồi mía in vitro trên môi trường bổ sung BA và IBA sau 4 tuần 63 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng 6. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây mía tím Kim Tân ngoài vườn ươm CTTD CT Số cây ra cây Tỉ lệ cây sống (%) Trạng thái cây 100% Cát ẩm 90 73,3 ++ 100% Đất 90 83,3 +++ Đất: cát (1:1) 90 70,0 + Ghi chú: +: Lá úa vàng nhanh, sinh trưởng kém; ++: lá có hiện tượng úa vàng; +++: lá xanh tốt, cây sinh trưởng khỏe. IV. KẾT LUẬN Vật liệu khởi đầu phù hợp nhất cho nhân giống in vitro mía tím Kim Tân là mắt mầm. Môi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi mía tím Kim Tân là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 500 mg/l THT + 7,0 g/l agar cho hệ số nhân cụm chồi là 4,30 cụm chồi/mẫu/4 tuần và chiều cao trung bình chồi đạt 2,0 cm. Môi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi mía tím Kim Tân là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar. Môi trường này cho hệ số nhân chồi là 6,30 cụm chồi/mẫu/4 tuần và chiều cao trung bình chồi đạt 2,0 cm. Trên nền môi trường MS + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar + 500 mg/l THT bổ sung 0,75 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA cho hệ số nhân chồi đạt cao nhất 8,56 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 7,33 cm sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro là nền môi trường MS + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + 7 g/l agar có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA cho tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 11,36 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 1,21 cm sau 4 tuần nuôi cấy. Giá thể tiếp nhận cây mía in vitro là đất cho tỷ lệ sống sót của cây là 83,3% sau 2 tuần, cây sinh trưởng khỏe mạnh, bộ lá phát triển tốt. TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn Kim Ngân, 2011. Vi nhân giống mía Saccharum officinarum L. Luận văn tốt nghiệp. Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Lê Phi Long, Phan Thị Thu Hiền, 2013. Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mía VN84-4137 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật”. Tạp chí KH&CN Nghệ An, số 4/2014, tr. 1-5. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch và Vũ Quang Sáng, 2006. Giáo trình sinh lý thực vật. NXB Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Hà Thị Thuý, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, 2000. Nghiên cứu nhân nhanh một số giống mía mới bằng nuôi cấy mô callus lá non. Tạp chí Nông nghiệp và Công nghệ thực phẩm, số 10.456. Hà Thị Thúy, Trần Thị Hạnh, Vũ Anh Tuấn, Đỗ Năng Vịnh, 2013. Nghiên cứu xây dựng và phát triển quy trình sản xuất giống mía sạch bệnh theo quy mô công nghiệp bằng công nghệ tế bào. Hội thảo quốc gia về khoa học cây trồng lần thứ nhất. Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 2013. Mulugeta Hailu, Meseret Chimdessa and Manikandan Muthswamy, 2018. In vitro propagation of selected sugarcane (Saccharum officinarum L.) varieties (C86-165 and C86-12) through shoot Apical Meristem. Hort Agric. 3(1): 1-7. Study on micropropagation of sugar cane variety “Kim Tan” Mai Thi Tan, Vu Thi Hoai, Le Thi Thu Hang Abstract This study was carried out in order to establish an in vitro micropropagation process of sugarcane “Kim Tan” from axillary bud. After 4 weeks, the highest values of shoot clusters proliferation (4.3 shoot clusters/explant; shoot length 2 cm) was obtained on MS medium with 0.5 mg/l BA, 0.5 mg/l Kinetin, 10% coconut water, 30g/l sucrose and 500 mg/l activated charcoad. The highest values of shoot multiplication (8.56 shootlets/shoot; shoot length 7.33 cm) was recorded on MS medium supplemented with 0.75 mg/l BA, 0.1 mg/l IBA, 10% coconut solution, 30g/l sucrose and 500 mg/l activated charcoad after 4 weeks. In vitro shoots were rooted on medium with 0.5 mg/l α-NAA, 500mg/l charcoal. Maximum rooting percentages (100%) with 11.36 roots/shoot and mean length of roots per shoots (1.21 cm) were achieved after 4 weeks. The plantlets were successfully acclimated and well developed in soil substrate with a high survival (83.3%). Keywords: Sugarcane, process, micropropagation, in vitro Ngày nhận bài: 12/11/2018 Ngày phản biện: 9/12/2018 Người phản biện: TS. Vũ Ngọc Thắng Ngày duyệt đăng: 11/1/2019