Nghiên cứuđộc tính của 3-Monochloropropan-1,2-Diol (3-MCPD) trên nhiễm sắc thể ở các pha cấp tính, bán mạn tính và mạn tính

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 20 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CỦA 3-MONOCHLOROPROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) TRÊN NHIỄM SẮC THỂ Ở CÁC PHA CẤP TÍNH, BÁN MẠN TÍNH VÀ MẠN TÍNH Ngô Kiến Đức*, Lê Phan Xuân Quyên*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Mạnh Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: 3-MCPD được hình thành do kết quả của quá trình phản ứng giữa chất béo với một nguồn có chứa chlorin (Cl-). Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh độc tính của 3-MCPD trên thận, cơ quan sinh dục và tiềm năng gây ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành theo dõi độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể ở các pha cấp tính, bán mạn tính, và mạn tính. Phương pháp: Chuột nhắt trắng được cho uống 3-MCPD ở các liều 1 mg/kg, 10 mg/kg, 40 mg/kg và 100 mg/kg. Máu chuột thí nghiệm được thu thập ở các pha cấp tính (sau 24, 48, 72 giờ và 2 tuần), bán mạn tính (sau 3 tháng) và mạn tính (sau 6 tháng) và khảo sát sự tạo vi nhân dựa trên phương pháp nhuộm màu bằng Giemsa. Kết quả: 3-MCPD với các liều khảo sát gây ra sự gia tăng hình thành các vi nhân trên hồng cầu (một biểu hiện của tổn thương nhiễm sắc thể) ở pha cấp tính (liều 100mg/kg) cũng như ở pha bán mạn tính và mạn tính. Kết luận: 3-MCPD ở các liều 1 mg/kg, 10 mg/kg, 40 mg/kg và 100 mg/kg khi sử dụng lâu dài gây tổn thương nhiễm sắc thể, vì thế có thể là một chất có nguy cơ gây ung thư. Từ Khóa: 3-MCPD, vi nhân, độc tính cấp và mạn tính ABSTRACT INVESTIGATION OF CLASTOGENIC PROPERTY OF 3-MONOCHLOROPROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) IN ACUTE, SUBCHRONIC AND CHRONIC PHASES Ngo Kien Duc, Le Phan Xuan Quyen, Nguyen Van Thanh, Tran Manh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 20 - 25 Objective: 3-MCPD is a toxic chemical formed as a result of the reaction between a lipid (triglyceride) and a chlorine (Cl-) in foods (sodium chloride, acid chlohydric). Besides, 3-MCPD is also popularly produced by acid- hydrolyzed protein processes. There are bodies of evidence showing toxic effects of 3-MCPD on kidney, reproductive organs and carcinogenic property. In this study, we investigated the acute, subchronic and chronic toxicity of 3-MCPD on micronucleus formation in blood peripheral erythrocyte. Method: mice were orally administered 3-MCPD at doses of 1 mg/kg, 10 mg/kg, 40 mg/kg or 100 mg/kg. Blood was collected at acute phase (24 hours, 48 hours, 72 hours and 2 weeks), subchronic phase (3 months) and chronic phase (6 months). The micronucleus test was performed on erythrocyte to investigate the ability of 3- MCPD to induce numerical or structural chromosomal damage. Results: 3-MCPD at doses experimented increased the micronucleus formation in erythrocyte at acute phases (dose of 100mg/kg) as well as at subchronic and chronic phase. Conclusion: 3-MCPD at doses of 1, 10, 40 and 100 mg/kg, administered in 6 months induced significant changes in genotoxicity, which may be a risk factor of carcinogenesis. * Bộ Môn Sinh hóa, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: Ths. Ngô Kiến Đức ĐT: 0903055357 Email: ngokienduc@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 21 Key words: 3-MCPD, micronucleus, acute and chronic toxicity ĐẶT VẤN ĐỀ 3-Monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) là một sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất nhiều loại thực phẩm. 3-MCPD được hình thành từ phản ứng giữa chất béo và ion Cl- ở nhiệt độ cao(2). Ngoài ra, 3-MCPD cũng được tạo ra trong quá trình thủy phân protein thực vật bằng acid hydrochloric (HCl)(1). 3-MCPD thường hiện diện ở hàm lượng rất thấp (<1 mg/kg) nhưng một vài loại sản phẩm có thể chứa với hàm lượng cao (lên đến hàng trăm mg/kg). Cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới xác định được rằng: với nồng độ 3-MCPD ở mức tối thiểu 1,1 mg/kg thể trọng, có thể gây thương tổn hệ sinh sản của chuột cống đực, thương tổn dạng tăng sinh và tạo khối u ở thận trên mô hình thực nghiệm động vật. Thương tổn gia tăng khi liều lượng tiếp xúc gia tăng. Các thương tổn này đưa đến kết luận là 3-MCPD được xếp vào nhóm hoá chất gây ung thư có đáp ứng theo liều lượng nhưng không gây độc tính trên gen(4). Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về độc tính của 3-MCPD, tuy nhiên các dữ liệu về độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể vẫn chưa được đầy đủ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đặt mục tiêu khảo sát độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể ở pha cấp tính, bán mạn tính và mạn tính. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thú vật thử nghiệm Thú vật thử nghiệm là chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, giống đực, có trọng lượng từ 18-20 g, được phân bố ngẫu nhiên thành nhiều lô khác nhau, mỗi lô từ 6. Chuột được cung cấp từ Viện Sinh phẩm và Vắcxin Nha Trang, được nuôi trong môi trường tiến hành thực nghiệm từ 3-5 ngày để thích nghi với môi trường. Hàng tuần, chuột được theo dõi thể trọng và lượng nước tiêu thụ để điều chỉnh lượng 3-MCPD thích hợp. Ở mỗi giai đoạn thí nghiệm, chuột được lấy máu để phân tích. Chuột thí nghiệm được chia thành các nhóm sau: Nhóm chứng : uống nước sinh hoạt, n = 6 Nhóm 1 : uống 3-MCPD 1 mg/kg/ngày pha trong nước uống sinh hoạt Nhóm 2 : uống 3-MCPD 10 mg/kg/ngày pha trong nước uống sinh hoạt Nhóm 3 : uống 3-MCPD 40 mg/kg/ngày pha trong nước uống sinh hoạt Nhóm 4 : uống 3-MCPD 100 mg/kg/ngày pha trong nước uống sinh hoạt Quan sát sự hình thành vi nhân Thử nghiệm này được thiết kế nhằm đánh giá các hóa chất có khả năng gây tổn thương nhiễm sắc thể. “Vi nhân” là một nhân nhỏ hình thành và xuất hiện bên cạnh nhân bình thường. Trong quá trình phân bào, nhiễm sắc thể sẽ nhân đôi và sau đó phân chia vào 2 tế bào con. Nếu tiến trình này bị gián đoạn, hoặc nhiễm sắc thể bị phá vỡ bởi hóa chất hay bức xạ thì sự phân bố nhiễm sắc thể vào 2 tế bào con bị ảnh hưởng và một vi nhân sẽ hình thành do không được tích hợp vào nhân chung. Hiện tượng này có thể được quan sát dưới kính hiển vi sau khi nhuộm màu nhân bằng thuốc thử thích hợp(5). Máu được lấy trực tiếp từ đuôi chuột và được phết thành lớp mỏng trên lam kính, sau đó được nhuộm bằng thuốc thử Giemsa. Quan sát trên kính hiển vi dưới vật kính 100 để tìm và phát hiện vi nhân xuất hiện trong hồng cầu. Phân tích thống kê Các số liệu được thống kê và trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình và biểu diễn bằng các loại biểu đồ. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,001 (độ tin cậy là 99,9%), p < 0,01 (độ tin cậy là 99%) hay trị số p < 0,05 (độ tin cậy là 95%) được thực hiện qua phép kiểm t-Student hay χ2 (chi bình phương). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 22 KẾT QUẢ Sự hình thành vi nhân trong pha cấp tính (24, 48, 72 giờ và 2 tuần) Trong quá trình thử nghiệm, chỉ có chuột của lô chứng, lô 1mg/kg, 10 mg/kg và 40 mg/kg là còn sống trong suốt thời gian thử nghiệm. Đối với lô uống 3-MCPD 100 mg/kg, chuột bắt đầu chết vào ngày thứ ba và sau 5 ngày thì không còn chuột nào sống sót. Nguyên nhân gây chết là do độc tính của 3-MCPD và trước khi chết chuột đều có dấu hiệu liệt chi sau. Chuột được lấy máu ở đuôi để tiến hành nhuộm màu hồng cầu và xác định số lượng vi nhân. Trên 6 mẫu nhuộm màu của mỗi lô thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đếm số lượng hồng cầu có vi nhân trên tổng số hồng cầu trong một thị trường quan sát, từ đó tính tỷ lệ phần trăm sự hình thành vi nhân trong mỗi lô thí nhiệm. Kết quả được trình bày ở các bảng 1, 2, 3, và 4. Bảng 1. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau 24 giờ Lô Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) 0/247 0/240 0/430 4/366 1/329 0/289 0/242 8/342 0/272 0/217 0/339 6/350 0/421 0/238 0/415 4/398 0/283 0/351 0/382 5/326 Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/398 0/312 0/361 4/411 Tỷ lệ hồng cầu có chứa vi nhân 0,05 ± 0,05 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 1,44 ± 0,22** **P < 0,01 so với lô chứng Bảng 2. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau 48 giờ Lô Chứng(n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) 0/257 0/298 1/393 9/454 0/411 0/357 0/248 9/352 0/267 0/258 0/421 11/506 0/389 0/397 0/336 15/333 0/324 0/411 0/264 11/425 Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/298 0/335 0/315 10/499 Tỷ lệ hồng cầu có chứa vi nhân 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,04 ± 0,04 2,63± 0,39** **P < 0,01 so với lô chứng Bảng 3. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau 72 giờ Lô Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/384 1/426 0/351 0/405 1/374 0/398 1/369 0/384 0/306 0/260 1/405 0/358 0/319 2/496 2/475 0/325 3/337 0/511 13/220 17/512 62/500 31/517 10/460 Chết Tỷ lệ hồng cầu có chứa vi nhân 0,08 ± 0,05 0,09 ± 0,05 0,29 ± 0,15 5,96 ± 1,77* *P < 0,05 so với lô chứng Bảng 4. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau 2 tuần Lô Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 100 mg/kg (n = 6) Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/464 1/394 0/295 0/326 0/389 0/481 2/518 0/283 1/473 0/426 2/527 1/474 2/546 0/396 1/515 1/523 1/432 0/498 Chết Chết Chết Chết Chết Chết Tỷ lệ hồng cầu có chứa vi nhân 0,09 ± 0,05 0,2 ± 0,07 0,16 ± 0,06 Kết quả sự tạo vi nhân qua các thời điểm được minh họa trong Hình 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 23 Hình 1. % Hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau 24, 48, 72 giờ và 2 tuần Nhìn chung, ở lô chứng, tỷ lệ xuất hiện vi nhân rất thấp, trên thị trường quan sát thường là không có hay chỉ có 1 vi nhân. Đối với các lô thử nghiệm, kết quả thu được như sau: Sau 24 giờ, hầu như không có sự hình thành vi nhân ở lô 1 mg/kg và lô 10 mg/kg. Tuy nhiên lô 100 mg/kg đã có sự hình thành vi nhân, mặc dù mức độ xuất hiện vi nhân còn thấp (1,44 ± 0,22) nhưng lại có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p<0,01). Như vậy với liều cao của 3- MCPD (100 mg/kg) đã gây ra sự hình thành vi nhân chỉ trong thời gian ngắn. Sau 48 giờ, mức độ xuất hiện vi nhân ở lô 1 mg/kg và lô 10 mg/kg tương tự như lô chứng, sự hình thành vi nhân là không có ý nghĩa ở hai lô này. Đối với lô 100 mg/kg, tỷ lệ hình thành vi nhân có cao hơn (2,63 ± 0,39) và so với mức độ hình thành vi nhân của cùng liều sau 24 giờ là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Sau 72 giờ, liều 1 mg/kg vẫn không có tác động đến sự hình thành vi nhân. Trong khi đó tỷ lệ vi nhân xuất hiện ở lô 10 mg/kg có cao hơn so với lô chứng nhưng vẫn còn rất thấp và không có ý nghĩa thống kê. Đặc biệt ở lô 100 mg/kg, vi nhân đã xuất hiện với tỷ lệ khá cao (5,96 ± 1,77) và có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05). Tuy nhiên so với mức độ hình thành vi nhân sau 48 giờ lại không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Điều này cho thấy khi sử dụng liều cao 3-MCPD liên tục thì sự hình thành vi nhân tăng theo từng ngày và đáp ứng rất mạnh sau 24 giờ đến 48 giờ. Sau 2 tuần, lô 100 mg/kg không còn chuột sống sót nên chỉ thống kê trên lô 1 mg/kg và lô 10 mg/kg. Mặc dù mức độ hình thành vi nhân ở thời điểm này của lô 1 mg/kg (0,2 ± 0,07) và lô 10 mg/kg (0,16 ± 0,06) có cao hơn so với lô chứng (0,09 ± 0,05) nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê. Như vậy, liều 1 mg/kg và 10 mg/kg chưa ảnh hưởng đến quá trình phân bào trong thời gian 2 tuần. Sự hình thành vi nhân trong pha bán mạn tính (3 tháng) và mạn tính (6 tháng) Các lô chuột sau khi thử nghiệm độc tính cấp được tiếp tục cho uống 3-MCPD pha trong nước uống hằng ngày. Sau 13 tuần (3 tháng) và 26 tuần (6 tháng) tiếp tục tiến hành khảo sát sự hình thành vi nhân và thu được kết quả trình bày trong bảng 5 và bảng 6. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 24 Bảng 5. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau 3 tháng Lô Chứng (n = 6) 3-MCPD 1 mg/kg (n = 6) 3-MCPD 10 mg/kg (n = 6) Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 1/498 0/330 0/240 0/445 0/404 0/374 7/538 2/476 5/569 7/541 2/418 2/571 12/490 12/435 12/477 13/467 18/522 19/565 Tỷ lệ hồng cầu có chứa vi nhân 0,03 ± 0,03 0,79 ± 0,18** 2,89 ± 0,17*** **P< 0,01; ***P< 0,001 so với lô chứng Bảng 6. Số lượng vi nhân quan sát trong một thị trường ở các lô thí nghiệm sau 6 tháng Lô Chứng 3-MCPD 3-MCPD 3-MCPD (n = 6) 1 mg/kg (n = 6) 10 mg/kg (n = 6) 40 mg/kg (n = 6) Số hồng cầu có vi nhân/tổng số hồng cầu trên thị trường 0/216 0/277 0/326 1/362 0/386 0/309 7/376 8/525 5/536 7/472 7/399 8/514 31/477 24/415 17/401 26/539 16/423 26/300 27/510 53/467 60/553 31/539 45/562 33/483 Tỷ lệ hồng cầu có chứa vi nhân 0,05 ± 0,05 1,52 ± 0,13*** 5,63 ± 0,73*** 8,01 ± 1,0*** ***P < 0,001 so với lô chứng Hình 2. Tỷ lệ hồng cầu có vi nhân ở các lô thử nghiệm sau 3 tháng và 6 tháng phơi nhiễm Sau 3 tháng, so với lô chứng, cả hai lô 1 mg/kg và 10 mg/kg đều có sự hình thành vi nhân khá rõ. Tuy nhiên số lượng vi nhân được tạo thành ở lô 1 mg/kg vẫn còn thấp với tỷ lệ 0,79 ± 0,18%, trong khi đó tỷ lệ này ở lô 10 mg/kg là 2,89 ± 0,17%. Tuy vậy, sự hình thành vi nhân ở cả hai lô đều tăng có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Sau 6 tháng, sự hình thành vi nhân càng thể hiện rõ hơn với tỷ lệ hồng cầu có vi nhân xuất hiện càng nhiều và mức độ xuất hiện vi nhân tăng theo liều lượng. Đặc biệt ở hai lô 10 mg/kg và 40 mg/kg, số lượng tế bào có vi nhân xuất hiện rất nhiều trên thị trường và rất dễ dàng quan sát thấy. So với pha cấp (24, 48, 72 giờ và 2 tuần), sự hình thành vi nhân ở các lô uống 3-MCPD 1 mg/kg, 10 mg/kg tăng hơn trong pha bán cấp tính (3 tháng) và mạn tính (6 tháng). Như vậy, 3-MCPD gây tổn thương nhiễm sắc thể lệ thuộc vào liều lượng và thời gian phơi nhiễm. Ở liều cao (100 mg/kg), 3-MCPD có thể gây tổn thương nhiễm sắc thể trong vòng 24 giờ. Ở liều thấp 1 mg/kg, tác động gây tổn thương nhiễm sắc thể của 3-MCPD thể hiện sau 3 tháng phơi nhiễm. BÀN LUẬN Kết quả thực nghiệm của chúng tôi cho thấy 3-MCPD với các liều 1 mg/kg, 10 mg/kg sau 24 giờ cũng như sau 2 tuần chưa có tác động đến sự hình thành vi nhân. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Robjohns và cộng sự (2003)(3), khi khảo sát thử nghiệm vi nhân trên tế bào hồng cầu non ở tủy xương với các liều 15 mg/kg, 30 mg/kg và 60 mg/kg sau 24 giờ, nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô thử nghiệm với lô chứng. Tuy nhiên chúng tôi chưa tìm được tài liệu nào đề cập đến Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 25 tác động của 3-MCPD lên sự hình thành vi nhân ở tế bào máu ở liều cao hơn. Vì thế chúng tôi tiến hành khảo sát liều 100 mg/kg và nhận thấy chỉ trong vòng 24 giờ, hồng cầu có vi nhân đã bắt đầu xuất hiện và tăng lên sau 48 giờ và 72 giờ. Tuy nhiên, có thể liều này khá độc nên các chuột thử nghiệm đã chết trước 2 tuần. So với nghiên cứu của chúng tôi trước đây, với liều 1mg/kg, 10 mg/kg và 20 mg/kg đều gây sự hình thành vi nhân rõ rệt sau 6 tháng sử dụng 3-MCPD liên tục. Kết quả này lặp lại khi thực hiện khảo sát cùng thời gian nói trên với hai liều lặp lại 1 mg/kg và 10 mg/kg và liều cao hơn là 40 mg/kg. Hơn nữa, vi nhân cũng đã hình thành ở thời điểm sớm hơn là 3 tháng. Những kết quả này phản ánh nguy cơ phá vỡ nhiễm sắc thể của 3-MCPD lên các tế bào máu và cũng có thể ảnh hưởng đến các tế bào khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Collier PD, Cromiue DDO, & Davies AP (1991). Mechanisms of formation of chloropropanols present in protein hydrolysates. J. Am. Oil Chem. Soc., 68, 785–790. 2. Food Standards Agency (2001). Survey of 3- monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) in soy sauce and related products. No: 14/01, Food Standards Agency. 3. Robjohns S., Marshall R., Fellows M., Kowalczyk G. (2003), “In vivo genotoxicity studies with 3-monochloropropan-1,2- diol”, Mutagenesis, 18 (5), 401-404. 4. Tritscher, A.M. (2004 Apr 1), “Human health risk assessment of processing-related compounds in food”, Toxicol. Lett., 149 (1-3), 177-186. 5. Witt KL, Livanos E, Kissling GE, Torous DK, Caspary W, Tice RR, Recio L. (2008). Comparison of flow cytometry- and microscopy-based methods for measuring micronucleated reticulocyte frequencies in rodents treated with nongenotoxic and genotoxic chemicals. Mutat Res. 649(1-2):101-13.