Nhân giống cây cát tường (eustoma grandiflorum l.) qua hai con đường phát sinh phôi sinh dưỡng và phát sinh cơ quan

Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 110 NHÂN GIỐNG CÂY CÁT TƯỜNG (EUSTOMA GRANDIFLORUM L.) QUA HAI CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI SINH DƯỠNG VÀ PHÁT SINH CƠ QUAN Trần Thị Ngọc Lan Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm Đồng Thông tin chung: Ngày nhận bài: 18/06/2015 Ngày nhận kết quả bình duyệt: 25/08/2015 Ngày chấp nhận đăng: 09/2016 Title: The micropropagation of Lisianthus (Eustoma grandiflorum L.) through the way of organogenesis and embryogenesis Từ khóa: Chồi, Eustoma grandiflorum L., mô sẹo, phôi sinh dưỡng Keywords: Callus, Eustoma grandiflorum L., shoot, somatic embryo ABSTRACT Lisianthus (Eustoma grandiflorum L.) is an ornamental plant with beautiful flowers. Due to low germination of its seeds, usual techniques for its propagation are not efficient. This present study was aimed to investigate the morphogenesis of different explants for useful micropropagation of Lisianthus. The results showed that calli were formed and developed by culturing in vitro leaf explants derived shoots on MS medium supplemented with 2 mg/l α-NAA or 0.5 mg/l 2,4-D with the rate of 100%. The green, spongy calli were able to have shoot formation (82.50%), and the yellow, friable calli formed plantlets derived from somatic embryos (84.17%) in MS medium containing 0.5 mg/l BA. Results show rootlet formation in 0.5 mg/l α-NAA using MS medium for these shoots. All of plantlets were survived and adapted after 4 weeks of acclimatization in the ex vitro condittion. No abnormal morphological changes were found in Lisianthus plantlets with using propagation methods via organogenesis and embryogenesis. TÓM TẮT Cát tường (Eustoma grandiflorum L.) là loài cây trang hoàng, cho hoa bền, đẹp. Do tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp, những kỹ thuật nhân giống thông thường không đạt hiệu quả. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát sự phát sinh hình thái của mẫu cấy nhằm mục đích nhân nhanh và đồng loạt giống cây Cát tường. Qua nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy mẫu lá in vitro có nguồn gốc từ chồi trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-naphtaleneacetic acid (α-NAA) hoặc 0,5 mg/l 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) cho tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt 100%. Loại mô sẹo đặc vàng, dạng hạt phát sinh phôi sinh dưỡng, tạo thành cây con (tỷ lệ đạt 84,17%) và loại mô sẹo xốp, xanh hình thành chồi (tỷ lệ đạt 82,50%) trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurine (BA). Các chồi hình thành cây con khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA. Tất cả các cây con có nguồn gốc từ hai loại mô sẹo này đều thích nghi tốt trong điều kiện ex vitro. Không ghi nhận những thay đổi về hình thái bất thường nào từ những cây hình thành từ hai con đường phát sinh cơ quan và phát sinh phôi. 1. GIỚI THIỆU Cây Cát tường cho hoa đẹp, thanh nhã với nhiều màu sắc khác nhau như: xanh lá mạ, hồng, vàng, tím, trắng có viền hay không. Đây là một trong 10 loại cây cắt cành có độ bền hoa hàng đầu trên thế giới (Rezaee và cs., 2012). Cây có khả năng Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 111 kháng bệnh, chịu được acid và có khả năng đáp ứng với stress nhiệt độ cao. Tuy nhiên, hạt có kích thước rất nhỏ (19000 hạt/g), hạt rất khó gieo. Cây gieo từ hạt có kiểu hình không ổn định và có tỷ lệ nảy mầm không cao (dễ bị thất thoát hạt). Các công trình nghiên cứu trước đây, nhân giống in vitro thường vào mẫu bằng nuôi cấy hạt trong điều kiện in vitro (Lutoslawa và cs., 1988) hay nuôi cấy chồi, nhân chồi và cắt đoạn chồi. Semeniuk và Griesbach (1987) nhân giống Cát tường thông qua việc nuôi cấy chồi nách, lá và huyền phù tế bào. Furukawa (1993) nghiên cứu vi nhân giống tái sinh cây Cát tường từ những đoạn lá trên môi trường LS (Linsmaier & Skoog, 1965) bổ sung 1 mg/l BA cho kết quả tái sinh chồi từ lá. Sự phát sinh phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy huyền phù mô sẹo hình thành từ các mảnh lá Lissianthus russelianus Hook. hay từ các mảnh lá có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro cũng được nghiên cứu (Nhut và cs., 2006; Ruffoni và cs., 1990). Rezaee và cs. (2012) đã nghiên cứu sự hình thành phôi sinh dưỡng từ các mẫu lá của Eustoma grandiflorum L. trên môi trường LS và B5 hay gần đây Hassan và cs. (2014) đã thành công trong việc tạo mô sẹo từ lá cây Cát tường và phát sinh chồi từ mô sẹo này. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên chưa làm rõ sự phát sinh hình thái từ các mẫu cấy. Mục tiêu của bài báo này là nghiên cứu sự phát sinh hình thái của mẫu lá, lóng thân và đầu rễ từ các chồi cây nuôi cấy in vitro của cây Cát tường, khảo sát sự hình thành và nhân lên của mô sẹo, sự phát sinh và phát triển của phôi sinh dưỡng với tần số cao từ mô sẹo nuôi cấy từ lá của cây Cát tường để chọn ra phương thức nhân giống thích hợp cho loài cây có giá trị này. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Cây Cát tường cho hoa kép, đẹp, màu vàng nhóm Mariachi (Eustoma grandiflorum Mariachi Yellow imp.) có chiều dài 60 -70 cm, 7 tháng tuổi có nguồn gốc từ vườn cây của nông dân, ấp Vạn Thành, Đà Lạt. Cây có độ bền của hoa từ 13 – 27 ngày. Cây với các chồi ngọn và chồi nách được chọn làm vật liệu để thu lấy chồi (Hình 1). Hình 1. Thân cây Cát tường (Eustoma grandiflorum Mariachi Yellow imp.) mang các chồi ngọn và chồi nách (mũi tên). Môi trường nuôi cấy in vitro Sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962). Tùy thuộc từng thí nghiệm sẽ bổ sung hay không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV) khác nhau (α-NAA, BA, 2,4-D). Môi trường nuôi cấy có pH = 5,7. Các môi trường nuôi cấy được cho vào các bình thủy tinh (thể tích bình: 250 ml với 40 ml môi trường nuôi cấy/bình) và được hấp khử trùng trong 20 phút ở 121 οC, 1 atm. 2.2 Phương pháp 2.2.1 Vào mẫu, nuôi cấy chồi ex vitro Các đoạn mẫu có chiều dài 8 cm -10 cm được rửa sạch dưới vòi nước đang chảy, rửa lại bằng dung dịch nước rửa chén Sunlight, rửa lại nhiều lần bằng vòi nước 15 phút, rửa bằng nước đã hấp vô trùng (HVT), khử trùng bằng cồn ethylic 75% (v/v) trong 30 giây, rửa nước HVT 3 lần, ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% 6 phút, rửa lại 5 lần bằng nước HVT. Sau đó, tách các ngọn chồi và chồi nách, tách bỏ các lá bao, cho đến khi lộ ra đoạn chồi mang hai đến ba lá/chồi, rửa sạch bằng nước cất HVT và cấy vào môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose và 8 g/l agar với 5 chồi/bình. Các chồi này được nuôi trong 2 tuần để thu lấy cây con làm nguyên liệu cho việc cảm ứng tạo mô sẹo. Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 112 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các CĐHSTTV lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá cây Cát tường Các lá từ cây con in vitro đã nuôi cấy ở thí nghiệm trên được cắt thành các mảnh có kích thước (0,6 x 0,6) cm, được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung α-NAA (0; 1; 1,5 và 2 mg/l) hoặc 2,4-D (0; 0,5 và 1 mg/l), 30 g/l sucrose và 8 g/l agar. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức nuôi cấy trong điều kiện có chiếu sáng và 6 nghiệm thức nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn. Mỗi nghiệm thức gồm 8 bình với mỗi bình gồm 5 mẫu. Khảo sát sự phát sinh hình thái qua việc xác định tỷ lệ hình thành mô sẹo và tỷ lệ hình thành cấu trúc nhiều rễ, hình thái, màu sắc của những cấu trúc này trong điều kiện có chiếu sáng và điều kiện tối. Số liệu thu nhận sau 5 tuần nuôi cấy. 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các loại mẫu lên sự hình thành mô sẹo của cây Cát tường Các lá từ đoạn chồi đã nuôi cấy ở thí nghiệm trên được cắt thành các mảnh có kích thước (0,6 x 0,6) cm, các lóng thân ngang (đường kính 1 mm, dày 4 mm) hay các đoạn rễ (2 x 0,5) mm, được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-NAA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức nuôi cấy trong điều kiện có chiếu sáng và 3 nghiệm thức nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn. Mỗi nghiệm thức gồm 8 bình với mỗi bình gồm 5 mẫu. Sau 5 tuần nuôi cấy, khảo sát tỷ lệ hình thành mô sẹo của những mẫu này trong điều kiện có chiếu sáng và điều kiện tối. 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự tăng sinh mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ của cây Cát tường Hai loại mô sẹo (vàng, đặc và trắng xanh xốp) và cấu trúc nhiều rễ thu được ở các thí nghiệm trên được tiếp tục nuôi cấy trên môi trường tương tự với việc xác định khối lượng của mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ ở ngày thứ 7, ngày thứ 14 và ngày thứ 21 để khảo sát sự phát triển của mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ theo thời gian nuôi cấy. Mỗi bình gồm 5 mẫu. Mỗi nghiệm thức gồm 8 bình. 2.2.5 Khảo sát sự hình thành chồi và cây con từ mô sẹo của cây Cát tường Hai loại mô sẹo (vàng, đặc và trắng xanh xốp) được chuyển sang môi trường MS bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau (0; 0,5 và 1 mg/l) để khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo cũng như sự hình thành và phát triển của chồi và phôi sinh dưỡng từ mô sẹo. Mỗi bình gồm 5 mẫu. Mỗi nghiệm thức gồm 8 bình. Xác định tỷ lệ hình thành mô sẹo, hình thành cây con, hình thành chồi, chiều dài chồi, chiều dài rễ và số rễ, số chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy. 2.2.6 Khảo sát sự hình thành rễ từ các chồi xuất phát từ mô sẹo và sự thích nghi của cây con trong điều kiện ex vitro của cây Cát tường Đối với các cây con hình thành từ mô sẹo phát sinh phôi: Cây con hình thành trong điều kiện in vitro, được chuyển sang trồng trong nhà kính với giá thể trồng là 2 phần đất và 1 phần trấu hun. Cây được trồng trong 4 tuần để khảo sát khả năng ra rễ và thích nghi của cây trong điều kiện ex vitro. Đối với các chồi hình thành từ mô sẹo phát sinh chồi: Các chồi được chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA để chồi hình thành và phát triển rễ sau 2 tuần nuôi cấy. Sau đó, các cây này cũng được chuyển ra trồng trong nhà kính, chăm sóc tương tự như cây từ mô sẹo phát sinh phôi. 2.2.7 Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ phòng nuôi là (25 ± 1) οC, cường độ ánh sáng: 2000 lux và độ ẩm không khí: 70%. Trong thí nghiệm khảo sát sự thích nghi của cây con trong điều kiện ex vitro thì sử dụng nhà kính có nhiệt độ dao động ngày đêm là (17 – 25 ± 1) οC, cường độ ánh sáng dao động từ (1000 – 7000) lux và độ ẩm không khí: 80%. 2.2.8 Quan sát mô học Làm các loại tiêu bản về mô sẹo với việc cắt lát theo chiều ngang mẫu cần quan sát, ngâm trong dung dịch javel 10% trong 15 phút, rửa nước, ngâm trong dung dịch acid acetic 45% trong 15 phút, rửa nước, nhuộm màu bằng thuốc nhuộm hai màu đỏ carmin và xanh iod trong 15 phút, rửa nước và quan sát trên kính hiển vi quang học Olympus, Nhật với độ phóng đại 40 - 400 lần. Xác định kích thước mẫu bằng trắc vi thị kính. 2.2.9 Chỉ tiêu theo dõi Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 113 Quan sát màu sắc, hình dạng, tỷ lệ hình thành mô sẹo. Xác định khối lượng của mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ bằng cân phân tích Sartorius. Xác định số chồi trung bình trên cụm mô sẹo có khối lượng 1 g, số rễ hình thành trung bình/cây con. Đo chiều dài chồi và chiều dài rễ của cây bằng thước cặp đo Insize 2002S. Tỷ lệ phát sinh chồi: số mẫu phát sinh chồi x 100 trên tổng số mẫu nuôi cấy. Tỷ lệ hình thành cây con: số mẫu hình thành cây con với chồi và rễ x 100 trên tổng số mẫu nuôi cấy. 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm và trong nhà kính được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Các số liệu thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được phân tích thống kê bằng phép thử Duncan (sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác suất P < 0,05) với phần mềm xử lý thống kê SPSS (Statistical Program Scientific System) 16.0. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hình thành cây con từ chồi ex vitro Sau 2 tuần nuôi cấy, các chồi lớn dần và hình thành cây con mang từ 2 - 4 lá/cây. Các lá này được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm tạo mô sẹo. 3.2 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự phát sinh hình thái từ lá in vitro Các mẫu cấy trong điều kiện có chiếu sáng hình thành mô sẹo nhanh hơn so với mẫu trong điều kiện tối (27 đến 30 ngày so với 32 đến 35 ngày). Mô sẹo trong điều kiện có chiếu sáng có màu vàng xanh, dạng hạt hay xốp trong khi mô sẹo trong điều kiện tối cho màu trắng vàng, dạng đặc hay xốp. Khối lượng mô sẹo trong điều kiện có chiếu sáng cũng cao hơn điều kiện tối. Có lẽ, trong điều kiện có chiếu sáng, sự hấp thu chất dinh dưỡng của mẫu cấy sẽ cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Hassan và cs. (2014). Ở các nghiệm thức xử lý từ 2,4-D, mẫu cảm ứng đạt cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l 2,4-D nhưng tỷ lệ tạo mô sẹo giảm đi khi mẫu được nuôi cấy ở nồng độ cao hơn (1 mg/l). Có lẽ, 2,4.D ở nồng độ cao sẽ ức chế sự cảm ứng và hình thành mô sẹo. 2,4-D làm gia tăng mức auxin của mẫu cấy, kích thích sự phân chia tế bào tạo mô sẹo. Tuy nhiên, nồng độ 2,4-D cao sẽ cảm ứng sinh tổng hợp ethylene. Sự tích lũy ethylene dù chỉ một lượng nhỏ trong bình nuôi cấy có thể ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều mẫu cấy thực vật (George và cs., 2008). Bảng 1. Sự hình thành mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ của cây Cát tường sau 5 tuần nuôi cấy dưới ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các điều kiện nuôi cấy. CHẤT ĐHSTTV (mg/l) Điều kiện tối Điều kiện sáng Mô sẹo Cấu trúc nhiều rễ Mô sẹo Cấu trúc nhiều rễ α- NAA 2,4- D Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái 0 0 0,00e* 0,00c 0,00d 0,00c 1 0 57,50c Trắng, xốp 0,00c 60,00c Vàng trắng, xốp 0,00c 1,5 0 90,83b Trắng, vàng, hạt, đặc 9,17b Trắng rễ mảnh 91,67b Vàng, xanh, hạt, đặc 8,33b Xanh, trắng, mảnh 2 0 100a Trắng, vàng, 0,00c 100,00a Vàng, xanh, 0,00c Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 114 CHẤT ĐHSTTV (mg/l) Điều kiện tối Điều kiện sáng Mô sẹo Cấu trúc nhiều rễ Mô sẹo Cấu trúc nhiều rễ α- NAA 2,4- D Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái Tỷ lệ hình thành (%) Hình thái hạt, đặc hạt, đặc 0 0,5 100,00a Trắng vàng, hạt, đặc 0,00c 100,00a Vàng, xanh, hạt, đặc 0,00c 0 1 50,00d Trắng, xốp 47.50a Trắng, rễ to 55,83c Vàng xanh, xốp 44,17a Xanh, trắng, rễ to Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong Duncan’s test. Đặc biệt, các mô sẹo hình thành ở nồng độ 2 mg/l α-NAA hoặc 0,5 mg/l 2,4-D trong điều kiện có chiếu sáng hay không cho mô sẹo có màu vàng, dạng đặc. Quan sát mô học những mô sẹo này dưới kính hiển vi cho thấy có nhiều tế bào đang phân chia với những tế bào đẳng kính, nhân to mang bản chất phôi. Vì vậy, có thể những mô sẹo này có khả năng phát sinh phôi sinh dưỡng (Hình 2D, 2 E). Tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt cao nhất 100% trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-NAA hoặc 0,5 mg/l 2,4-D trong điều kiện có chiếu sáng hay tối hoàn toàn. Ở các nồng độ CĐHSTTV cao hơn như khi cảm ứng mẫu bằng 2,4-D (1 mg/l) đã xuất hiện cấu trúc màu xanh hay trắng gồm nhiều rễ bất định, rễ to (tỷ lệ: 44,17% – 55,83%) (Hình 2H). So với kết quả của Lutoslawa và cs. (1988) sử dụng GA3 và kinetin để nuôi cấy hạt và tạo mô sẹo từ hạt hay kết quả tạo mô sẹo từ lá (bổ sung vào môi trường B5 1,5 mg/l α-NAA của Hassan và cs., 2014) thì kết quả nghiên cứu ở đây cần phải bổ sung 2 mg/l α-NAA vào môi trường nuôi cấy thì tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt 100%. Có lẽ, sự cảm ứng của mẫu cấy còn phụ thuộc vào chủng loại. Tuy việc sử dụng 2,4-D và α-NAA đều cho tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhưng để đảm bảo độ ổn định di truyền thì việc sử dụng α-NAA cho những nghiên cứu tiếp theo là khả thi. 3.3 Ảnh hưởng của các loại mẫu cấy lên tỷ lệ hình thành mô sẹo của cây Cát tường Chọn môi trường nuôi cấy MS bổ sung 2 mg/l α- NAA để nuôi cấy các loại mẫu lá, lóng thân và đoạn rễ của cây Cát tường, kết quả nhận được ở Bảng 2. Bảng 2. Sự hình thành mô sẹo của các loại mẫu của cây Cát tường sau 5 tuần nuôi cấy với việc bổ sung 2 mg/l α- NAA vào môi trường nuôi cấy trong hai điều kiện có và không có chiếu sáng. Loại mẫu Tỷ lệ tạo mô sẹo trong điều kiện tối (%) Tỷ lệ tạo mô sẹo trong điều kiện sáng (%) Lá 100,00a* 100,00a Lóng thân 67,50b 68,33b Đoạn rễ 0,00c 0,00c Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong Duncan’s test. Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 115 Từ kết quả ở Bảng 2 cho thấy, tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt cao nhất ở loại mẫu cấy là lá (100%) trong cả hai điều kiện nuôi cấy có và không có chiếu sáng. Trong khi đó, loại mẫu cấy là đoạn rễ thì không hình thành mô sẹo. Kết quả của Rezaee và cs. (2012) khi cảm ứng mẫu lá, lóng thân và đoạn rễ cũng cho kết quả khá tương tự, với việc bổ sung BA (0,225 mg/l) lẫn α-NAA (1,86 mg/l) vào môi trường nuôi cấy. Auxin như α-NAA kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích các tế bào phân chia không trật tự dẫn tới sự phát sinh tạo mô sẹo. Cytokinin như BA giúp auxin phân chia tế bào và hình thành chồi. Trong nghiên cứu này, chỉ sử dụng 2 mg/l α-NAA là đủ để cảm ứng hình thành mô sẹo từ lá. Sự phân chia các tế bào biểu bì, nhu mô lá thường dẫn đến các tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, tế bào chất đậm đặc và nhân to là những tế bào có khả năng sinh phôi và qua quan sát giải phẫu đã cho thấy điều này (Hình 2D). Vì vậy, nuôi cấy mẫu lá với việc bổ sung 2 mg/l α-NAA là thích hợp trong hình thành mô sẹo. 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ Hai loại mô sẹo thu được: mô sẹo có màu trắng xanh, xốp (mô sẹo 1, Hình 2B) và mô sẹo có màu vàng, dạng hạt, đặc (mô sẹo 2, Hình 2C) và cấu trúc nhiều rễ (Hình 2H) thu được từ thí nghiệm (mục 3.2 và 3.3) được nuôi cấy tiếp tục trên môi trường tương tự để khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên sự phát triển của những cấu trúc này. Kết quả thu nhận được thể hiện qua Bảng 3. Từ kết quả ở Bảng 3 cho thấy, khối lượng của cả hai loại mô sẹo tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Khối lượng của chúng đạt cực đại sau 21 ngày nuôi cấy. Khối lượng của dạng cấu trúc nhiều rễ cũng tăng dần theo thời gian nuôi cấy với những rễ phát triển to, dài, màu xanh hay trắng và đạt cực đại sau 14 ngày nuôi cấy nhưng các cấu trúc này không tiếp tục phát triển, một số thậm chí bị hoại tử dẫn đến khối lượng giảm dần ở ngày nuôi cấy thứ 21. Vì vậy, không chọn những cấu trúc nhiều rễ này cho việc tái sinh hình thành cây. Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của các loại mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ của cây Cát tường. Thời gian nuôi cấy (ngày) Khối lượng của mô sẹo 1 (g) Khối lượng của mô sẹo 2 (g) Khối lượng của cấu trúc nhiều rễ (g) 7 1,41c* 1,43c 1,55c 14 2,81b 2,50b 2,93a 21 4,64a 4,02a 2,07b Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong Duncan’s test. 3.5 Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo cây Cát tường Từ kết quả ở các Bảng 4, Bảng 5 cho thấy ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mô sẹo cây Cát tường. Khi không bổ sung BA, mô sẹo tiếp tục tăng sinh với tỷ lệ đáng kể ở cả hai loại mô sẹo. Điều này có lẽ là do sự chi phối của α-NAA có trong mô sẹo. Khi tăng nồng độ BA, tỷ lệ hình thành mô sẹo giảm dần cho đến 0% và đồng thời, tỷ lệ hình thành chồi và cây con tăng dần theo nồng độ tăng của BA. Ở mô sẹo 1, tỷ lệ hình thành chồi đạt cao nhất ở nồng độ BA 1 mg/l (93,33%). Điều này cho thấy mô sẹo 1 chứa các vùng trung tâm phân sinh để biệt hóa chồi. Ngược lại, ở mô sẹo 2 cùng nồng độ BA 1 mg/l thì tỷ lệ hình thành cây con là cao hơn cả (95%). Chứng tỏ, mô sẹo 2 mang bản chất phát sinh phôi. Với sự hỗ trợ của BA, một cytokinin đã giúp các phôi non phát triển. Khác với mô phân sinh ngọn chồi, phôi bị tách khỏi khối mô vẫn tiếp tục tăng trưởng và phát triển bình thường trên môi trường thiếu CĐHSTTV. Ở phôi còn quá non, chưa có khả năng tổng hợp cytokinin, vì vậy, việc bổ sung cytokinin như BA là cần thiết ở giai đoạn đầu. Không những thế, BA phối hợp với auxin trong mẫu mô sẹo giúp sự tăng trưởng chồi con và khởi Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 116 phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô (Bùi Trang Việt, 2000). Chồi hình thành từ mô sẹo 1 đạt số lượng trung bình 24 – 31 chồi/cụm mô sẹo có khối lượng trung bình 1 g. Cây con hình thành từ mô sẹo 2 đạt số lượng trung bình 21 – 25 cây/cụm mô sẹo có khối lượng trung bình 1 g. Kết quả này cũng tương đương như công bố của Nhut và cs. (2006). Tuy nhiên, cây con hình thành từ mô sẹo 2 là qua con đường phát sinh phôi. Cây hình thành chồi, rễ và phát triển hoàn chỉnh mà không cần phải sử dụng IBA và GA3 như các công bố của Nhut và cs. (2006); Hassan và cs. (2014). Ngoài ra, ở nồng độ 0,5 mg/l BA thì mô sẹo hình thành chồi (82,33%, Hình 2 G) và các chồi này hình thành rễ và phát triển bình thường, nhưng ở nồng độ 1 mg/l BA, tỷ lệ phát sinh chồi từ mô sẹo là cao hơn (93,33%) nhưng chiều dài của các cây này lại thấp (24,2 mm so với 17,34 mm; 28,50mm so với 20,10 mm). Có lẽ, BA đã ức chế sự tăng trưởng của chồi ngọn. Vì vậy, một nồng độ BA 0,5 mg/l là vừa đủ để hình thành chồi và cây con từ hai loại mô sẹo này. Như vậy, cytokinin như BA đã ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi và giúp phôi phát triển. Ngoài ra, cytokinin còn có mối quan hệ tương tác với auxin, cytokinin làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm gia tăng sự phân cành. Bảng 4. Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của loại mô sẹo 1 của cây Cát tường sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS Nồng độ BA (mg/l) Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%) Tỷ lệ hình thành chồi (%) Tỷ lệ hình thành cây con (%) Chiều dài chồi (mm) Chiều dài rễ (mm) Số rễ/cây 0 54,17a* 33,83c 12,00a 12,67c 20,33b 3,03b** 0,5 7,50b 82,50b 10,00a 24,20a 27,47a 5,45,a 1 0,00c 93,33a 6,67b 17,34b 20,53b 3,07c Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong Duncan’s test. **: Số rễ hình thành sau khi các chồi được chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA để tạo rễ sau 2 tuần nuôi cấy. Bảng 5. Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của loại mô sẹo 2 của cây Cát tường sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS Nồng độ BA (mg/l) Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%) Tỷ lệ hình thành chồi (%) Tỷ lệ hình thành cây con (%) Chiều dài chồi (mm) Chiều dài rễ (mm) Số rễ/cây 0 59,17a* 12,33a 28,50c 18,67b 21,33b 3,23b 0,5 10,00b 5,83b 84,17b 28,50a 32,67a 5,05,a 1 0,00c 5,00b 95,00a 20,10b 20,67b 3,67b Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong Duncan’s test. Kết quả các số liệu từ hai Bảng 4 và Bảng 5 cho thấy con đường phát sinh phôi sinh dưỡng từ mô sẹo 2 là ưu thế hơn con đường phát sinh chồi từ mô sẹo 1, vì từ phôi sinh dưỡng hình thành cây con (Hình 2F) mà không cần các công đoạn như: cắt, chuyển chồi sang môi trường mới để chồi ra Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 117 rễ. Cụ thể, các chồi con hình thành từ mô sẹo 1 được chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA để hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy (và 100% các chồi này đều hình thành rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh). Tất cả các cây con được chuyển sang trồng trong nhà kính và đã thích nghi tốt trong điều kiện ex vitro (Hình 2I). Không phát hiện các thay đổi bất thường nào về hình thái của các cây con này qua hai con đường nhân giống này. Quan sát mô học Các quan sát giải phẫu hình thái mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy mẫu lá cho thấy, có nhiều tế bào nhỏ, đẳng kính, nhân to, đang phân chia mạnh mẽ. Đây là những tế bào có khả năng hình thành phôi (Hình 2D). Nuôi cấy tiếp tục những mô sẹo này thêm 2 tuần, chúng đã hình thành các phôi sinh dưỡng, nhô lên từ khối mô sẹo (Hình 2E). Vì vậy, những mô sẹo này là loại mô sẹo có khả năng phát sinh phôi. 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua hai con đường hình thành chồi và hình thành phôi sinh dưỡng, tạo cây con từ mô sẹo cho thấy, dù bằng con đường nào thì đều có khả năng nhân giống cao. Đây là sự ghi nhận về con đường nhân giống nhanh và khả thi của cây Cát tường. Những kết quả trên cho thấy, mẫu lá từ nuôi cấy chồi là thích hợp hơn cả trong việc hình thành và phát triển của cả hai loại mô sẹo 1 và 2 trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-NAA hoặc 0,5 mg/l 2,4-D. Mô sẹo 1 hình thành chồi, mô sẹo 2 hình thành phôi sinh dưỡng và phát triển thành cây con khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,5 mg/l BA. Các chồi từ mô sẹo 1 phát triển thành cây con khi chuyển sang nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA. Các cây con đều sống sót và thích nghi tốt trong điều kiện ex vitro. 4.2 Khuyến nghị Các cây con cần được nuôi trồng tiếp tục để khảo sát khả năng sinh trưởng và cho hoa của cây Cát tường. LỜI CẢM ƠN Tác giả trân trọng cảm ơn Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm Đồng đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho nghiên cứu này. Hình 2. Vi nhân giống cây Cát tường Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology 118 A. Mẫu cành hoa cây Cát tường (thanh ngang = 2,8 cm). B. Mô sẹo 1 sau 6 tuần nuôi cấy mẫu lá (thanh ngang = 1 cm). C. Mô sẹo 2 sau 6 tuần nuôi cấy mẫu lá (thanh ngang = 1 cm). D. Sự phân chia của các tế bào trong mô sẹo 2 sau 7 tuần nuôi cấy (thanh ngang = 30 µm). E. Sự hình thành phôi sinh dưỡng (mũi tên) trên mẫu mô sẹo 2 (thanh ngang = 300 µm). F. Sự hình thành cây con từ mô sẹo 2 (thanh ngang = 1 cm). G. Sự hình thành chồi từ mô sẹo 1 (thanh ngang = 1 cm). H. Sự hình thành cấu trúc nhiều rễ bất định sau 6 tuần nuôi cấy (thanh ngang = 1 cm). I. Sự ra rễ và phát triển của cây con trong nhà kính (thanh ngang = 2,5 cm). TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Trang Việt. (2000). Sinh lý thực vật đại cương, tập 2. Hồ Chí Minh: Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia. Furukawa, H. (1993). Some characteristics of regenerated plants from leaf and root explants of Eustoma grandiflorum. Plant Tissue Culture Letter, 10(1), 98-99. George, E.F., Hall, M.A. & Klerk, G.J. (2008). Plant propagation by tissue culture, Volume I. The Netherlands: Springer, 175-354. Hassan, A., Reyhaneh, P., & Narges, K. (2014). Evaluating the micropropagation of Lisianthus (Eustoma grandiflora l.) as an important ornamental. Plant Indian Journal of Science, 4 (2), 596-602. Linsmaier, E.M., & Skoog, F. (1965). Organic growth factor requirement of tobacco tissue cultures. Physiology Plant, 18, 100-127. Lutoslawa, S., Maria, W., & Barbara, T. (1988). Callus culture and micropropagation Eustoma grandiflorum Shinn. Acta Societatic, 57 (4), 423-430. Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco cultures. Physiology Plant, 15, 73-97. Nhut, D.T., Tuan, N.S., Ngoc, H.M., Uyen, P.N., Don, N.T., Mai, N.T, da Silva, J.A.T. (2006). Somatic embryogenesis induction from in vitro leaf cultures of Lisianthus (Eustoma grandiflorum (RAF.) Shinn.). Propagation Ornament Plants, 6(3), 121-127. Rezaee, F, Ghanati, F., & Yusefzadeh Boroujeni, L. (2012). Micropropagation of Lisianthus (Eustoma grandiflora L.) from different explants to flowering onset. Iranian Journal of Plant Physiology, 3(1), 583-587. Ruffoni, B., Damiano, C., Massabo, F., & Esposito, P. (1990). Organogenesis and embryogenesis in Lisianthus russellianus Hook. Acta Horticulture, 280, 83-87. Semeniuk, P., & Griesbach, R.J. (1987). In vitro propagation of Prairie gentian. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 8(3), 249-253.