Nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào gamma delta T trên bệnh nhân ung thư phổi

162(2) 2.2020 Khoa học Y - Dược Đặt vấn đề Ung thư phổi là bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trong số các loại ung thư trên thế giới. Theo ghi nhận của Globocan năm 2018 [1], số ca mới mắc ung thư phổi trên toàn thế giới là 2,1 triệu ca, chiếm 11,6% tổng số ca mắc ung thư; số ca tử vong do ung thư phổi là 1,76 triệu ca, chiếm 18,4% số ca tử vong do ung thư. Tại Việt Nam, theo Globocan năm 2018 [2], tỷ lệ mới mắc ung thư phổi xếp thứ hai đối với nam giới (chiếm 18,4%, sau ung thư gan) và xếp thứ ba đối với nữ giới (chiếm 9,4%, sau ung thư vú, ung thư đại trực tràng), có 164.671 ca mắc mới ung thư phổi và 114.871 người tử vong vì căn bệnh này. Trong bối cảnh đó, việc phát triển các phương pháp điều trị mới cũng như phối hợp các phương pháp điều trị nhằm nâng cao hiệu quả, cải thiện chất lượng sống, thời gian sống thêm không bệnh và sống thêm toàn thể với bệnh nhân ung thư phổi là điều hết sức có ý nghĩa. Trên thế giới, liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân sử dụng tế bào lympho γδT được phát triển để điều trị nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung thư phổi đã cho những kết quả ban đầu hứa hẹn [3, 4]. Tế bào γδT có thể nhận biết trực tiếp các phối tử không phải bản chất peptide mà không cần sự có mặt của phức hệ phù hợp mô chính (MHC). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tế bào γδT của người có thể nhận biết các phối tử được biểu hiện bởi các tế bào khối u và thể hiện độc tính mạnh với nhiều dòng tế bào ung thư [5]. Liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào γδT tự thân đã được thử nghiệm và mang lại một số kết quả khả quan. Trong liệu pháp này, tế bào miễn dịch được tách từ máu ngoại vi của người bệnh, nuôi cấy tăng sinh, hoạt hóa trong môi trường đặc biệt rồi truyền trở lại vào cơ thể của chính bệnh nhân. Trong những nghiên cứu trước đây, một số kháng nguyên phospho đã được sử dụng để hoạt hóa tế bào γδT. Kháng nguyên tổng hợp bromophydrin pyrophosphate (BrHPP) và 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP) đã được ứng dụng thành công trong việc tăng sinh tế bào γδT, được thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân ung thư biểu mô thận. Những thử nghiệm lâm sàng pha I cho thấy, liệu pháp miễn dịch tự thân sử dụng tế bào γδT cho những kết quả khả quan, hứa hẹn sẽ phát triển thành một liệu pháp điều trị ung thư có hiệu quả [6]. Hiện tại, Việt Nam vẫn đang trong giai đoạn tiếp cận với liệu pháp tế bào miễn dịch tự thân trong điều trị ung thư và chưa có nhiều công trình nghiên cứu được công bố trong lĩnh vực này. Do đó, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu hoàn thiện quy trình phân lập, nuôi cấy hoạt hóa tế bào γδT trên bệnh nhân ung thư phổi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn sử dụng zoledronate và IL-2 để hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT in vitro bởi vì hai hóa chất này đã được biết đến là có khả năng hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT cũng như đã được cấp phép sử dụng trong các thử nghiệm lâm sàng. Nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào gamma delta T trên bệnh nhân ung thư phổi Nguyễn Quý Linh1*, Tạ Thành Đạt1, Lê Văn Toàn2, Trần Vân Khánh1, Hoàng Thị Mỹ Nhung3, Trần Huy Thịnh2 1Trung tâm Nghiên cứu gen - protein, Trường Đại học Y Hà Nội 2Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội 3Bộ môn Sinh học tế bào, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngày nhận bài 5/9/2019; ngày chuyển phản biện 9/9/2019; ngày nhận phản biện 11/10/2019; ngày chấp nhận đăng 4/11/2019 Tóm tắt: Liệu pháp miễn dịch sử dụng tế bào lympho tự thân là một trong những liệu pháp điều trị kết hợp an toàn và khá hiệu quả cho nhiều loại ung thư hiện nay, trong đó có ung thư phổi. Mục đích của nghiên cứu là hoàn thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa tế bào gamma delta T (γδT) trên bệnh nhân ung thư phổi. 10 bệnh nhân ung thư phổi được lựa chọn vào nghiên cứu, mỗi bệnh nhân được thu thập 10 ml máu, tiến hành tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh, đánh giá hoạt tính miễn dịch. Kết quả cho thấy, số lượng tế bào γδT tách từ 10 ml máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư phổi là 1,96x104 tế bào. Sau 14 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào lympho thu được trung bình là 2,93x108, tỷ lệ sống trung bình đạt 90%, trong đó, tế bào γδT chiếm 83,2% quần thể tế bào thu được. Tế bào γδT sau nuôi cấy thể hiện các hoạt tính miễn dịch như khả năng gây độc cho tế bào ung thư và tăng tiết các cytokine như IFNγ. Từ khóa: liệu pháp miễn dịch tự thân, tế bào gamma delta T (γδT), ung thư phổi. Chỉ số phân loại: 3.1 *Tác giả liên hệ: Email: quylinh@hmu.edu.vn 262(2) 2.2020 Khoa học Y - Dược Đối tượng và phương pháp Đối tượng 10 bệnh nhân ung thư phổi được lựa chọn vào nghiên cứu. Bệnh nhân trên 18 tuổi, chỉ số toàn trạng ECOG (thang điểm của Nhóm hợp tác ung thư Đông Âu - Eastern Cooperative Oncology Group) ≤ 3. Bệnh nhân được khám tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Các bệnh nhân có bệnh lý tự miễn, dùng thuốc ức chế miễn dịch, bệnh lý mạn tính kết hợp, bệnh lý ác tính dòng tế bào lympho T sẽ bị loại trừ khỏi nghiên cứu này. Phương pháp Phương pháp thu thập mẫu: 10 ml máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư phổi được lấy vào ống chống đông heparin, bảo quản ở nhiệt độ phòng và được xử lý trong vòng 6 giờ. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Kỹ thuật phân tách tế bào lympho từ máu ngoại vi: các tế bào miễn dịch được tách bằng phương pháp ly tâm thay đổi tỷ trọng sử dụng Ficoll 1.077. Kỹ thuật nuôi cấy hoạt hóa tế bào γδT: sau khi phân lập, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường AIM-V chứa 10% huyết thanh của bệnh nhân có bổ sung thêm cytokine IL-2 (600 IU/ml) và zoledronate (5 mM). Khi các tế bào ổn định, đạt mật độ nuôi cấy cần thiết (70-80%) sẽ được chuyển sang các điều kiện nuôi cấy tăng sinh số lượng lớn. Tổng thời gian nuôi cấy và hoạt hóa tế bào lympho γδT là 14 ngày. Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào sống sử dụng Trypan blue: tế bào sau khi phân lập từ máu ngoại vi và sau nuôi cấy được nhuộm với Trypan blue để đếm số lượng và xác định tỷ lệ tế bào sống. Kỹ thuật phân loại tế bào nuôi cấy bằng Flow cytometry: dựa trên biểu hiện của các marker đặc hiệu trên bề mặt tế bào tương ứng với mỗi giai đoạn hoạt hóa và biệt hóa của mỗi loại tế bào lympho. Các marker được sử dụng là CD3, CD4, CD8, CD19, CD56. Các tế bào lympho được nhuộm với kháng thể kháng marker đặc hiệu cho từng loại tế bào và được đếm trên máy đếm dòng chảy tế bào BD FACS Canto II. Kỹ thuật Realtime PCR xác định mức độ biểu hiện của gen IFNγ, Vγ9: RNA tổng số được tách chiết từ tế bào γδT bằng kit RNeasy mini kit (Qiagen), sau đó được tổng hợp cDNA bằng Revert first strand cDNA synthesis kit (Thermo fisher scientific, USA) để sử dụng làm khuôn cho phản ứng Realtime PCR sử dụng cặp mồi và probe đặc hiệu của gen IFNγ và gen Vγ9 (Thermo fisher scientific, USA) trên hệ thống máy QuantStudio3 (Thermo fisher scientific, USA). Kỹ thuật ELISA đánh giá khả năng tiết IFNγ ra môi trường nuôi cấy: kỹ thuật này dựa trên nguyên lý của phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể, đồng thời sử dụng kháng thể gắn enzyme và chất phát màu mà qua đó có thể xác định được nồng độ của protein cần biết trong mẫu phân tích (ở đây chính là môi trường nuôi cấy). Nồng độ IFNγ trong môi trường nuôi cấy được định lượng bằng kỹ thuật ELISA sử dụng IFNγ human ELISA kit (Thermo fisher scientific, USA). Kỹ thuật xác định khả năng gây độc của tế bào: tế bào ung thư phổi H640 được nhuộm với chất huỳnh quang Calcein-AM, sau đó rửa sạch. Tế bào ung thư được nuôi cấy với số lượng 1x104 sẽ được đồng nuôi cấy với tế bào miễn dịch γδT với các tỷ lệ lần lượt là 1:1, 1:10, 1:30 trong 2 giờ. Hoạt tính gây độc sẽ được xác định bằng tín hiệu huỳnh quang giải phóng ra môi trường, được đo bằng hệ thống Terascan VPC (Minerva Tech, Nhật Bản). Xử lý số liệu: các số liệu được nhập và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 20.0. Thống kê phân tích sử dụng t-test độc lập so sánh giữa hai nhóm. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu này thuộc đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta T (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi” đã được Hội đồng đạo đức của Trường Đại học Y Hà Nội đồng ý thông qua giai đoạn thử nghiệm trên người tình nguyện khoẻ mạnh và bệnh nhân ung thư. Activation culture and proliferation of γδT cells from lung cancer patients Quy Linh Nguyen1*, Thanh Dat Ta1, Van Toan Le2, Van Khanh Tran1, Thi My Nhung Hoang3, Huy Thinh Tran2 1Center for Gene and Protein Research, Hanoi Medical University 2Department of Biochemistry, Hanoi Medical University 3Department of Cell Biology, University of Science, Vietnam National University, Hanoi Received 5 September 2019; accepted 4 November 2019 Abstract: Autologous γδT lymphocyte-based immunotherapy is currently an efficacious and safe treatment method for various types of cancer, including lung cancer. The study was conducted on 10 lung cancer patients, and the γδT cells were isolated, activated, proliferated, and evaluated from 10 ml of blood of each patient. The number of γδT cells isolated from 10 ml peripheral blood was 1.96x104 cells. The number of cells after 14-day culture was 2.93x108, and the cell survival rate was 90%. 83.2% of the cultured lymphocytes was γδT cells. The cultured γδT cells exhibited immune activities, such as cytotoxic activity and increased cytokine secretion. Keywords: autologous immunotherapy, gamma delta T (γδT) cells, lung cancer. Classification number: 3.1 362(2) 2.2020 Khoa học Y - Dược 5% 86% (A) (B) (C) Kết quả Chuẩn hóa quy trình nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT trên bệnh nhân ung thư phổi Sử dụng các nồng độ zoledronate và IL-2 khác nhau, lần lượt là 2,5 mM - 300 IU, 2,5 mM - 600 IU, 5 mM - 300 IU và 5 mM - 600 IU, tiến hành nuôi cấy và xác định tốc độ tăng trưởng của tế bào γδT tại một số thời điểm nuôi cấy. Kết quả được thể hiện ở hình 1. Số lượng tổng số tế bào thu được sau 14 ngày nuôi cấy tăng sinh đạt cao nhất tại nồng độ zoledronate - IL-2 là 5 mM - 600 IU. Số lượng tế bào đạt trên 2,6x108 tế bào là thỏa mãn yêu cầu cần đạt được. Tế bào lympho T đạt tỷ lệ cao nhất với 96,6% ở nồng độ zoledronate và IL-2 là 5 mM và 600 IU, trong đó tỷ lệ tế bào γδT ở cả 3 điều kiện nuôi cấy tăng sinh, hoạt hóa đều đạt trên 95% tổng số tế bào T thu được. Như vậy, nồng độ zoledronate và IL-2 tối ưu cho nuôi cấy tăng sinh, hoạt hóa tế bào γδT lần lượt là 5 mM và 600 IU. Hình 1. Đường cong sinh trưởng của tế bào γδT ở các nồng độ zoledronate/IL-2 khác nhau. Số lượng tế bào lympho thu được sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân ung thư phổi Bảng 1. Đặc điểm tế bào thu được sau phân lập từ máu ngoại vi. Số lượng tế bào Tỷ lệ sống Tỷ lệ tế bào γδT BN01 1,5x104 95% 5,1% BN02 1,8x104 94% 6,2% BN03 1,9x104 96% 5% BN04 1,2x104 95% 6,3% BN05 1,4x104 90% 6,4% BN06 2,4x104 98% 6,2% BN07 2,6x104 95% 6,1% BN08 1,9x104 92% 5,8% BN09 2,2x104 96% 6,5% BN10 2,7x104 97% 5,8% TB 1,96x104 94,8% 5,94% TB: trung bình. Bảng 1 cho thấy, số lượng tế bào lympho tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư phổi trung bình là 1,96x104. Trong đó, tế bào γδT chiếm tỷ lệ trung bình 5,94%. Tỷ lệ tế bào sống đạt 94,8%. Số lượng tế bào lympho γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi thu được sau nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh Bảng 2. Đặc điểm tế bào thu được sau nuôi cấy hoạt hóa. Số lượng tế bào Tỷ lệ sống Tỷ lệ tế bào γδT BN01 1,5x108 91% 81% BN02 4,5x108 89% 83% BN03 1,1x108 92% 86% BN04 1,6x108 93% 87% BN05 4,8x108 97% 84% BN06 2,5x108 96% 82% BN07 2,8x108 90% 83% BN08 3,7x108 78% 80% BN09 3,2x108 90% 85% BN10 3,6x108 90% 81% TB 2,93x108 90,6% 83,2% TB: trung bình. Bảng 2 cho thấy, số lượng tế bào trung bình thu được sau 14 ngày nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh là 2,93x108, tỷ lệ tế bào γδT trung bình đạt 83,2% (hình 2). Quần thể tế bào thu được sau 14 ngày nuôi cấy biểu hiện ở mức độ cao gen Vγ9 mã hóa cho thụ thể bề mặt Vγ9 đặc trưng cho tế bào γδT (hình 2C). Kết quả này chứng minh quần thể tế bào thu được sau nuôi cấy chiếm tỷ lệ lớn là tế bào γδT. Tỷ lệ sống đạt 90,6%. So sánh với trước khi nuôi cấy, tế bào nhân lên trung bình 14.949 lần. Hình 2. Tỷ lệ tế bào γδT thu được trước và sau nuôi cấy. (A) Tỷ lệ tế bào γδT thu được trước nuôi cấy; (B) Tỷ lệ tế bào γδT sau nuôi cấy; (C) Biểu hiện của gen mã hóa cho thụ thể Vγ9 ở tế bào αβT, tế bào γδT trước và sau nuôi cấy. *: p<0,05. 86% (A) (B) (A) (B) 5 86% (A) (B) 5% 86% (A) (B) 86% (A) (B) 462(2) 2.2020 Khoa học Y - Dược Đánh giá hoạt tính miễn dịch của tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi sau nuôi cấy Hoạt tính gây độc cho tế bào ung thư H460 của tế bào γδT sau 14 ngày nuôi cấy được thực hiện trên hệ thống Terascan VPC. Tế bào γδT thu được từ người tình nguyện khỏe mạnh thể hiện độc tính khá cao với dòng tế bào ung thư phổi H460, đạt 42,6% ở tỷ lệ E/T 10:1 và 51,7% ở tỷ lệ E/T 30:1. Hình 3 cho thấy, tế bào γδT từ bệnh nhân ung thư phổi cũng thể hiện độc tính tương tự với dòng tế bào H460, đạt 38,8% ở tỷ lệ E/T 10:1 và 43,7% ở tỷ lệ E/T 30:1. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa độc tính đối với dòng tế bào ung thư H460 của tế bào γδT sau nuôi cấy hoạt hóa tăng sinh thu từ người tình nguyện khỏe mạnh và bệnh nhân ung thư phổi. Hình 3. Hoạt tính gây độc của tế bào γδT sau 14 ngày nuôi cấy. Thêm vào đó, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra khả năng tiết cytokine của tế bào γδT sau nuôi cấy bằng kỹ thuật Realtime PCR. Mức độ biểu hiện của gen IFNγ trong tế bào γδT sau khi nuôi cấy của bệnh nhân ung thư phổi cao hơn 2,40 lần so với trước khi nuôi cấy (hình 4A). Hình 4. Mức độ biểu hiện của mRNA IFNγ trên tế bào γδT trước và sau nuôi cấy. (A) Biểu hiện ở mức độ mRNA IFNγ, (B) Khả năng tiết protein IFNγ. *: p<0,05. Không chỉ ở mức độ mRNA, nồng độ IFNγ do tế bào miễn dịch tiết vào môi trường nuôi cấy sau 14 ngày nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tăng cao hơn rõ rệt so với ngày đầu, đạt trung bình 1.217,29 pg/ml, so với trung bình 79,27 pg/ml trong môi trường nuôi cấy của tế bào trước nuôi cấy (hình 4B). Bàn luận Trước đây, phương pháp điều trị ung thư phổ biến được sử dụng bao gồm phẫu thuật, hóa trị và xạ trị. Đối với một số loại ung thư (như ung thư phổi), điều trị bằng thuốc trúng đích đang được đánh giá là có hiệu quả tốt. Trong những năm gần đây, liệu pháp miễn dịch nổi lên như một phương pháp điều trị ung thư có triển vọng. Liệu pháp sử dụng tế bào miễn dịch tự thân nhận biết ung thư không phải dựa trên đặc điểm giải phẫu hay khả năng phân chia của tế bào ung thư mà dựa vào cơ chế của tế bào miễn dịch dùng để phân biệt mô lành và mô bệnh. Liệu pháp miễn dịch tự thân sử dụng tế bào lympho T là phương pháp hiệu quả để điều trị ung thư dựa vào sự truyền lại cơ thể bệnh nhân tế bào lympho đặc hiệu khối u. Liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư sử dụng tế bào lympho T có những ưu điểm sau: 1) Đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho T rất đặc hiệu, do đó có khả năng phân biệt mô lành và mô ung thư; 2) Tế bào lympho T có thể nhân lên với số lượng lớn, gấp hàng nghìn lần sau khi được hoạt hóa; 3) Đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho T có thể di chuyển đến vị trí của kháng nguyên, có thể ứng dụng để điều trị những khối u đã di căn; 4) Tế bào lympho T có khả năng ghi nhớ, duy trì hiệu quả điều trị trong nhiều năm sau lần điều trị đầu tiên [7]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của tế bào γδT trong giám sát miễn dịch khối u. Những kết quả nghiên cứu trên chuột cho thấy, chuột thiếu hụt tế bào γδT nhạy cảm cao đối với các tác nhân gây ung thư da [8]. Trong các nghiên cứu lâm sàng, tế bào γδT cho thấy có khả năng thâm nhiễm vào nhiều loại khối u, bao gồm ung thư phổi, ung thư thận, ung thư tinh hoàn và ung thư vú. Trên quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tế bào γδT thể hiện tính độc đối với các dòng tế bào ung thư, có khả năng tiết cytokine và tiêu diệt các tế bào ung thư vú, ung thư gan, ung thư buồng trứng hay ung thư đại trực tràng [9-12]. Số lượng tế bào bạch cầu tách được từ 10 ml máu ngoại vi ở bệnh nhân ung thư phổi trung bình là 1,96x104. Điều này được giải thích là do tất cả bệnh nhân trong nghiên cứu đều đang trong giai đoạn bệnh ổn định và chưa hoặc đã dừng điều trị bằng phóng xạ hay hóa chất. Tất cả các mẫu đều đạt tỷ lệ sống của tế bào trên 90%, trung bình 94,8%. Kết quả này tương đồng với những nghiên cứu tăng sinh hoạt hóa tế bào γδT sử dụng biphosphonate kết hợp với cytokine đã được công bố trước đây. Burjanadzé và cộng sự (2007) [13] sử dụng phosphotism hoặc zoldronate kết hợp với IL-2 để nuôi cấy hoạt hóa và tăng sinh γδT trên bệnh nhân u tủy, sau 14 ngày nuôi cấy, thu được 88% tế bào là γδT, số lượng tế bào γδT đạt 2,5x106, mức độ tăng sinh % đ ộc t ín h tế b ào 562(2) 2.2020 Khoa học Y - Dược gấp 300 lần so với ngày đầu nuôi cấy. Tương tự nghiên cứu này, Kondo và cộng sự (2011) [14] cũng sử dụng 5 mM zoledronate và 1.000 IU/ml IL-2, thu được 93,8% tế bào γδT, sau 14 ngày nuôi cấy thu được 2,2x108 tế bào, tăng 13.750 lần so với ngày đầu nuôi cấy. Tanaka và cộng sự (2018) [15] đã sử dụng PTA thay cho zoledronate để hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT trên tế bào ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt. Kết quả cho thấy, sử dụng PTA thu được 5,6x108 tế bào, trong đó 95,6% là tế bào γδT, tăng gấp 7.085 lần so với ngày đầu nuôi cấy. So sánh với các nghiên cứu tương tự trên thế giới cho thấy, quy trình tách chiết, hoạt hóa tăng sinh tế bào γδT áp dụng trong nghiên cứu này có hiệu quả tương đương và chất lượng đảm bảo để thực hiện những nghiên cứu tiếp theo. Để kiểm tra khả năng gây độc của tế bào γδT sau nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh, chúng tôi đã sử dụng phương pháp đo độc tính tế bào [16]. Đồng thời nuôi cấy tế bào γδT thu được với dòng tế bào ung thư phổi H460 theo tỷ lệ số lượng tế bào miễn dịch và tế bào ung thư lần lượt là 1:1, 1:10 và 1:30. Kết quả cho thấy, tế bào γδT sau nuôi cấy có khả năng ly giải tế bào ung thư khi số lượng tế bào miễn dịch γδT nhiều hơn số lượng tế bào ung thư từ 10 lần trở lên. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Kondo và cộng sự (2008) [5] khi nghiên cứu hoạt hóa, tăng sinh số lượng lớn tế bào γδT. Thêm vào đó, kết quả phân tích cho thấy, sau 14 ngày nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh, biểu hiện gen IFNγ ở mức độ mRNA cũng như khả năng tiết cytokine IFNγ ra môi trường nuôi cấy tăng đáng kể so với ngày đầu nuôi cấy. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Kondo và cộng sự (2011) [14] nhận thấy biểu hiện gen IFNγ tăng mạnh trong tế bào γδT sau nuôi cấy. Điều này chứng tỏ tế bào γδT sau nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh có khả năng thể hiện hoạt tính miễn dịch, kháng tế bào ung thư tương tự với tế bào γδT trong cơ thể. Kết luận Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình tách chiết, nuôi cấy hoạt hóa, tăng sinh tế bào γδT tách từ bệnh nhân ung thư phổi. Tế bào thu được sau nuôi cấy đảm bảo đủ số lượng, chất lượng cũng như thể hiện được hoạt tính miễn dịch tương tự như tế bào miễn dịch trong cơ thể. LỜI CẢM ƠN Kết quả của nghiên cứu này thuộc đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu sử dụng tế bào miễn dịch tự thân gamma delta T (γδT) và diệt tự nhiên (NK) trong điều trị ung thư phổi” (7/2018-12/2020) do Trường Đại học Y Hà Nội chủ trì, PGS.TS Trần Huy Thịnh làm chủ nhiệm đề tài. Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, et al. (2018), “Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries”, CA Cancer J. Clin., 68(6), pp.394-424. [2] Global Cancer Observatory, https://gco.iarc.fr/. [3] E.G. Iliopoulou, P. Kountourakis, M.V. Karamouzis, et al. (2010), “A phase I trial of adoptive transfer of allogeneic natural killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer”, Cancer Immunol. Immunother. CII, 59(12), pp.1781-1789. [4] Y.J. Yang, J.C. Park, H.K. Kim, et al. (2013), “A trial of autologous ex vivo-expanded NK cell-enriched lymphocytes with docetaxel in patients with advanced non-small cell lung cancer as second- or third-line treatment: phase IIa study”, Anticancer Res., 33(5), pp.2115-2122. [5] M. Kondo, K. Sakuta, A. Noguchi, et al. (2008), “Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional gammadelta T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy”, Cytotherapy, 10(8), pp.842-856. [6] L. Xiao, C. Chen, Z. Li, et al. (2018), “Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells”, Cytotherapy, 20(3), pp.420-435. [7] K. Perica, J.C. Varela, M. Oelke, et al. (2015), “Adoptive T cell immunotherapy for cancer”, Rambam Maimonides Med. J., 6(1), Doi: 10.5041/RMMJ.10179. [8] M.S. Cruz, A. Diamond, A. Russell, et al. (2018), “Human αβ and γδ T cells in skin immunity and disease”, Front. Immunol., 9, Doi: 10.3389/fimmu.2018.01304. [9] E.S. Morrow, A. Roseweir, J. Edwards (2019), “The role of gamma delta T lymphocytes in breast cancer: a review”, Transl. Res., 203, pp.88-96. [10] W. Tian, J. Ma, R. Shi, et al. (2018), “γδ T cell- mediated individualized immunotherapy for hepatocellular carcinoma considering clinicopathological characteristics and immunosuppressive factors”, Oncol. Lett., 15(4), pp.5433-5442. [11] X. Chen, W. Shang, R. Xu, et al. (2019), “Distribution and functions of γδ T cells infiltrated in the ovarian cancer microenvironment”, J. Transl. Med., 17, article number 144 (2019). [12] T. Ramutton, S. Buccheri, F. Dieli, et al. (2014), “γδ T cells as a potential tool in colon cancer immunotherapy”, Immunotherapy, 6(9), pp.989-999. [13] M. Burjanadzé, M. Condomines, T. Reme, et al. (2007), “In vitro expansion of gamma delta T cells with anti-myeloma cell activity by Phosphostim and IL-2 in patients with multiple myeloma”, Br. J. Haematol., 139(2), pp.206-216. [14] M. Kondo, T. Izumi, N. Fujieda, et al. (2011), “Expansion of human peripheral blood γδ T cells using zoledronate”, J. Vis. Exp., (55), Doi: 10.3791/3182. [15] Y. Tanaka, K. Murata-Hirai, M. Iwasaki, et al. (2018), “Expansion of human γδ T cells for adoptive immunotherapy using a bisphosphonate prodrug”, Cancer Sci., 109(3), pp.587-599. [16] A. Adan, Y. Kiraz, Y. Baran (2016), “Cell proliferation and cytotoxicity assays”, Curr. Pharm. Biotechnol., 17(14), pp.1213- 1221.