Nuôi giữ chủng Angiostrongylus Cantonensis trong phòng thí nghiệm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 47 NUÔI GIỮ CHỦNG ANGIOSTRONGYLUS CANTONENSIS TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM Lê Thị Xuân*, Trần Thị Huệ Vân*, Phạm Thị Lệ Hoa**, Lê Kim Ngọc Giao***, Trần Quang Bính****, Nguyễn Trần Chính** TÓM TẮT Mục đích: Xây dựng qui trình nuôi giữ chủng Angiostrongylus cantonensis trong phòng thí nghiệm. Phương pháp: Chuột Wistar được gây nhiễm qua miệng với ấu trùng giai đoạn 3 (AT-3) bắt được từ ốc sống trong môi trường. Sáu tuần sau nhiễm, ấu trùng giai đoạn 1(AT-1) trong phân chuột được thu hồi bằng kỹ thuật Baermann để gây nhiễm cho ốc Biomphalaria glabrata nuôi trong phòng thí nghiệm với các liều 50 AT/ốc, 100AT/ốc và 200 AT/ốc. Khảo sát tìm ấu trùng và quan sát sự phát triển ấu trùng trên 50 ốc theo thời gian (ngày 3, 5, 7, 9, 11, 15, 20, 24, 28 và 30). AT-3 thu được từ ốc được gây nhiễm cho 20 chuột thế hệ hai. 2/20 chuột lần lượt được khảo sát mỗi tuần để tìm giun ở não, tim và phổi từ tuần thứ 1 đến tuần thứ 10. Phân chuột được gây nhiễm thế hệ 2 được khảo sát tìm AT-1 mỗi tuần từ tuần thứ 3 đến thứ 6. Kết quả: Giun non được phát hiện ở tim và phổi vào tuần thứ 4. AT-1 xuất hiện trong phân chuột gây nhiễm thế hệ hai vào tuần thứ 6. Sự phát triển và hình thái của ấu trùng trên ốc nhiễm giun nuôi trong phòng thí nghiệm theo thời gian tương tự như mô tả trong tự nhiên. Kết luận: Có thể nuôi giữ chủng Angiostrongylus cantonensis trong phòng thí nghiệm. Sự thành công trong việc nuôi giữ chủng Angiostrongylus cantonensis trong phòng thí nghiệm tạo một nguồn mẫu vật dồi dào và ổn định cho các nghiên cứu về Angiostrongylus cantonensis trong tương lai. Từ khoá: Wistar, Biomphalaria glabrata, Angiostrongylus cantonensis ABSTRACT CULTIVATION OF ANGIOSTRONGYLUS CANTONENSIS IN THE LABORATORY CONDITION Le Thi Xuan, Tran Thi Hue Van , Pham Thi Le Hoa, Le Kim Ngoc Giao, Tran Quang Binh, Nguyen Tran Chinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 – 2011: 47 - 54 Objective: To establish the procedure of cultivation Angiostrongylus cantonensis in the laboratory condition. Methods: Wistar rats were orally infected by the third-stage larvae of A. cantonensis collected from snails at their natural environment. Six weeks after infection, the first-stage larvae isolated from fresh feces of these infected rats using Baermann funnel had been infected to Biomphalaria glabrata snails at the dose of 50 larvae/snail, 100 larvae/snail and 200 larvae/snail. The third-staged larvae from these snails were identified, counted and were infected to 6 groups of 20 rats at 6 different doses. The parasites from feces of the rats were counted weekly until 6 weeks after infection. The brain, heart and lungs of these infected rats were dissected weekly to observe the worms until 10 weeks after infection. * Bộ môn Ký sinh trùng, khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh ** Bộ môn Nhiễm, khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh *** Bộ môn Vi sinh, khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh **** Khoa Bệnh Nhiệt Đới, Bệnh viện Chợ Rẫy Địa chỉ liên hệ: PGS.TS Lê Thị Xuân ĐT: Email: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 48 Results: The adult worm were found in heart and lungs of the infected rats at 5 weeks and the first- stage larvae were detected in feces at 6 weeks. The identity of larvae on snails in the laboratory culture during time of observation was similar to the larvae in the natural life cycle. Conclusion: The successful establishment of life cycle of Angiostrongylus cantonensis in laboratory conditions provide a tool for further study. Key words: Wistar, Biomphalaria glabrata, Angiostrongylus cantonensis. MỞ ĐẦU Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis) loại giun gây bệnh trên chuột truyền sang người do ăn uống qua trung gian ốc nhiễm bệnh hay nước chứa ấu trùng. Trên người giun hay gây bệnh lý viêm màng não tăng bạch cầu toan tính. Bệnh lý này đang là chủ đề được quan tâm nhiều ở nhiều nước ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trên thế giới, bệnh do A. cantonensis lưu hành ở một số đảo khu vực Thái Bình Dương, vùng biển Caribê, Đông Á, Đông Nam Á. Tại Đông Nam Á, bệnh thường được báo cáo ở Nhật Bản, Đài Loan và Thái Lan (Wang và cs. 2008) (16). Ở Việt Nam, đã có một số báo cáo về bệnh viêm màng não-não do A. cantonensis ở cả hai miền Bắc và Nam (8,9,10,11). Trong chu trình phát triển, A. cantonensis sống trên hai loại ký chủ là chuột (ký chủ vĩnh viễn chứa giun ở giai đoạn trưởng thành) và ốc (ký chủ trung gian chứa ấu trùng giai đoạn 3). Nhiều lĩnh vực liên quan đến đặc tính sinh học, hình thể, quan hệ ký chủ-ký sinh trùng A. cantonensis đã được nghiên cứu nhưng thường gặp trở ngại chính khi tiến hành các nghiên cứu này là phải tìm nguồn ký sinh trùng trong môi trường tự nhiên, vì vậy thường vất vả, tốn kém, không chủ động được thời gian. Việc chủ động có được nguồn ký sinh trùng đủ dùng và ổn định là khâu quan trọng góp phần vào thành công của nghiên cứu. Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng quy trình và xác định hiệu quả của việc nuôi giữ chủng giun A. cantonensis trong phòng thí nghiệm nhằm phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu. MỤC TIÊU - Xác định liều ký sinh trùng gây nhiễm tối ưu cho chuột và cho ốc - Mô tả sự phát triển của giun trong chuột theo thời gian. Xác định tỷ lệ thu hồi giun sau gây nhiễm và thời gian tối ưu để thu hồi giun trên chuột. - Mô tả sự phát triển của giun trong ốc theo thời gian. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chuột Wistar 6-8 tuần tuổi làm ký chủ vĩnh viễn để quan sát phát triển giun sau gây nhiễm. Ốc Biomphalaria glabrata nuôi trong phòng thí nghiệm, làm ký chủ trung gian để quan sát kết quả gây nhiễm trên ốc; Dung dịch làm tiêu mô HCl-pepsin 1%. Những chuột bị nhiễm bất kỳ một loại ký sinh trùng đường ruột đều bị loại ra. Kỹ thuật Gây nhiễm AT-3 cho chuột bằng ống thông dạ dày qua đường miệng. Thu hồi ấu trùng trong ốc và phân chuột bằng kỹ thuật Baermann. Xác định giống loài và phân loại giai đoạn trưởng thành của giun trưởng thành hay ấu trùng của A. cantonensis dựa vào các đặc điểm hình thái học kinh điển. Để khảo sát sự phát triển của giun trong chuột; xác định tỷ lệ thu hồi giun và thời gian tối ưu để thu hồi giun trên chuột Xác định liều AT-3 gây nhiễm cho chuột: 30 chuột Wistar nặng từ 180 -220g/con được chia thành 6 nhóm (mỗi nhóm 5 chuột), 1 nhóm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 49 chứng và 5 nhóm được gây nhiễm với ấu trùng giai đoạn 3 (AT-3) với liều 50AT-3, 100AT-3, 200AT-3, 400AT-3 và 800AT-3. Sau khi gây nhiễm, chuột được theo dõi và ghi nhận: số lượng chuột sống trong vòng 2 tháng. Phân tích kết quả thu được để xác định liều gây nhiễm cho các thí nghiệm cho các mục tiêu còn lại. Khảo sát sự phát triển của giun trong chuột, xác định tỷ lệ và thời gian tối ưu để thu hồi giun trên chuột: 30 chuột được gây nhiễm với liều được xác định ở giai đoạn trên. Tìm ấu trùng giai đoạn 1 (AT-1) trong phân chuột định kỳ 1 lần/ tuần trong 12 tuần. Quan sát tìm giun trong mô não, tim và phồi chuột mỗi tuần từ tuần thứ 3 đến tuần 12 sau nhiễm. Để xác định liều gây nhiễm thực nghiệm cho ốc, xác định tỷ lệ thu hồi giun và thời gian tối ưu để thu hồi giun trên ốc. Xác định liều AT3 gây nhiễm cho ốc: gây nhiễm cho 120 ốc Biomphalaria glabrata, đường kính 1 -1,5 cm, chia thành 6 nhóm (20 ốc mỗi nhóm), 1 nhóm làm chứng và 5 nhóm được gây nhiễm với các liều 50AT-3, 100AT-3, 200AT-3, 400AT-3, 800AT-3. Theo dõi ốc trong 4 tuần và ghi nhận số ốc sống đến cuối kỳ thực nghiệm. Xác định liều gây nhiễm an toàn cho ốc (ốc nhiễm bệnh vẫn sống và phát triển). Khảo sát sự phát triển của giun trong ốc: gây nhiễm cho 50 ốc với liều được chọn. Theo dõi sự phát triển về hình thái học của ấu trùng trong ốc vào các thời điểm ngày thứ 3, 7, 11, 16, 20, 24 và 30 sau nhiễm. Định danh và giai đoạn phát triển của AT dựa vào phân loại theo Hara và Kojima năm 1990 và của Bộ môn giun sán, Khoa Y học Nhiệt Đới, ĐH Mahidol, Thái Lan. Hara và Kojima năm 1990: AT-1 giai đoạn đầu: di động nhanh, ruột chưa nở rộng; AT-1 giai đoạn giữa : di động chậm, ruột nở rộng, kích thước gia tăng nhẹ; AT-1 giai đoạn cuối: kích thước gia tăng, hình chữ C, khối lượng thực phẩm tăng. AT-2: ấu trùng nằm trong lớp vỏ của lần lột xác đầu. AT-3: ấu trùng nằm trong 2 lớp vỏ của lần lột xác đầu và thứ hai, phần miệng có 2 thể hình que bằng chitin. Phân loại theo tiêu chuẩn của Bộ môn giun sán, Khoa Y học Nhiệt Đới, ĐH Mahidol, Thái Lan: Ấu trùng giai đoạn 1: kích thước từ 0,26- 0,3 x 0,014-0,017mm, đuôi nhọn. Ấu trùng giai đoạn 3: kích thước từ 0,46- 0,52 x 0,029-0,036 mm, miệng có 2 cấu trúc hình que bằng chitin. Thực quản hình ụ phình. Đuôi nhọn. KẾT QUẢ Kết quả gây nhiễm chuột. Liều AT-3 gây nhiễm cho chuột. Số lượng chuột còn sống sau nhiễm được trình bày trong bảng 1 Bảng 1. Tỷ lệ chuột sống sau 3 tháng (n=30): Nhóm chuột Liều gây nhiễm Số chuột sống (%) Chứng 0 5/5 (100) 1 50 5/5 (100) 2 100 3/5 (60) 3 200 2/5 (40) 4 400 0/5 (0) 5 800 0/5 (0) Với liều 800 AT-3, tất cả chuột đều chết trong tuần đầu sau nhiễm. Với liều 400 AT/chuột, chuột chết dần từ tuần thứ 2 đến tuần thứ 4 sau nhiễm. Liều 50 AT3/chuột gây nhiễm cho chuột cho thấy cả 5 chuột đều sống đến cuối đợt thí nghiệm (3 tháng). Chúng tôi chọn liều 50AT3 cho những lần gây nhiễm chuột về sau. Khảo sát sự phát triển của giun trong chuột (n=30) Sau khi gây nhiễm với liều 50AT-3/chuột cho 30 chuột, kết quả tìm ấu trùng giai đoạn 1 trong phân chuột và giun trưởng thành ở tim Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 50 và phổi chuột theo thời gian thể hiện trong bảng 2. Bảng 2: Thời điểm xuất hiện của AT-1 trong phân chuột và giun trong tim và phổi chuột. Thời điểm sau nhiễm (tuần) AT- 1/phân Số lượng giun trưởng thành ở tim và phổi /1 chuột Tổng số Giun đực Giun cái 1 -3 0 0 4 0 11 5 0 24 10 14 6 có 37 17 20 7 có 42 19 23 8 có 44 19 25 9 có 44 22 22 10 có 46 20 26 11 có 48 21 27 12 có 41 20 21 Theo bảng có thể nhận thấy giun có thể phát hiện được ở tim, phổi sớm nhất từ tuần thứ 4 sau nhiễm. Thời điểm AT-1 xuất hiện trong phân muộn hơn trong phổi và tim, sớm nhất vào tuần thứ 6. Số lượng giun thu hồi ở tim và phổi chuột sau nhiễm 4 và 5 tuần còn thấp, sau đó tăng lên và ổn định cho đến cuối đợt quan sát. Số lượng giun cái nhiều hơn giun đực. Kết quả gây nhiễm cho Ốc Liều AT-3 gây nhiễm cho ốc: Kết quả gây nhiễm cho 6 nhóm ốc được trình bày theo bảng 3. Bảng 3: Kết quả gây nhiễm cho ốc (n=120) Nhóm ốc Liều gây nhiễm Số ốc sống (%) Chứng 0 20/20 (100) 1 50 20/20 (100) 2 100 20/20 (100) 3 200 18/20 (90) 4 400 11/20 (55) 5 800 4/20 (20) Liều gây nhiễm 800AT-3 gây 16/20 ốc chết ngay trong vòng 3 ngày đầu sau nhiễm. Nhóm ốc được gây nhiễm với liều 400AT-3, có 11/20 ốc chết rải rác trong 2 tuần. Nhóm gây nhiễm với liều 200AT-3 có 2/20 ốc chết vào tuần thứ 3. Với kết quả trên đây chúng tôi chọn liều gây nhiễm 200AT-3/ốc cho những lần thí nghiệm sau. Khảo sát sự phát triển của giun trong ốc. Theo dõi sự phát triển của ấu trùng trong ốc, chúng tôi nhận thấy : - Ngày 3: AT-1 có ruột như 1 ống hẹp, chưa nở rộng. - Ngày 5: AT-1 có kích thước lớn hơn, hình chữ C, ruột đã nở rộng. - Ngày 7: AT-2 nằm trong lớp vỏ của lần lột xác đầu. - Ngày 11: AT-3 nằm trong 1 lớp vỏ, ở đầu trước có 2 thể hình que bằng chitin. - Ngày 16: AT có 1 vỏ, AT không có vỏ, cả hai đều 2 thể hình que ở đầu - Ngày 20 : AT không vỏ có 2 thể hình que bằng chitin ở đầu - Từ ngày 24 – 30 : AT không vỏ có 2 thể hình que bằng chitin ở đầu, thực quản hình ụ phình và hậu môn thấy rõ. Như vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi thấy ấu trùng lột xác lần đầu vào ngày thứ 7 nhưng số lượng ấu trùng có 1 vỏ ít so với với ấu trùng không có vỏ. Ấu trùng lột xác lần 2 vào ngày thứ 11 có 1 vỏ và có 2 thể hình que ở đầu. Ngày thứ 16, AT có 1 vỏ và AT không vỏ đều có 2 thể hình que ở đầu. Từ ngày 20 đến 30, đa số AT không vỏ với 2 thể hình que ở đầu, thực quản hình ụ phình và hậu môn thấy rõ. Trong quá trình theo dõi, chúng tôi không phát hiện được AT có 2 vỏ. BÀN LUẬN Về kết quả gây nhiễm Chuột Trên thế giới, để gây nhiễm A. cantonensis trong phòng thí nghiệm người ta thường dùng chuột Wistar và chuột Sprague Dawley. Trọng lượng của chuột từ 160 g đến 300 g (20). Trong thí nghiệm của chúng tôi dùng chuột Wistar, trọng lượng của chuột khi gây nhiễm khoảng 200 gram. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 51 Về liều gây nhiễm cho chuột Liều gây nhiễm cho chuột trên thế giới thay đổi tùy tác giả, thông thường từ 15- 150 AT-3/chuột. Bhopale và cs (1985) ghi nhận gây nhiễm với liều cao (10.000 AT/chuột), chuột chết trong vòng 6 ngày và với liều 100 AT/chuột thì không có chuột nào chết cho đến ngày thứ 415 sau nhiễm (2). Theo Kanbara và cs (1988) có thể gây nhiễm cho chuột Wistar 120-150g với liều 150 AT-3 (7). Trong thí nghiệm của Kamiya và cs cho thấy khi gây nhiễm chuột với liều 100 AT thì số giun thu được cao nhất (6). Thí nghiệm của chúng tôi cho thấy liều 50AT-3/chuột là phù hợp vì gây nhiễm và thu hồi được giun nhưng không làm chết chuột. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nhận xét của Yong và Dobson năm 1982 (18). Về thời điểm AT, giun xuất hiện ở não, tim và phổi Theo y văn, AT-3 sẽ lên não sau khi vào ký chủ và sẽ ở đấy cho đến 3 tuần sau và lột xác 2 lần. Sau đó, giun non sẽ theo máu trở về phổi và ký sinh trong động mạch phổi. Chúng tôi ghi nhận AT có mặt ở não một tuần sau nhiễm, đến tuần thứ 5 vẫn còn AT ở não. Khảo sát giun ở tim và phổi, chúng tôi nhận thấy giun xuất hiện từ tuần thứ 4 sau nhiễm, lúc đó giun còn non, giun trưởng thành dần sau một vài tuần. Xét nghiệm phân hàng tuần sau nhiễm, chúng tôi phát hiện được AT-1 vào tuần thứ 6 sau nhiễm. Theo quan sát của Bhopale, AT bắt đầu xuất hiện ở não từ ngày 5, kéo dài đến ngày thứ 21 sau nhiễm. Từ ngày 21, số lượng AT ở não giảm xuống và có một số ít giun đã trở về tim phổi. Ngày 30, AT ở não ít đi và bắt đầu xuất hiện ở tim, phổi. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với tác giả Bhopale và cs (1985) (2). Yoshimura và cs (1976) gây nhiễm cho chuột với liều từ 65-106 AT, đã thấy được AT ở não từ tuần thứ 3 và có giun ở tim phổi và từ tuần thứ 4 sau nhiễm và từ tuần thứ 5 trở đi thì chỉ còn thấy giun ở tim phổi. Từ ngày 30 đến ngày 41, AT hiện diện ở tim và phổi, số giun ở phổi nhiều hơn ở tim. AT-1 xuất hiện trong phân chuột vào từ tuần thứ 6 sau nhiễm (20). Kết quả của nghiên cứu này cũng rất phù hợp với quan sát của Yoshimura như trên. Tỷ lê giun thu hồi trên chuột Trong nghiên cứu này, tỷ lệ giun thu hồi được ở tuần đầu khi giun xuất hiện ở tim phổi là 48%, tỷ lệ này tăng lên vào những tuần sau, tỷ lệ cao nhất là 96%. Trong thí nghiệm của Bhopale và cs (1985): Số lượng AT thu được ở não tối đa vào ngày thứ 5 (35 ± 0,54) với liều nhiễm 100AT/chuột) và duy trì ở mức cao từ ngày tứ 7 đến ngày 21 rồi sau đó giảm dần. Theo Bhopale, với liều 100 AT/chuột cho số lượng giun thu hồi được cao nhất (47%) vào ngày thứ 21 và sau đó giảm nhiều. Tác giả giải thích tỷ lệ thu hồi giun thấp là do không phải tất cả AT từ não đều có thể tìm được đường về tim phổi và hệ miễn dịch của chuột có thể điều chỉnh số lượng AT được đưa vào cơ thể chuột. Liều cao quá sẽ hoạt hóa hệ miễn dịch của chuột để loại bỏ số AT thừa. Tỷ lệ thu hồi giun của chúng tôi cao có thể do chúng tôi chọn liều nhiễm thấp (50AT/chuột) nên phù hợp với sức chịu đựng của chuột (2) . Tỷ lệ giun đực/cái thu hồi được trong tim và phổi chuột Quan sát tỷ lệ giun cái và đực trong phân chuột như bảng 2 cho thấy giun cái thường chiếm nhiều hơn giun đực trên một chuột. Kết quả này cũng đã được ghi nhận bởi các tác giả Yoshimura (1979), Yong và Dobson (1982) và Pipitgool (1997) (19, 17, 12) . Về kết quả gây nhiễm Ốc Các loại ốc là ký chủ trung gian có vai trò đặc biệt quan trọng trong sự lây truyền A. cantonensis trong môi trường là Achatina fulica Pomacea canaliculata và Pila spp. A. fulica được xem là có vai trò quan trọng làm lan tràn giun này khắp thế giới (3, 15, 16, 14). Trong phòng thí nghiệm, ốc thường được dùng làm vật chủ trung gian của A. cantonensis là Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 52 Biomphalaria glabrata, Achatina fulica, Pomacea canaliculata. Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn loài Biomphalaria glabrata, một loại ốc có kích thước nhỏ và sống trong môi trường nước. Liều gây nhiễm cho ốc: Kết quả gây nhiễm thực nghiệm trên ốc của chúng tôi cho thấy kích thước từ 1-1,5 cm với liều AT 1 gây nhiễm từ 50 đến 100 AT/ốc thì 100% ốc, ốc có thể chịu đựng được và sống đến cuối kỳ thực nghiệm. Với liều 200 AT 1/ ốc, tỷ lệ ốc sống là 90,0%. Liều gây nhiễm tăng thêm (400, 800 AT/ốc) thì tỷ lệ ốc sống giảm tương ứng còn 55,0% và 20,0 %. Đặc biệt gây nhiễm với liều lớn (800AT/ốc), ốc chết hàng loạt ngay sau ngày gây nhiễm. Trong nhóm ốc được gây nhiễm với liều 200AT/ốc chỉ có 2 ốc chết vào cuối đợt thí nghiệm, có thể do nguyên nhân khác hơn là do không chịu nổi liều gây nhiễm. Với kết quả trên, chúng tôi chọn liều gây nhiễm cho những thí nghiệm sau là 200AT/ốc. Liều gây nhiễm của chúng tôi thấp hơn nhiều so với 1500 AT 1/ốc Biomphalria glabrata của Kanbara và cs 1988(7). Sự phát triển của ấu trùng trong ốc: Trong ốc, AT-1 sẽ phát triển thành AT-3 sau 2 lần lột xác, gia tăng kích thước và thay đổi cấu tạo. Vì vậy, tiêu chuẩn định danh ấu trùng dựa vào kích thước và một số đặc điểm của từng giai đoạn : Về kích thước ấu trùng: Theo khóa định danh của Bộ môn Giun sán, Khoa Y học nhiệt đới, Đại học Mahidol, AT-1 có kích thước từ 0,26-0,3 x 0,014- 0,017mm và AT-3 từ 0,46-0,52 x 0,029-0,036 mm. Theo Ash (1970), đối với A. cantonensis, kích thước của AT-3 bị ảnh hưởng bởi ít nhất 2 yếu tố: số lượng AT và tuổi của AT trong ốc, chiều dài của AT-3 giao động từ 0,425- 524 mm, trung bình là 0,474 mm; kích thước của một số loại ký sinh trùng có thể giúp ích cho việc phân biệt chúng, nhưng kích thước không phải là một yếu tố đáng tin cậy (1). Về thay đổi hình thể của ấu trùng trong ốc: Quá trình phát triển của A. cantonenesis trong ốc trải qua 2 lần lột xác để tăng trưởng: lần 1 để AT-1 thành AT-2 và lần 2 để AT-2 thành AT-3. Thí nghiệm của chúng tôi cho thấy ấu trùng bắt đầu lột xác lần 1 vào ngày thứ 7. Đến ngày 11 AT có 2 thể hình que bằng chitin. Như vậy, AT-2 xuất hiện vào ngày thứ 7 và AT-3 vào ngày 11 sau nhiễm. Kết quả quan sát của chúng tôi giống như của Alicata (1965): ấu trùng lột xác lần đầu vào ngày thứ 7 và lần thứ 2 vào ngày 12 sau nhiễm. Hata H and Kojima S. (1990) nuôi cấy A. cantonensis in vitro, nhận thấy AT lột xác lần 1 vào ngày 18 và lần 2 vào ngày 23. Tác giả cho rằng A. cantonensis nuôi cấy in vitro phát triển chậm hơn ở trong ký chủ (Hata and Kojima 1990) (5). Chao và cs (1987) nghiên cứu sự phát triển của A. cantonensis trong Ampullarium canaliculatus nhận thấy rằng ấu trùng lột xác lần đầu vào ngày thứ 5 sau nhiễm và lần thứ 2 vào ngày 12 sau nhiễm và có 62,1% phát triển đến AT3 vào ngày 28 sau nhiễm(4). Số lượng vỏ bọc ấu trùng là yếu tố chính để xác định giai đoạn phát triển của A. cantonensis. Tuy nhiên, việc tách ấu trùng ra khỏi thịt ốc bằng kỹ thuật tiêu mô nhân tạo thường làm mất vỏ bọc của ấu trùng vì vậy, AT-2 và AT-3 có thể không có vỏ hoặc có 1 vỏ. Hata và cs (1990) nghiên cứu ấu trùng trong môi trường cấy in vitro nhận thấy AT-3 thường mất vỏ có thể do trong môi trường cấy thiếu chất hoặc có chất gì đó làm cho AT- 3 thường thoát khỏi vỏ (5). Shan và cs (2009) ghi nhận ấu trùng nhanh chóng thoát vỏ khi để chúng trong nước máy và hiện tượng mất vỏ phổ biến khi ấu trùng ở ngoài ký chủ (13). Trong thí nghiệm của chúng tôi, chúng tôi không tìm thấy AT-3 có 2 vỏ, có thể là AT-3 đã mất vỏ. Điều này có thể giải thích là chúng tôi dùng kỹ thuật tiêu mô bằng pepsin-HCl 1% để tách AT ra khỏi thịt ốc nên AT3 bị tác dụng của dịch tiêu mô làm cho mất vỏ. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 53 Về cấu tạo của AT: AT-1 có ruột là một ống mảnh mai, khi được nuôi trong môi trường thích hợp, ruột nở rộng vào ngày 1 và 2 sau nuôi cấy. Theo tác Hata và cs (1990), chỉ những AT-1 có ruột nở rộng mới phát triển đến những giai đoạn sau(5). Như vậy, ruột nở rộng là bước khởi đầu để ấu trùng phát triển. Khi AT-2 có ruột nở rộng sẽ cùng lúc phân chia thành 2 đoạn: thực quản và ruột, có 1 vỏ bọc. Trong thí nghiệm của chúng tôi, ruột của AT-1 đã nở rộng từ ngày thứ 3 sau nhiễm. AT-3 có 2 cấu trúc hình que bằng chitin ở miệng, đây là điểm riêng biệt cho AT-3 (Hata và cs, 1990)(5). Nhưng Shan và cs (2009) lại thấy đầu của AT2 cũng có 2 thể hình que bằng chitin giống AT3 nên đề nghị không xem 2 thể hình que bằng chitin ở đầu AT3 là đặc điểm riêng của AT3(14). Như vậy thời điểm xuất hiện 2 thể hình que bằng chitin đánh dấu bước chuyển từ AT-2 sang AT-3. Chúng tôi ghi nhận được sự xuất hiện 2 thể hình que này ớ AT vào ngày thứ 11 sau nhiễm và chúng tôi xác định ngày thứ 11 sau nhiễm AT- 3 xuất hiện trong ốc. Theo Ash (1970), đối với A. cantonensis yếu tố quan trọng nhất để xác định AT3 là đặc điểm của đuôi: A. cantonensis có đuôi thon nhọn(1). Chúng tôi nhận thấy AT1, AT2 và AT3 của A. cantonensis đều có đuôi nhọn, có lẽ yếu tố này là để phân biệt AT của A. cantonensis với các AT của các loại giun khác. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có thể nuôi giữ chủng A. cantonensis trong phòng thí nghiệm. Đề tài này đã xây dựng được qui trình nuôi A. cantonensis trong phòng thí nghiệm, tạo một nguồn mẫu vật dồi dào và ổn định cho các nghiên cứu về Angiostrongylus cantonensis trong tương lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ash R. L. (1970). "Diagnostic morphology of the third-stage larvae of Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus vasorum, Aelurostrongylus abstrusus and Anafilaroides rostratus (Nematoda : Metastrongyloidea)." The J of Parasitology 56(2): 249-253. 2. Bhopale M. K., Limaye L. S. et al. (1985). "Studies on suspected clinical and experimemtal angiostrongyliasis; serological responses. "J of Hygiene Epidemiology, Micrology and Immunology 29(3): 283-288. 3. Caldeira R., Mendonça C. et al. (2007). "First record of molluscs naturally infected with Angiostrongylus cantonensis (Chen, 1935) (Nematoda: Metastrongylidae) in Brazil." Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 887-889. 4. Chao D., Lin C. et al. (1987). "Studies on growth and distribution of Angiostrongylus cantonensis larvae in Ampullaria canaliculatus." Southeast Asian J Trop Med Pub Health 18(2): 248-52. 5. Hata H. and Kojima S. (1990). "Angiostrongylus cantonensis: in vitro cultivation from the first-sage to infective third-stage larvae." Experimental Parasitology 70: 476-482. 6. Kamiya M. (1970). "Haemagglutination test in rats infected with Angiostrongylus cantonensis." Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth 1: 570. 7. Kanbara T., Ohmono N. et al. (1988). "Local antibody production and immune complex formation in rats experimentally infected with Angiostrongylus cantonensis." Am J.Trop Med Hyg 39(4): 353-360. 8. Lê Thị Xuân, Đoàn Hồng Dung và cs. (2001). "Một trường hợp nhiễm Angiostrongylus cantonensis ở mắt tại TP HCM." Y Học TP.HCM. Chuyên đề Ký sinh trùng 1(4): 97- 100. 9. Lê Thị Xuân, Lê Đỗ Thùy Lan và cs. (2002). "Trường hợp nhiễm Angiostrongyluks cantonensis thứ hai tại thành phố Hồ Chí Minh." Tạp chí Phòng chống Bệnh Sốt rét và các bệnh KST 1: 70-75. 10. Phạm Thị Hải Mến, Nguyễn Trần Chính và cs. (2007). "Viêm màng não do Angiostrongylus cantonensis tại BV Bệnh Nhiệt Đới từ năm 2002-2005 " Y Học TP.Hồ Chí Minh 11(1): 416-421. 11. Phan Trinh, Huỳnh Thúc Thùy, Nguyễn Hữu Bình (1972). "Một trường hợp viêm màng não-não có bạch cầy ưa axit, viêm phế quản –phổi và viêm cơ tim kiểu hạt do Angiostrongylus cantonensis Chen 1935 được xác định qua cuộc điều tra dịch tễ học tại chỗ (Hải Phòng)." Y Học Thực Hành: 175. 12. Pipitgool V., Sithithaworn P., et al. (1997). "Angiostrongylus infection in rats and snails in Northeast Thailand." Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth 28: 190-193. 13. Shan Lv., Zhang Y. et al. (2009). "Invasive snails and an emerging infectious disease: results from the first national survey on Angiostrongylus cantonensis in China." PLoS Negl Trop Dis 3(2): e368. 14. Shan, Lv., Zhang Y., et al. (2009 ). "Angiostrongylus cantonensis: morphological and behavioral investigation within the freshwater snail Pomacea canaliculata. "Parasitol Res 104(6): 1351-9. 15. Shan L., Zhang Y. et al. (2008). "Emerging angiostrongyliasis in Mainland China." Emerg Infect Dis 14(1): 161-4. 16. Wang Q., Lai D. et al. (2008). "Human angiostrongyliasis." Lancet Infect Dis 8: 621-630. 17. Yong, W. K. and C. Dobson (1982). "Antibody responses in rats infected with A. cantonensis and the passive transfer of protectve immunity with immune serum." Z Parasitenkunde 67: 67: 329-336. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 54 18. Yong W.K. and Dobson C. (1982). "The biology of Angiostrongylus cantonensis larvae in immune rats. " Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth 13(2): 244-248. 19. Yoshimura K., Aiba H. et al. (1979). "Acquired resistance and immune responses of eigth strains of inbred rats to infection with Angiostrongylus cantonensis." Jap J vet Sci 41: 245-259. 20. Yoshimura K. and Soulsby J.L. (1976). "Angiostrongylus cantonensis: lymphoid cell responsiveness and antobody production in rats." The American J of Tropical and Hygiene 25(1): 99-107.