Số lượng vỏ bọc ấu trùng là yếu tố chính
để xác định giai đoạn phát triển của A.
cantonensis. Tuy nhiên, việc tách ấu trùng ra
khỏi thịt ốc bằng kỹ thuật tiêu mô nhân tạo
thường làm mất vỏ bọc của ấu trùng vì vậy,
AT-2 và AT-3 có thể không có vỏ hoặc có 1 vỏ.
Hata và cs (1990) nghiên cứu ấu trùng trong
môi trường cấy in vitro nhận thấy AT-3
thường mất vỏ có thể do trong môi trường
cấy thiếu chất hoặc có chất gì đó làm cho AT-
3 thường thoát khỏi vỏ (5). Shan và cs (2009)
ghi nhận ấu trùng nhanh chóng thoát vỏ khi
để chúng trong nước máy và hiện tượng mất
vỏ phổ biến khi ấu trùng ở ngoài ký chủ (13).
Trong thí nghiệm của chúng tôi, chúng tôi
không tìm thấy AT-3 có 2 vỏ, có thể là AT-3
đã mất vỏ. Điều này có thể giải thích là chúng
tôi dùng kỹ thuật tiêu mô bằng pepsin-HCl
1% để tách AT ra khỏi thịt ốc nên AT3 bị tác
dụng của dịch tiêu mô làm cho mất vỏ.
Về cấu tạo của AT: AT-1 có ruột là một
ống mảnh mai, khi được nuôi trong môi
trường thích hợp, ruột nở rộng vào ngày 1 và
2 sau nuôi cấy. Theo tác Hata và cs (1990), chỉ
những AT-1 có ruột nở rộng mới phát triển
đến những giai đoạn sau(5). Như vậy, ruột nở
rộng là bước khởi đầu để ấu trùng phát triển.
Khi AT-2 có ruột nở rộng sẽ cùng lúc phân
chia thành 2 đoạn: thực quản và ruột, có 1 vỏ
bọc. Trong thí nghiệm của chúng tôi, ruột của
AT-1 đã nở rộng từ ngày thứ 3 sau nhiễm.
AT-3 có 2 cấu trúc hình que bằng chitin ở
miệng, đây là điểm riêng biệt cho AT-3 (Hata
và cs, 1990)(5). Nhưng Shan và cs (2009) lại
thấy đầu của AT2 cũng có 2 thể hình que
bằng chitin giống AT3 nên đề nghị không
xem 2 thể hình que bằng chitin ở đầu AT3 là
đặc điểm riêng của AT3(14). Như vậy thời điểm
xuất hiện 2 thể hình que bằng chitin đánh dấu
bước chuyển từ AT-2 sang AT-3. Chúng tôi
ghi nhận được sự xuất hiện 2 thể hình que
này ớ AT vào ngày thứ 11 sau nhiễm và
chúng tôi xác định ngày thứ 11 sau nhiễm AT-
3 xuất hiện trong ốc.
Theo Ash (1970), đối với A. cantonensis yếu
tố quan trọng nhất để xác định AT3 là đặc
điểm của đuôi: A. cantonensis có đuôi thon
nhọn(1). Chúng tôi nhận thấy AT1, AT2 và
AT3 của A. cantonensis đều có đuôi nhọn, có
lẽ yếu tố này là để phân biệt AT của A.
cantonensis với các AT của các loại giun khác.
8 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 26/01/2022 | Lượt xem: 295 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nuôi giữ chủng Angiostrongylus Cantonensis trong phòng thí nghiệm, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 47
NUÔI GIỮ CHỦNG ANGIOSTRONGYLUS CANTONENSIS
TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
Lê Thị Xuân*, Trần Thị Huệ Vân*, Phạm Thị Lệ Hoa**,
Lê Kim Ngọc Giao***, Trần Quang Bính****, Nguyễn Trần Chính**
TÓM TẮT
Mục đích: Xây dựng qui trình nuôi giữ chủng Angiostrongylus cantonensis trong phòng thí nghiệm.
Phương pháp: Chuột Wistar được gây nhiễm qua miệng với ấu trùng giai đoạn 3 (AT-3) bắt được từ
ốc sống trong môi trường. Sáu tuần sau nhiễm, ấu trùng giai đoạn 1(AT-1) trong phân chuột được thu hồi
bằng kỹ thuật Baermann để gây nhiễm cho ốc Biomphalaria glabrata nuôi trong phòng thí nghiệm với các
liều 50 AT/ốc, 100AT/ốc và 200 AT/ốc. Khảo sát tìm ấu trùng và quan sát sự phát triển ấu trùng trên 50
ốc theo thời gian (ngày 3, 5, 7, 9, 11, 15, 20, 24, 28 và 30). AT-3 thu được từ ốc được gây nhiễm cho 20
chuột thế hệ hai. 2/20 chuột lần lượt được khảo sát mỗi tuần để tìm giun ở não, tim và phổi từ tuần thứ 1
đến tuần thứ 10. Phân chuột được gây nhiễm thế hệ 2 được khảo sát tìm AT-1 mỗi tuần từ tuần thứ 3 đến
thứ 6.
Kết quả: Giun non được phát hiện ở tim và phổi vào tuần thứ 4. AT-1 xuất hiện trong phân chuột gây
nhiễm thế hệ hai vào tuần thứ 6. Sự phát triển và hình thái của ấu trùng trên ốc nhiễm giun nuôi trong
phòng thí nghiệm theo thời gian tương tự như mô tả trong tự nhiên.
Kết luận: Có thể nuôi giữ chủng Angiostrongylus cantonensis trong phòng thí nghiệm. Sự thành
công trong việc nuôi giữ chủng Angiostrongylus cantonensis trong phòng thí nghiệm tạo một nguồn mẫu
vật dồi dào và ổn định cho các nghiên cứu về Angiostrongylus cantonensis trong tương lai.
Từ khoá: Wistar, Biomphalaria glabrata, Angiostrongylus cantonensis
ABSTRACT
CULTIVATION OF ANGIOSTRONGYLUS CANTONENSIS IN THE LABORATORY CONDITION
Le Thi Xuan, Tran Thi Hue Van , Pham Thi Le Hoa, Le Kim Ngoc Giao, Tran Quang Binh,
Nguyen Tran Chinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 – 2011: 47 - 54
Objective: To establish the procedure of cultivation Angiostrongylus cantonensis in the laboratory
condition.
Methods: Wistar rats were orally infected by the third-stage larvae of A. cantonensis collected from
snails at their natural environment. Six weeks after infection, the first-stage larvae isolated from fresh feces
of these infected rats using Baermann funnel had been infected to Biomphalaria glabrata snails at the dose of
50 larvae/snail, 100 larvae/snail and 200 larvae/snail. The third-staged larvae from these snails were
identified, counted and were infected to 6 groups of 20 rats at 6 different doses. The parasites from feces of
the rats were counted weekly until 6 weeks after infection. The brain, heart and lungs of these infected rats
were dissected weekly to observe the worms until 10 weeks after infection.
* Bộ môn Ký sinh trùng, khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh
** Bộ môn Nhiễm, khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh
*** Bộ môn Vi sinh, khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh
**** Khoa Bệnh Nhiệt Đới, Bệnh viện Chợ Rẫy
Địa chỉ liên hệ: PGS.TS Lê Thị Xuân ĐT: Email:
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 48
Results: The adult worm were found in heart and lungs of the infected rats at 5 weeks and the first-
stage larvae were detected in feces at 6 weeks. The identity of larvae on snails in the laboratory culture
during time of observation was similar to the larvae in the natural life cycle.
Conclusion: The successful establishment of life cycle of Angiostrongylus cantonensis in laboratory
conditions provide a tool for further study.
Key words: Wistar, Biomphalaria glabrata, Angiostrongylus cantonensis.
MỞ ĐẦU
Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis)
loại giun gây bệnh trên chuột truyền sang
người do ăn uống qua trung gian ốc nhiễm
bệnh hay nước chứa ấu trùng. Trên người
giun hay gây bệnh lý viêm màng não tăng
bạch cầu toan tính. Bệnh lý này đang là chủ
đề được quan tâm nhiều ở nhiều nước ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Trên thế giới, bệnh do A. cantonensis lưu
hành ở một số đảo khu vực Thái Bình Dương,
vùng biển Caribê, Đông Á, Đông Nam Á. Tại
Đông Nam Á, bệnh thường được báo cáo ở
Nhật Bản, Đài Loan và Thái Lan (Wang và cs.
2008) (16). Ở Việt Nam, đã có một số báo cáo
về bệnh viêm màng não-não do A.
cantonensis ở cả hai miền Bắc và Nam (8,9,10,11).
Trong chu trình phát triển, A. cantonensis
sống trên hai loại ký chủ là chuột (ký chủ
vĩnh viễn chứa giun ở giai đoạn trưởng
thành) và ốc (ký chủ trung gian chứa ấu trùng
giai đoạn 3). Nhiều lĩnh vực liên quan đến đặc
tính sinh học, hình thể, quan hệ ký chủ-ký
sinh trùng A. cantonensis đã được nghiên cứu
nhưng thường gặp trở ngại chính khi tiến
hành các nghiên cứu này là phải tìm nguồn ký
sinh trùng trong môi trường tự nhiên, vì vậy
thường vất vả, tốn kém, không chủ động
được thời gian.
Việc chủ động có được nguồn ký sinh
trùng đủ dùng và ổn định là khâu quan trọng
góp phần vào thành công của nghiên cứu.
Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng quy
trình và xác định hiệu quả của việc nuôi giữ
chủng giun A. cantonensis trong phòng thí
nghiệm nhằm phục vụ cho giảng dạy và
nghiên cứu.
MỤC TIÊU
- Xác định liều ký sinh trùng gây nhiễm
tối ưu cho chuột và cho ốc
- Mô tả sự phát triển của giun trong chuột
theo thời gian. Xác định tỷ lệ thu hồi giun sau
gây nhiễm và thời gian tối ưu để thu hồi giun
trên chuột.
- Mô tả sự phát triển của giun trong ốc
theo thời gian.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Chuột Wistar 6-8 tuần tuổi làm ký chủ
vĩnh viễn để quan sát phát triển giun sau gây
nhiễm. Ốc Biomphalaria glabrata nuôi trong
phòng thí nghiệm, làm ký chủ trung gian để
quan sát kết quả gây nhiễm trên ốc; Dung
dịch làm tiêu mô HCl-pepsin 1%. Những
chuột bị nhiễm bất kỳ một loại ký sinh trùng
đường ruột đều bị loại ra.
Kỹ thuật
Gây nhiễm AT-3 cho chuột bằng ống
thông dạ dày qua đường miệng. Thu hồi ấu
trùng trong ốc và phân chuột bằng kỹ thuật
Baermann. Xác định giống loài và phân loại
giai đoạn trưởng thành của giun trưởng thành
hay ấu trùng của A. cantonensis dựa vào các
đặc điểm hình thái học kinh điển.
Để khảo sát sự phát triển của giun trong
chuột; xác định tỷ lệ thu hồi giun và thời
gian tối ưu để thu hồi giun trên chuột
Xác định liều AT-3 gây nhiễm cho chuột: 30
chuột Wistar nặng từ 180 -220g/con được chia
thành 6 nhóm (mỗi nhóm 5 chuột), 1 nhóm
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 49
chứng và 5 nhóm được gây nhiễm với ấu
trùng giai đoạn 3 (AT-3) với liều 50AT-3,
100AT-3, 200AT-3, 400AT-3 và 800AT-3. Sau
khi gây nhiễm, chuột được theo dõi và ghi
nhận: số lượng chuột sống trong vòng 2
tháng. Phân tích kết quả thu được để xác định
liều gây nhiễm cho các thí nghiệm cho các
mục tiêu còn lại.
Khảo sát sự phát triển của giun trong chuột,
xác định tỷ lệ và thời gian tối ưu để thu hồi giun
trên chuột: 30 chuột được gây nhiễm với liều
được xác định ở giai đoạn trên. Tìm ấu trùng
giai đoạn 1 (AT-1) trong phân chuột định kỳ 1
lần/ tuần trong 12 tuần. Quan sát tìm giun
trong mô não, tim và phồi chuột mỗi tuần từ
tuần thứ 3 đến tuần 12 sau nhiễm.
Để xác định liều gây nhiễm thực nghiệm cho
ốc, xác định tỷ lệ thu hồi giun và thời gian
tối ưu để thu hồi giun trên ốc.
Xác định liều AT3 gây nhiễm cho ốc: gây
nhiễm cho 120 ốc Biomphalaria glabrata,
đường kính 1 -1,5 cm, chia thành 6 nhóm (20
ốc mỗi nhóm), 1 nhóm làm chứng và 5 nhóm
được gây nhiễm với các liều 50AT-3, 100AT-3,
200AT-3, 400AT-3, 800AT-3. Theo dõi ốc trong
4 tuần và ghi nhận số ốc sống đến cuối kỳ
thực nghiệm. Xác định liều gây nhiễm an toàn
cho ốc (ốc nhiễm bệnh vẫn sống và
phát triển).
Khảo sát sự phát triển của giun trong ốc: gây
nhiễm cho 50 ốc với liều được chọn. Theo dõi
sự phát triển về hình thái học của ấu trùng
trong ốc vào các thời điểm ngày thứ 3, 7, 11,
16, 20, 24 và 30 sau nhiễm. Định danh và giai
đoạn phát triển của AT dựa vào phân loại
theo Hara và Kojima năm 1990 và của Bộ môn
giun sán, Khoa Y học Nhiệt Đới, ĐH Mahidol,
Thái Lan.
Hara và Kojima năm 1990:
AT-1 giai đoạn đầu: di động nhanh, ruột
chưa nở rộng; AT-1 giai đoạn giữa : di động
chậm, ruột nở rộng, kích thước gia tăng nhẹ;
AT-1 giai đoạn cuối: kích thước gia tăng, hình
chữ C, khối lượng thực phẩm tăng.
AT-2: ấu trùng nằm trong lớp vỏ của lần
lột xác đầu.
AT-3: ấu trùng nằm trong 2 lớp vỏ của lần
lột xác đầu và thứ hai, phần miệng có 2 thể
hình que bằng chitin.
Phân loại theo tiêu chuẩn của Bộ môn giun
sán, Khoa Y học Nhiệt Đới, ĐH Mahidol,
Thái Lan:
Ấu trùng giai đoạn 1: kích thước từ 0,26-
0,3 x 0,014-0,017mm, đuôi nhọn.
Ấu trùng giai đoạn 3: kích thước từ 0,46-
0,52 x 0,029-0,036 mm, miệng có 2 cấu trúc
hình que bằng chitin. Thực quản hình ụ
phình. Đuôi nhọn.
KẾT QUẢ
Kết quả gây nhiễm chuột.
Liều AT-3 gây nhiễm cho chuột.
Số lượng chuột còn sống sau nhiễm được
trình bày trong bảng 1
Bảng 1. Tỷ lệ chuột sống sau 3 tháng (n=30):
Nhóm chuột Liều gây
nhiễm
Số chuột sống (%)
Chứng 0 5/5 (100)
1 50 5/5 (100)
2 100 3/5 (60)
3 200 2/5 (40)
4 400 0/5 (0)
5 800 0/5 (0)
Với liều 800 AT-3, tất cả chuột đều chết
trong tuần đầu sau nhiễm. Với liều 400
AT/chuột, chuột chết dần từ tuần thứ 2 đến
tuần thứ 4 sau nhiễm. Liều 50 AT3/chuột gây
nhiễm cho chuột cho thấy cả 5 chuột đều sống
đến cuối đợt thí nghiệm (3 tháng). Chúng tôi
chọn liều 50AT3 cho những lần gây nhiễm
chuột về sau.
Khảo sát sự phát triển của giun trong chuột
(n=30)
Sau khi gây nhiễm với liều 50AT-3/chuột
cho 30 chuột, kết quả tìm ấu trùng giai đoạn 1
trong phân chuột và giun trưởng thành ở tim
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 50
và phổi chuột theo thời gian thể hiện trong
bảng 2.
Bảng 2: Thời điểm xuất hiện của AT-1 trong phân
chuột và giun trong tim và phổi chuột.
Thời điểm sau
nhiễm (tuần)
AT-
1/phân
Số lượng giun trưởng
thành ở tim và phổi /1
chuột
Tổng số Giun
đực
Giun cái
1 -3 0 0
4 0 11
5 0 24 10 14
6 có 37 17 20
7 có 42 19 23
8 có 44 19 25
9 có 44 22 22
10 có 46 20 26
11 có 48 21 27
12 có 41 20 21
Theo bảng có thể nhận thấy giun có thể
phát hiện được ở tim, phổi sớm nhất từ tuần
thứ 4 sau nhiễm. Thời điểm AT-1 xuất hiện
trong phân muộn hơn trong phổi và tim, sớm
nhất vào tuần thứ 6. Số lượng giun thu hồi ở
tim và phổi chuột sau nhiễm 4 và 5 tuần còn
thấp, sau đó tăng lên và ổn định cho đến cuối
đợt quan sát. Số lượng giun cái nhiều hơn
giun đực.
Kết quả gây nhiễm cho Ốc
Liều AT-3 gây nhiễm cho ốc:
Kết quả gây nhiễm cho 6 nhóm ốc được
trình bày theo bảng 3.
Bảng 3: Kết quả gây nhiễm cho ốc (n=120)
Nhóm ốc Liều gây nhiễm Số ốc sống (%)
Chứng 0 20/20 (100)
1 50 20/20 (100)
2 100 20/20 (100)
3 200 18/20 (90)
4 400 11/20 (55)
5 800 4/20 (20)
Liều gây nhiễm 800AT-3 gây 16/20 ốc chết
ngay trong vòng 3 ngày đầu sau nhiễm.
Nhóm ốc được gây nhiễm với liều 400AT-3,
có 11/20 ốc chết rải rác trong 2 tuần. Nhóm
gây nhiễm với liều 200AT-3 có 2/20 ốc chết
vào tuần thứ 3. Với kết quả trên đây chúng tôi
chọn liều gây nhiễm 200AT-3/ốc cho những
lần thí nghiệm sau.
Khảo sát sự phát triển của giun trong ốc.
Theo dõi sự phát triển của ấu trùng trong
ốc, chúng tôi nhận thấy :
- Ngày 3: AT-1 có ruột như 1 ống hẹp,
chưa nở rộng.
- Ngày 5: AT-1 có kích thước lớn hơn,
hình chữ C, ruột đã nở rộng.
- Ngày 7: AT-2 nằm trong lớp vỏ của lần
lột xác đầu.
- Ngày 11: AT-3 nằm trong 1 lớp vỏ, ở
đầu trước có 2 thể hình que bằng chitin.
- Ngày 16: AT có 1 vỏ, AT không có vỏ, cả
hai đều 2 thể hình que ở đầu
- Ngày 20 : AT không vỏ có 2 thể hình que
bằng chitin ở đầu
- Từ ngày 24 – 30 : AT không vỏ có 2 thể
hình que bằng chitin ở đầu, thực quản hình ụ
phình và hậu môn thấy rõ.
Như vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi
thấy ấu trùng lột xác lần đầu vào ngày thứ 7
nhưng số lượng ấu trùng có 1 vỏ ít so với với
ấu trùng không có vỏ. Ấu trùng lột xác lần 2
vào ngày thứ 11 có 1 vỏ và có 2 thể hình que
ở đầu. Ngày thứ 16, AT có 1 vỏ và AT không
vỏ đều có 2 thể hình que ở đầu.
Từ ngày 20 đến 30, đa số AT không vỏ với
2 thể hình que ở đầu, thực quản hình ụ phình
và hậu môn thấy rõ. Trong quá trình theo dõi,
chúng tôi không phát hiện được AT có 2 vỏ.
BÀN LUẬN
Về kết quả gây nhiễm Chuột
Trên thế giới, để gây nhiễm A. cantonensis
trong phòng thí nghiệm người ta thường
dùng chuột Wistar và chuột Sprague Dawley.
Trọng lượng của chuột từ 160 g đến 300 g (20).
Trong thí nghiệm của chúng tôi dùng chuột
Wistar, trọng lượng của chuột khi gây nhiễm
khoảng 200 gram.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 51
Về liều gây nhiễm cho chuột
Liều gây nhiễm cho chuột trên thế giới
thay đổi tùy tác giả, thông thường từ 15- 150
AT-3/chuột. Bhopale và cs (1985) ghi nhận gây
nhiễm với liều cao (10.000 AT/chuột), chuột
chết trong vòng 6 ngày và với liều 100
AT/chuột thì không có chuột nào chết cho đến
ngày thứ 415 sau nhiễm (2). Theo Kanbara và
cs (1988) có thể gây nhiễm cho chuột Wistar
120-150g với liều 150 AT-3 (7). Trong thí
nghiệm của Kamiya và cs cho thấy khi gây
nhiễm chuột với liều 100 AT thì số giun thu
được cao nhất (6). Thí nghiệm của chúng tôi
cho thấy liều 50AT-3/chuột là phù hợp vì gây
nhiễm và thu hồi được giun nhưng không làm
chết chuột. Kết quả của chúng tôi phù hợp với
nhận xét của Yong và Dobson năm 1982 (18).
Về thời điểm AT, giun xuất hiện ở não, tim
và phổi
Theo y văn, AT-3 sẽ lên não sau khi vào ký
chủ và sẽ ở đấy cho đến 3 tuần sau và lột xác
2 lần. Sau đó, giun non sẽ theo máu trở về
phổi và ký sinh trong động mạch phổi. Chúng
tôi ghi nhận AT có mặt ở não một tuần sau
nhiễm, đến tuần thứ 5 vẫn còn AT ở não.
Khảo sát giun ở tim và phổi, chúng tôi
nhận thấy giun xuất hiện từ tuần thứ 4 sau
nhiễm, lúc đó giun còn non, giun trưởng
thành dần sau một vài tuần.
Xét nghiệm phân hàng tuần sau nhiễm,
chúng tôi phát hiện được AT-1 vào tuần thứ 6
sau nhiễm.
Theo quan sát của Bhopale, AT bắt đầu
xuất hiện ở não từ ngày 5, kéo dài đến ngày
thứ 21 sau nhiễm. Từ ngày 21, số lượng AT ở
não giảm xuống và có một số ít giun đã trở về
tim phổi. Ngày 30, AT ở não ít đi và bắt đầu
xuất hiện ở tim, phổi. Kết quả của chúng tôi
cũng phù hợp với tác giả Bhopale và cs (1985)
(2). Yoshimura và cs (1976) gây nhiễm cho
chuột với liều từ 65-106 AT, đã thấy được AT
ở não từ tuần thứ 3 và có giun ở tim phổi và
từ tuần thứ 4 sau nhiễm và từ tuần thứ 5 trở
đi thì chỉ còn thấy giun ở tim phổi. Từ ngày
30 đến ngày 41, AT hiện diện ở tim và phổi,
số giun ở phổi nhiều hơn ở tim. AT-1 xuất
hiện trong phân chuột vào từ tuần thứ 6 sau
nhiễm (20). Kết quả của nghiên cứu này cũng
rất phù hợp với quan sát của Yoshimura như
trên.
Tỷ lê giun thu hồi trên chuột
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ giun thu hồi
được ở tuần đầu khi giun xuất hiện ở tim phổi
là 48%, tỷ lệ này tăng lên vào những tuần sau,
tỷ lệ cao nhất là 96%. Trong thí nghiệm của
Bhopale và cs (1985): Số lượng AT thu được ở
não tối đa vào ngày thứ 5 (35 ± 0,54) với liều
nhiễm 100AT/chuột) và duy trì ở mức cao từ
ngày tứ 7 đến ngày 21 rồi sau đó giảm dần.
Theo Bhopale, với liều 100 AT/chuột cho số
lượng giun thu hồi được cao nhất (47%) vào
ngày thứ 21 và sau đó giảm nhiều. Tác giả
giải thích tỷ lệ thu hồi giun thấp là do không
phải tất cả AT từ não đều có thể tìm được
đường về tim phổi và hệ miễn dịch của chuột
có thể điều chỉnh số lượng AT được đưa vào
cơ thể chuột. Liều cao quá sẽ hoạt hóa hệ
miễn dịch của chuột để loại bỏ số AT thừa. Tỷ
lệ thu hồi giun của chúng tôi cao có thể do
chúng tôi chọn liều nhiễm thấp (50AT/chuột)
nên phù hợp với sức chịu đựng của chuột (2) .
Tỷ lệ giun đực/cái thu hồi được trong tim và
phổi chuột
Quan sát tỷ lệ giun cái và đực trong phân
chuột như bảng 2 cho thấy giun cái thường
chiếm nhiều hơn giun đực trên một chuột. Kết
quả này cũng đã được ghi nhận bởi các tác giả
Yoshimura (1979), Yong và Dobson (1982) và
Pipitgool (1997) (19, 17, 12) .
Về kết quả gây nhiễm Ốc
Các loại ốc là ký chủ trung gian có vai trò
đặc biệt quan trọng trong sự lây truyền A.
cantonensis trong môi trường là Achatina
fulica Pomacea canaliculata và Pila spp. A.
fulica được xem là có vai trò quan trọng làm
lan tràn giun này khắp thế giới (3, 15, 16, 14). Trong
phòng thí nghiệm, ốc thường được dùng làm
vật chủ trung gian của A. cantonensis là
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 52
Biomphalaria glabrata, Achatina fulica,
Pomacea canaliculata. Trong thí nghiệm này,
chúng tôi chọn loài Biomphalaria glabrata,
một loại ốc có kích thước nhỏ và sống trong
môi trường nước.
Liều gây nhiễm cho ốc:
Kết quả gây nhiễm thực nghiệm trên ốc
của chúng tôi cho thấy kích thước từ 1-1,5 cm
với liều AT 1 gây nhiễm từ 50 đến 100 AT/ốc
thì 100% ốc, ốc có thể chịu đựng được và sống
đến cuối kỳ thực nghiệm. Với liều 200 AT 1/
ốc, tỷ lệ ốc sống là 90,0%. Liều gây nhiễm
tăng thêm (400, 800 AT/ốc) thì tỷ lệ ốc sống
giảm tương ứng còn 55,0% và 20,0 %. Đặc biệt
gây nhiễm với liều lớn (800AT/ốc), ốc chết
hàng loạt ngay sau ngày gây nhiễm. Trong
nhóm ốc được gây nhiễm với liều 200AT/ốc
chỉ có 2 ốc chết vào cuối đợt thí nghiệm, có
thể do nguyên nhân khác hơn là do không
chịu nổi liều gây nhiễm. Với kết quả trên,
chúng tôi chọn liều gây nhiễm cho những thí
nghiệm sau là 200AT/ốc. Liều gây nhiễm của
chúng tôi thấp hơn nhiều so với 1500 AT 1/ốc
Biomphalria glabrata của Kanbara và cs
1988(7).
Sự phát triển của ấu trùng trong ốc:
Trong ốc, AT-1 sẽ phát triển thành AT-3
sau 2 lần lột xác, gia tăng kích thước và thay
đổi cấu tạo. Vì vậy, tiêu chuẩn định danh ấu
trùng dựa vào kích thước và một số đặc điểm
của từng giai đoạn :
Về kích thước ấu trùng:
Theo khóa định danh của Bộ môn Giun
sán, Khoa Y học nhiệt đới, Đại học Mahidol,
AT-1 có kích thước từ 0,26-0,3 x 0,014-
0,017mm và AT-3 từ 0,46-0,52 x 0,029-0,036
mm. Theo Ash (1970), đối với A. cantonensis,
kích thước của AT-3 bị ảnh hưởng bởi ít nhất
2 yếu tố: số lượng AT và tuổi của AT trong ốc,
chiều dài của AT-3 giao động từ 0,425- 524
mm, trung bình là 0,474 mm; kích thước của
một số loại ký sinh trùng có thể giúp ích cho
việc phân biệt chúng, nhưng kích thước
không phải là một yếu tố đáng tin cậy (1).
Về thay đổi hình thể của ấu trùng trong ốc:
Quá trình phát triển của A. cantonenesis
trong ốc trải qua 2 lần lột xác để tăng trưởng:
lần 1 để AT-1 thành AT-2 và lần 2 để AT-2
thành AT-3. Thí nghiệm của chúng tôi cho
thấy ấu trùng bắt đầu lột xác lần 1 vào ngày
thứ 7. Đến ngày 11 AT có 2 thể hình que bằng
chitin. Như vậy, AT-2 xuất hiện vào ngày thứ
7 và AT-3 vào ngày 11 sau nhiễm. Kết quả
quan sát của chúng tôi giống như của Alicata
(1965): ấu trùng lột xác lần đầu vào ngày thứ 7
và lần thứ 2 vào ngày 12 sau nhiễm. Hata H
and Kojima S. (1990) nuôi cấy A. cantonensis in
vitro, nhận thấy AT lột xác lần 1 vào ngày 18
và lần 2 vào ngày 23. Tác giả cho rằng A.
cantonensis nuôi cấy in vitro phát triển chậm
hơn ở trong ký chủ (Hata and Kojima 1990) (5).
Chao và cs (1987) nghiên cứu sự phát triển
của A. cantonensis trong Ampullarium
canaliculatus nhận thấy rằng ấu trùng lột xác
lần đầu vào ngày thứ 5 sau nhiễm và lần thứ 2
vào ngày 12 sau nhiễm và có 62,1% phát triển
đến AT3 vào ngày 28 sau nhiễm(4).
Số lượng vỏ bọc ấu trùng là yếu tố chính
để xác định giai đoạn phát triển của A.
cantonensis. Tuy nhiên, việc tách ấu trùng ra
khỏi thịt ốc bằng kỹ thuật tiêu mô nhân tạo
thường làm mất vỏ bọc của ấu trùng vì vậy,
AT-2 và AT-3 có thể không có vỏ hoặc có 1 vỏ.
Hata và cs (1990) nghiên cứu ấu trùng trong
môi trường cấy in vitro nhận thấy AT-3
thường mất vỏ có thể do trong môi trường
cấy thiếu chất hoặc có chất gì đó làm cho AT-
3 thường thoát khỏi vỏ (5). Shan và cs (2009)
ghi nhận ấu trùng nhanh chóng thoát vỏ khi
để chúng trong nước máy và hiện tượng mất
vỏ phổ biến khi ấu trùng ở ngoài ký chủ (13).
Trong thí nghiệm của chúng tôi, chúng tôi
không tìm thấy AT-3 có 2 vỏ, có thể là AT-3
đã mất vỏ. Điều này có thể giải thích là chúng
tôi dùng kỹ thuật tiêu mô bằng pepsin-HCl
1% để tách AT ra khỏi thịt ốc nên AT3 bị tác
dụng của dịch tiêu mô làm cho mất vỏ.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 53
Về cấu tạo của AT: AT-1 có ruột là một
ống mảnh mai, khi được nuôi trong môi
trường thích hợp, ruột nở rộng vào ngày 1 và
2 sau nuôi cấy. Theo tác Hata và cs (1990), chỉ
những AT-1 có ruột nở rộng mới phát triển
đến những giai đoạn sau(5). Như vậy, ruột nở
rộng là bước khởi đầu để ấu trùng phát triển.
Khi AT-2 có ruột nở rộng sẽ cùng lúc phân
chia thành 2 đoạn: thực quản và ruột, có 1 vỏ
bọc. Trong thí nghiệm của chúng tôi, ruột của
AT-1 đã nở rộng từ ngày thứ 3 sau nhiễm.
AT-3 có 2 cấu trúc hình que bằng chitin ở
miệng, đây là điểm riêng biệt cho AT-3 (Hata
và cs, 1990)(5). Nhưng Shan và cs (2009) lại
thấy đầu của AT2 cũng có 2 thể hình que
bằng chitin giống AT3 nên đề nghị không
xem 2 thể hình que bằng chitin ở đầu AT3 là
đặc điểm riêng của AT3(14). Như vậy thời điểm
xuất hiện 2 thể hình que bằng chitin đánh dấu
bước chuyển từ AT-2 sang AT-3. Chúng tôi
ghi nhận được sự xuất hiện 2 thể hình que
này ớ AT vào ngày thứ 11 sau nhiễm và
chúng tôi xác định ngày thứ 11 sau nhiễm AT-
3 xuất hiện trong ốc.
Theo Ash (1970), đối với A. cantonensis yếu
tố quan trọng nhất để xác định AT3 là đặc
điểm của đuôi: A. cantonensis có đuôi thon
nhọn(1). Chúng tôi nhận thấy AT1, AT2 và
AT3 của A. cantonensis đều có đuôi nhọn, có
lẽ yếu tố này là để phân biệt AT của A.
cantonensis với các AT của các loại giun khác.
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho
thấy có thể nuôi giữ chủng A. cantonensis
trong phòng thí nghiệm. Đề tài này đã xây
dựng được qui trình nuôi A. cantonensis trong
phòng thí nghiệm, tạo một nguồn mẫu vật dồi
dào và ổn định cho các nghiên cứu về
Angiostrongylus cantonensis trong tương lai.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ash R. L. (1970). "Diagnostic morphology of the third-stage
larvae of Angiostrongylus cantonensis, Angiostrongylus
vasorum, Aelurostrongylus abstrusus and Anafilaroides
rostratus (Nematoda : Metastrongyloidea)." The J of
Parasitology 56(2): 249-253.
2. Bhopale M. K., Limaye L. S. et al. (1985). "Studies on
suspected clinical and experimemtal angiostrongyliasis;
serological responses. "J of Hygiene Epidemiology,
Micrology and Immunology 29(3): 283-288.
3. Caldeira R., Mendonça C. et al. (2007). "First record of
molluscs naturally infected with Angiostrongylus
cantonensis (Chen, 1935) (Nematoda: Metastrongylidae) in
Brazil." Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 887-889.
4. Chao D., Lin C. et al. (1987). "Studies on growth and
distribution of Angiostrongylus cantonensis larvae in
Ampullaria canaliculatus." Southeast Asian J Trop Med Pub
Health 18(2): 248-52.
5. Hata H. and Kojima S. (1990). "Angiostrongylus
cantonensis: in vitro cultivation from the first-sage to
infective third-stage larvae." Experimental Parasitology 70:
476-482.
6. Kamiya M. (1970). "Haemagglutination test in rats infected
with Angiostrongylus cantonensis." Southeast Asian J Trop
Med Pub Hlth 1: 570.
7. Kanbara T., Ohmono N. et al. (1988). "Local antibody
production and immune complex formation in rats
experimentally infected with Angiostrongylus cantonensis."
Am J.Trop Med Hyg 39(4): 353-360.
8. Lê Thị Xuân, Đoàn Hồng Dung và cs. (2001). "Một trường
hợp nhiễm Angiostrongylus cantonensis ở mắt tại TP
HCM." Y Học TP.HCM. Chuyên đề Ký sinh trùng 1(4): 97-
100.
9. Lê Thị Xuân, Lê Đỗ Thùy Lan và cs. (2002). "Trường hợp
nhiễm Angiostrongyluks cantonensis thứ hai tại thành phố
Hồ Chí Minh." Tạp chí Phòng chống Bệnh Sốt rét và các
bệnh KST 1: 70-75.
10. Phạm Thị Hải Mến, Nguyễn Trần Chính và cs. (2007).
"Viêm màng não do Angiostrongylus cantonensis tại BV
Bệnh Nhiệt Đới từ năm 2002-2005 " Y Học TP.Hồ Chí Minh
11(1): 416-421.
11. Phan Trinh, Huỳnh Thúc Thùy, Nguyễn Hữu Bình (1972).
"Một trường hợp viêm màng não-não có bạch cầy ưa axit,
viêm phế quản –phổi và viêm cơ tim kiểu hạt do
Angiostrongylus cantonensis Chen 1935 được xác định qua
cuộc điều tra dịch tễ học tại chỗ (Hải Phòng)." Y Học Thực
Hành: 175.
12. Pipitgool V., Sithithaworn P., et al. (1997). "Angiostrongylus
infection in rats and snails in Northeast Thailand." Southeast
Asian J Trop Med Pub Hlth 28: 190-193.
13. Shan Lv., Zhang Y. et al. (2009). "Invasive snails and an
emerging infectious disease: results from the first national
survey on Angiostrongylus cantonensis in China." PLoS
Negl Trop Dis 3(2): e368.
14. Shan, Lv., Zhang Y., et al. (2009 ). "Angiostrongylus
cantonensis: morphological and behavioral investigation
within the freshwater snail Pomacea canaliculata. "Parasitol
Res 104(6): 1351-9.
15. Shan L., Zhang Y. et al. (2008). "Emerging angiostrongyliasis
in Mainland China." Emerg Infect Dis 14(1): 161-4.
16. Wang Q., Lai D. et al. (2008). "Human angiostrongyliasis."
Lancet Infect Dis 8: 621-630.
17. Yong, W. K. and C. Dobson (1982). "Antibody responses in
rats infected with A. cantonensis and the passive transfer of
protectve immunity with immune serum." Z
Parasitenkunde 67: 67: 329-336.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 54
18. Yong W.K. and Dobson C. (1982). "The biology of
Angiostrongylus cantonensis larvae in immune rats. "
Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth 13(2): 244-248.
19. Yoshimura K., Aiba H. et al. (1979). "Acquired resistance
and immune responses of eigth strains of inbred rats to
infection with Angiostrongylus cantonensis." Jap J vet Sci 41:
245-259.
20. Yoshimura K. and Soulsby J.L. (1976). "Angiostrongylus
cantonensis: lymphoid cell responsiveness and antobody
production in rats." The American J of Tropical and Hygiene
25(1): 99-107.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- nuoi_giu_chung_angiostrongylus_cantonensis_trong_phong_thi_n.pdf