Nuôi trồng và xác định thành phẩn amino acid của một số loài nấm bào ngư (pleurotus spp) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography - Hplc)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: ĐOÀN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƢ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐOÀN BẢO QUỐC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii LỜI CẢM TẠ CHÂN THÀNH CẢM ƠN: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Bộ môn Bảo vệ Thực vật Quí thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, Thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Cô Trần Thị Dung, Thầy Lƣu Phúc Lợi, Thầy Nguyễn Văn Cƣờng, Anh Mai Huy Hoàng đã giúp tôi có trang thiết bị cũng nhƣ phòng thí nghiệm để hoàn thành khóa luận. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hòan thành khóa luận. Anh Lê Viết Ngọc Viện hạt nhân Đà Lạt, anh Hoàng trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã cung cấp giống nấm bào ngƣ cho tôi thực hiện khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iii TÓM TẮT Đoàn Bảo Quốc, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ Pleurotus spp. bằng sắc ký lỏng cao áp - high performance liqud chromatography (HPLC) thời gian từ 14/2/2005 đến 18/8/2005. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. Lê Đình Đôn Khóa luận đƣợc thực hiện trên đối tƣợng nấm bào ngƣ Pleurotus spp.. Đây là loại nấm rất phổ biến trên thị trƣờng Việt Nam. Vì thế, thành phần dinh dƣỡng của chúng, đặc biệt là thành phần amino acid rất đƣợc quan tâm. Để thực hiện phân tích amino acid trên nấm, chúng tôi tiến hành trồng nấm tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học và sử dụng thiết bị là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Trung tâm Hóa Lý đều thuộc Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Những kết quả đạt đƣợc: Nuôi trồng đƣợc 4 dòng nấm Pleurotus spp. trên cơ chất là mùn cƣa có bổ sung thêm cám gạo, và một số chất khác. Phân tích và định lƣợng đƣợc 17 amino acid trong 2 loài nấm Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius. Từ đó chúng tôi tiến hành so sánh thành phần amino acid của chúng với một số rau quả khác, với một số nấm khác và so sánh giữa chúng. iv MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ta ................................................................................................................ i Tóm tắt .................................................................................................................... ii Mục lục .................................................................................................................. iii Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... vi Danh sách các hình ............................................................................................... vii Danh sách các bảng ............................................................................................. viii 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................... 1 1.2. Mục đích ............................................................................................ 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................ 1.4. Nội dung thực hiện ............................................................................ 2 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3 2.1. Nấm trồng .......................................................................................... 3 2.1.1. Khái niệm về nấm ........................................................................ 3 2.1.2. Sinh sản và chu trình sống ........................................................... 5 2.1.3.. Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý ................................................. 7 2.2. Nấm bào ngƣ ...................................................................................... 8 2.2.1. Giới thiệu ..................................................................................... 8 2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam .............. 9 2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus florida ........................................ 10 2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor-caju ................................... 10 2.2.2.3. Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius ............................... 11 2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus ..................................... 11 2.3. Phƣơng pháp sắc ký ......................................................................... 12 2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký ................................. 12 2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký .................................................. 12 2.4. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tich amino acid ................. 13 v 2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) ......................................... 13 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) ............. 14 2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ................ 15 2.4.3.1. Pha tĩnh .............................................................................. 15 2.4.3.2. Pha động ............................................................................ 16 2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC ............................................................. 16 2.5. Các bƣớc phân tích amino acid ....................................................... 17 2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) .............................................. 17 2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) .................................... 19 2.5.3. Phân tách trên HPLC ................................................................. 20 2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu .................................................... 21 2.4.4.1. Định tính ............................................................................ 21 2.4.4.2. Định lƣợng ......................................................................... 21 2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ .......................................... 23 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 23 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................... 23 3.1.1. Thời gian thực hiện ................................................................... 23 3.1.2 .Địa điểm ..................................................................................... 23 3.1.3.Vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 23 3.2. Hóa chất và dụng cụ ........................................................................ 23 3.2.1. Hóa chất ..................................................................................... 23 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..................................................................... 24 3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm ........................................... 24 3.3.1. Môi trƣờng ................................................................................. 24 3.3.2. Phƣơng pháp .............................................................................. 24 3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA ............................................... 24 3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt ................................................... 24 3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi ........................................... 25 3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng ........................................ 25 3.2.2.5. Tóm tắt quy trình ............................................................... 26 3.3.3. Phân tích amino acid .................................................................. 26 3.3.3.1.Thủy phân mẫu ................................................................... 26 vi 3.3.3.2. Tạo dẫn xuất: ..................................................................... 27 3.3.3.3. Phân tích HPLC ................................................................. 28 3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả ........................................... 28 4.. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 29 4.1. Kết quả ............................................................................................. 29 4.1.1. Kết quả trồng nấm ...................................................................... 29 4.1.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng ................. 29 4.1.1.2. Sự hình thành quả thể ........................................................ 30 4.1.2. Kết quả phân tích amino acid .................................................... 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 35 5.1. Kết luận ............................................................................................ 35 5.2. Đề nghị............................................................................................. 35 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 36 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN:Acetonitril HPLC: High performance liquid chromatography TLC: Thin layer chromatography PITC: phenylisothiocyanate PTC: phenylisocarbamyl TEA: Triethylamine. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH .......................................................................................................... TRANG Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm ................................................................................ 3 Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm...................................................................... 6 Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius ......................................................................... 11 Hình 2.4. Pleurotus abalonus ............................................................................... 11 Hình 2.5 Pleurotus sp .......................................................................................... 11 Hình 2.6. Pleurotus floridanus ............................................................................. 11 Hình 2.7. Mô hình sắc ký giấy ............................................................................. 14 Hình 2.8. Mô hình sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 14 Hình 2.9. Bộ dụng cụ HPLC ................................................................................ 16 Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl .............................................................. 18 Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC .................................................. 20 Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bởi sắc ký giấy tròn ..... 22 Hình 4.1. Sinh trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus .......................................................................... 31 Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên giá mô .................................................................. 31 Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus ................................................................... 31 Hình 4.4. Bào tử đảm Pleurotus floridanus ...................................................................................... 31 Hình 4 .5. Bào tử đảm Pleurotus abalonus ...................................................................................... 31 Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus ........................................................ 32 Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus ......................................................... 32 Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus ........................................................ 32 Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius .................................................... 32 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG ......................................................................................................... TRANG Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ .................................. 10 Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản ........................................................................ 13 Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy thiết bị của các dòng nấm ................................... 29 Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các dòng nấm ..................................................... 30 Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus .. 33 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, nấm bào ngƣ đang dần trở thành một trong những khẩu phần chính trong bữa ăn của ngƣời dân. Bên cạnh mùi vị thơm ngon, giàu dinh dƣỡng, rất dễ chế biến, nấm còn đƣợc xem nhƣ là một loại “rau sạch” và có giá trị dƣợc liệu. Sản lƣợng nấm bào ngƣ tăng lên rất nhanh trong vài thập kỷ qua. Theo thống kê của Chang và ctv (1999) chỉ trong vòng 36 năm trở lại đây tổng sản lƣợng nấm trồng tăng gấp 21 lần từ 350.000 năm 1965 tăng lên 7,5 triệu tấn, trong đó nấm bào ngƣ Pleurotus spp. tăng từ 169000 tấn năm 1986 lên 876000 tấn năm1997. Gần đây, Việt Nam cũng đang phát triển công nghệ trồng nấm trong nƣớc. Vì thế, ngoài việc khai thác nấm hoang dại đem về trồng, nƣớc ta còn nhập khẩu nhiều loại nấm bào ngƣ khác từ nƣớc ngoài nhƣ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản. Trong số đó, có một số loài đã đƣợc biết rất rõ về thành phần dinh dƣỡng, một số loài còn lại thành phần này vẫn chƣa đƣợc công bố chính thức, đặc biệt là thành phần amino acid. Vì thế, việc xác định thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đối với Việt Nam là điều cần thiết để có thể đánh giá giá trị sinh học, cũng nhƣ so sánh sự khác nhau giữa chúng. Từ xƣa đến nay, việc xác định amino acid đã đƣợc thực hiện trên rất nhiều công cụ khác nhau nhƣ: sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng. Phân tích amino acid trên các công cụ phân tích truyền thống này thì đòi hỏi nhiều thời gian và rất phức tạp. Ngày nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, việc xác định thành phần amino acid trong mẫu sinh hóa đã đƣợc đơn giản hơn rất nhiều, bởi hầu hết các công cụ đã đƣợc tự động hóa và đƣợc nối trực tiếp bộ phận xử lý số liệu. Hiện nay, trên thị trƣờng đang tồn tại rất nhiều kỹ thuật phân tích amino acid nhƣ: sắc ký lỏng cao áp, HPLC (high performance liquid chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis). Trong phạm vi cho phép, chúng tôi chỉ thực hiện “Phân tích amino acid bằng sắc ký lỏng cao áp” trên một số loài nấm đang có ở thị trƣờng Việt Nam. Từ đó, với kết quả thu đƣợc chúng tôi sẽ tiến hành so sánh với các đối tƣợng khác cũng nhƣ sự khác nhau giữa chúng và dữ liệu về thành phần amino acid của từng loài nấm bào ngƣ sẽ đƣợc lƣu lại để làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này. 2 1.2. Mục đích So sánh sự thành phần amino acid giữa các loài nấm bào ngƣ đang có trên thị trƣờng Việt Nam. Khi đó, chúng tôi sẽ chọn ra một loài phù hợp để so sánh thành phần amino acid khi trồng trên các cơ chất khác nhau 1.3. Yêu cầu Tạo đựợc mẫu có độ tinh sạch cao. Tránh hiện tƣợng làm thay đổi tính chất mẫu nhƣ oxy hóa, halogen hóa, hay làm mẫu bị hủy hoàn toàn trong quá trình thủy phân. Sử dụng thiết bị HPLC (high performance liquid chromatography) của Trung tâm Phân Tích Hóa Lý để phân tích thành phần amino acid của các loài nấm kể trên 1.4. Nội dung thực hiện Thu thập và nhân giống các loài nấm đang có trên thị trƣờng. Nuôi trồng các loài nấm này trên môi trƣờng mùn cƣa có bổ sung một số vi lƣợng. Tiến hành thu quả thể Xác định thành phần amino acid trên các loài nấm bào ngƣ bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nấm trồng 2.1.1. Khái niệm về nấm Hiện nay, số loài nấm trồng đƣợc chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số nấm ăn thiên nhiên. Ngoài đặc điểm chung là quả thể hay tai nấm có kích thƣớc lớn (đa số dạng tán dù), chúng còn ăn ngon và rất giàu dinh dƣỡng [5]. Nấm rất phong phú và đa dạng, bao gồm cả những loại ăn đƣợc và không ăn đƣợc, những loài cho quả thể lớn có thể thấy bằng mắt thƣờng và những loài phải sử dụng kính hiển vi mới quan sát đƣợc [5]. Ban đầu nấm đƣợc xếp vào giới thực vật. Tuy nhiên, quan điểm này ngày nay không còn thuyết phục nữa và nhiều nhà phân loại học đã đề nghị xếp nấm vào một giới riêng, gọi là giới nấm. Sở dĩ xếp Nấm thành một giới riêng mà không xếp vào giới Thực vật vì nấm không có lục lạp, không có sắc tố quang hợp, không có đời sống tự dƣỡng nhƣ thực vật, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào [1]. Lysosome Thành tế bào Màng tế bào chất Bộ máy golgi Nhân Ti thể Mạng lƣới nội chất Ribosome Hình 2.1. Cấc trúc tế bào nấm (Nguyên Lân Dũng, 2001) 4 Nấm ăn có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm. Các sợi nấm ăn có dạng ống tròn. Các ống này đều có vách ngăn. Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm còn gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Khoảng cách giữa hai vách ngăn gọi là tế bào. Tế bào nấm có những đặc trƣng riêng, khác biệt với tế bào động vật và thực vật. Trƣớc hết là thành tế bào. Dƣới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy thành tế bào cấu tạo bởi nhiều lớp. Nếu nhƣ thành tế bào của thực vật cấu tạo chủ yếu bởi cellulose thì thành tế bào của những nhóm nấm khác nhau lại có cấu tạo bởi những thành phần khác nhau. Hầu hết các loài nấm đảm đều có thành tế bào cấu tạo chủ yếu bởi kitin- glucan. Thông qua các lỗ trên vách ngăn, chất nguyên sinh có thể di chuyển dễ dàng trong sợi nấm.[1]. Trong tế bào sơi nấm khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học phóng đại từ 1000 đến 1500 lần (Hình 2.1) có thể thấy Màng tế bào Nhân tế bào Bộ máy golgi Ribosome Lysosome Ti thể Mạng lƣới nôi chất. Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay tử một đoạn sợi nấm. Bào tử nảy mầm theo nhiều hƣớng khác nhau, sợi nấm phân nhánh nhiều lần, tạo nên một hệ sợi chằng chịt và thƣờng có màu trắng. Riêng ở nấm đảm nói chung thƣờng có tới 3 cấp sợi nấm. Sợi nấm cấp một (sơ sinh), sợi nấm cấp hai (thứ sinh) và sợi nấm cấp ba (tam sinh). Sợi nấm cấp một lúc đầu không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành nhiều tế bào đơn nhân trong sợi nấm. Sợi nấm cấp hai đƣợc tạo thành do sự phối trộn của hai sợi nấm cấp một. Khi đó nguyên sinh chất trong hai sợi nấm sẽ phối trộn với nhau. Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm cho tế bào có hai nhân. Ngƣời ta còn gọi sợi nấm loại này là sợi nấm song nhân (dycaryolic hyphae). Sợi nấm cấp ba là do sợi nấm cấp hai phát tr iển thành. Các sợi nấm này liên kết chặt chẽ với nhau và tạo thành quả thể [1]. 5 2.1.2. Sinh sản và chu trình sống Khả năng sinh sản là một đặc điểm quan trọng của nấm. Một tai nấm rơm trƣởng thành có thể phóng hàng tỉ bào tử. Nhờ vậy, nấm phát triển rất nhanh và phân bố rộng. Bào tử của nấm phổ biến có hai dạng: vô tính và hữu tính. Ở vi nấm, nấm mốc lan truyền chủ yếu nhờ bào tử vô tính, chúng gây nhiễm khắp nơi dƣới dạng hạt bụi nhỏ li ti, màu sắc khác nhau tùy loài. Riêng đối với nấm ăn, bào tử sinh ra bên dƣới cấu trúc đặc bịêt gọi là mũ nấm hay tai nấm. Mũ nấm thƣờng có cuống nâng lên cao để có thể nhờ gió đƣa bào tử đi xa. Bào tử nẩy mầm cho lại hệ sợi nấm mới [3]. Ngƣời ta quen gọi hệ sợi nấm ở giai đoạn tăng trƣởng (hay dinh dƣỡng) là tản dinh dƣỡng, phân biệt với quả thể nấm (hay cơ quan sinh bào tử hữu tính của nấm) là tản sinh sản. Hầu hết nấm trồng là nấm đảm, cơ quan sinh sản có có cấu tạo đặc biệt là tai nấm. Tai nấm chủ yếu gồm mũ và cuống nấm. Mũ thƣờng có dạng nón hay phễu, với cuống đính ở giữa hay bên. Mặt dƣới mũ của nhóm này cấu tạo bởi các phiến mỏng xếp sát vao nhau nhƣ hình nan quạt. Ở một số trƣờng hợp, phiến nấm còn kéo dài từ mũ xuống cuống (chân nấm), nhƣ nấm bào ngƣ (Pleurotus) [3]. Bào tử đảm (basidiospore) tạo ra ở bề mặt phiến, trên cấu trúc đặc biệt gọi là đảm (basidium). Riêng nấm đậu (Coprinus), khi tai nấm trƣởng thành mũ nấm sẽ chảy thành dịch nƣớc đen mang theo các bào tử đảm; còn các bào tử khác sẽ rụng và bay theo gió. Đảm đƣợc tạo thành từ các đầu ngọn sợi nấm. Tế bào này phồng to và bên trong hai nhân đứng riêng lẻ, sẽ nhập lại thành một nhân. Quá trình này gọi là quá trình thụ tinh [3]. Nhân thụ tinh sẽ phân chia và cuối cùng tạo ra 4 nhân con. Bình thƣờng mỗi nhân sẽ đƣợc khối sinh chất đẩy vào một cái gai nhỏ (xuất hiện trên đảm) để tạo ra một đảm bào tử, nhƣng đôi khi một đảm bào tử có thể cùng lúc hai nhân nhƣ nấm rơm (tỉ lệ chiếm đến 1/4) hoặc đặc biệt ở nấm mỡ (Agaricus bisporus) chỉ sinh ra hai đảm tử, mỗi bào tử chứa hai nhân. Các tế bào đảm hợp lại thành lớp trên bề mặt của phiến, đƣợc gọi là lớp thụ tầng (hymennium) và vì vậy đảm bào tử cũng thành lớp phủ trên trên bề mặt phiến. Điều này thấy rõ nấm rơm, khi trƣởng thành phiến nấm chuyển sang màu đỏ là do màu của bào tử. 6 Ngƣời ta phân biệt nấm đồng đảm (homobasidiomycetidae) và nấm dị đảm (hemibasidiomycetidae) là dựa vào cấu trúc của đảm. Nấm đồng đảm có đảm là một tế bào đồng nhất, còn nấm dị đảm hay tiền đảm chia làm 4 phần, mỗi phần tạo ra một đảm bào tử. Đảm bào tử là bào tử hữu tính, khi rụng sẽ bay đi khắp nơi. Khi gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm thƣờng chỉ có một nhân nên đƣợc gọi là sợi nấm sơ cấp (primary mycelium). Đối với nấm dị tản (heterothallic), phải có sự phối hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp phát sinh từ hai bào tử có đặc tính di truyền khác nhau mới hoàn thành sợi nấm thứ cấp (secondary mycelium). Trong khi đó nấm đồng tản (homothallic) chỉ cần hệ sợi sơ cấp từ bào tử nẩy mầm cũng có thể tự phối cho ra hệ sợi nấm thứ cấp. Từ hệ sợi nấm thứ cấp chứa hai nhân, nấm phát triển thành mạng sợi, lan khắp nơi trên cơ chất để hút chất dinh dƣỡng. Trong trƣờng hợp bị đứt khúc, các sợi nấm tự làm lành vết thƣơng và tái lập lại hệ sợi, tƣơng tự nhƣ cây trồng trong giâm hay chiết cành. Ở những điều kiện nhất định, nhƣ ẩm độ, nhiệt độ thích hợp, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch nấm. Hạch nấm sẽ tiếp tục phát triển cho quả thể trƣởng thành.[3]. Quả thể Phiến nấm Giảm phân hình thành bào tử đảm Bào tử đảm Sợi nấm sơ cấp (đơn nhân) Hợp tử Sợi âm Sợi dƣơng Quá trình dung hợp Sợi nấm thứ cấp (song nhân) Hình thành quả thể Sợi nấm song nhân Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm ( Peter H. Raven và ctv, 1992) 7 Ở nấm đảm, sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm cấp một xảy ra rất sớm, sợi nấm song nhân là hình thái chủ yếu của sợi nấm. Quả thể là do các sợi nấm song nhân liên kết lại tạo thành. Sợi nấm song nhân về mặt di truyền đuợc biểu thị là (n+n) khác với sợi nấm đơn nhân là n và hợp tử là 2n [1]. Ở một số loài còn có một dạng bào tử khác gọi là hậu bào tử hay bào tử màng dày (Chlamydospore), thí dụ nhƣ nấm rơm. Hậu bào tử giống nhƣ một bào tử thu nhỏ với đầy đủ nguyên sinh chất và hai nhân nhƣng cô đặc hơn và có vách tƣơng đối dày bao bọc. Có thể xem đây là một dạng sống tiềm sinh của nấm vì sau đó bào tử này có thể nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm thứ cấp [3]. 2.1.3. Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý Nấm chủ yếu sống dị dƣỡng, lấy thức ăn từ các nguồn hữu cơ (động vật hoặc thực vật). Ngoại trừ niêm khuẩn thay đổi hình dạng tế bào để nuốt lấy thức ăn (tƣơng tự động vật), còn lại hầu hết các loài nấm đều nấm lấy dinh dƣỡng qua màng tế bào hệ sợi (giống rễ cây thực vật). Nhiều loài nấm có hệ enzym phân giải tƣơng đối mạnh, giúp chúng có thể sử dụng các dạng thức ăn phức tạp, bao gồm các đại phân tử nhƣ (cellulose, hemicellulose), chất đạm (protein), chất bột (amidon, polysaccharide), lignin.Với cấu trúc sợi, tơ nấm len lỏi sâu vào trong cơ chất (rơm, rạ, mạt cƣa và nhiều cơ chất khác) rút lấy thức ăn đem nuôi toàn bộ cơ thể nấm (tản dinh dƣỡng hay tản sinh sản) [3]. Dựa theo cách thức dinh dƣỡng của nấm có thể chia thành 3 nhóm: Hoại sinh: Đặc tính chung của hầu hết các loài nấm, trong đó có nấm trồng. Thức ăn của chúng là xác bã động thực vật. Nhóm nấm này có hệ enzym tiêu hoá tƣơng đối mạnh, phân giải đƣợc nhiều loại cơ chất. Chúng có khả năng biến các chất này thành những chất có thành phần đơn giản để có thể hấp thụ đƣợc. Tuy nhiên, cũng có những trƣờng hợp nấm không thể phân giải cơ chất mà phải nhờ vào các vi sinh vật khác (vi khuẩn, nâm mốc, xạ khuẩn) tiến hành trƣớc một bƣớc[3]. Ký sinh: Bao gồm chủ yếu các loại nấm gây bệnh. Chúng sống bám vào các loài sinh vật khác (động vật, thực vật, các loài nấm khác). Thức ăn của chúng chính là các chất lấy từ cơ thể ký chủ, làm suy yếu hoặc làm tổn thƣơng ký chủ. Một số nấm ăn có thể sống trên cây còn tƣơi nhƣng đời sống thực sự vẫn là hoại sinh, nên đƣợc xếp vào nhóm trung gian, gọi là nhóm bán ký sinh (trƣờng hợp nấm mèo). 8 Cộng sinh: Đây là nhóm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ nhƣng không làm chết hoặc gây tổn thƣơng ký chủ, ngƣợc lại còn giúp chúng phát triển tốt hơn. Vì vậy các loài này đối với ký chủ có mối quan hệ mật thiết với nhau. Do đó, việc nuôi trồng trở nên phức tạp hơn, thƣờng giống nấm đƣợc cấy cùng lúc với việc trồng cây (thí dụ nấm Tuber hoặc Boletus). 2.2. Nấm bào ngƣ 2.2.1. Giới thiệu Nấm bào ngƣ (còn gọi là nấm sò, nấm bình cô, oyster mushroom) gồm nhiều loài thuộc: Chi Pleurotus Họ Pleurotaceae Bộ Agaricales Lớp phụ Hymenomycetidae Lớp Hymenomycetes Ngành phụ Basidiomycotina Ngành nấm thật-Eumycota Giới nấm Mycota hay Fungi Nấm bào ngƣ có tới 50 loài khác nhau. Tuy nhiên, số loài đƣợc nuôi trồng đƣợc không nhiều, khoảng 10 loài [2]. Nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng rộng rãi trên thế giới. Ở châu Âu nấm bào ngƣ đƣợc trồng ở Hungary, Đức, Ý, Pháp, Hà Lan. Ở Châu Á nấm bào ngƣ đƣợc trồng ở Trung Quốc với sản lƣợng rất cao (khoảng 12 nghìn tấn mỗi năm) giá khoảng 2.2 triệu đồng Việt Nam. Ngoài Trung Quốc, nấm này còn đƣợc trồng ở Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc, Thái Lan Ấn Độ [2]. Nấm bào ngƣ không chỉ ăn ngon mà còn có giá trị dinh dƣỡng cao. Trong nấm chứa đầy đủ các amino acid. Ngoài giá trị dinh dƣỡng, nấm bào ngƣ còn có giá trị dƣợc liệu. Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm bào ngƣ cùng một số nấm ăn khác có tác dụng chống ung thƣ. Bằng phƣơng pháp khuếch tán vào thạch nhóm nghiên cứu của Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã cho thấy nấm bào ngƣ Pleurotus sajor - caju ở dạng bán cầu lệch có tác dụng ức chế 2 chủng Vi khuẩn Gran dƣơng S. aureus và B. subtilis và 2 chủng Gram 9 âm E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài ra, theo nghiên của nhà khoa học Trung Quốc – Phó Liên Giang nấm bào ngƣ còn có khả năng làm giảm lƣợng cholesterol trong máu [3]. Một trong những đặc điểm quan trọng của nấm là hệ enzym. Nhờ enzym cellulase và một số enzym khác, nấm bào ngƣ khả năng chuyển hoá cellulose thành nhƣng chất cơ bản góp phần giải quyết nạn ô nhiễm môi trƣờng do chất thải nông nghiệp tạo ra nhƣ bã mía, rơm rạ. Ngoài ra, nấm còn có khả năng phân hủy thuốc trừ cỏ Antrazin nhờ vào sự gia tăng các enzym P – 450 của hệ Cytochromeoxxygenase và peroxydase (Sannia và ctv, 1990) [3] . Nấm bào ngƣ có đặc điểm chung là tai nấm dạng phễu lệch, phiến nấm mang bào tử kéo dài xuống chân. Cuống nấm gần gốc có lông mịn. Tai nấm còn non có màu sắc tối, nhƣng khi trƣởng thành trở nên sáng hơn. Quả thể nấm bào ngƣ phát triển qua nhiều giai đọan, dựa theo hình thái tai nấm mà tên gọi cho từng giai đoạn khác nhau. Dạng san hô: quả thể mới tạo thành dạng sợi mãnh hình chùm. Dạng dùi trống: mũ xuất hiện dƣới dạng khối tròn. Dạng phễu: mũ mở rộng trong khi cuống còn ở giữa Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh một bên so với vị trí trung bình. Dạng lục bình: cuống ngừng tăng trƣởng, nhƣng mũ vẫn phát triển. Nấm bào ngƣ có chu trình phát triển cũng nhƣ các loài nấm đảm khác, bắt đầu đảm bào tử hữu tính, nẩy mầm cho hệ sợi tơ dinh dƣỡng (sơ cấp và thứ cấp) và “kết thúc” bằng việc hình thành cơ quan sinh sản là tai nấm. Tai nấm sinh ra đảm bào tử và chu trình lại tiếp tục [3] . 2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam. Hiện nay, nấm bào ngƣ đƣợc trồng rộng rãi ở Việt Nam cả miền Bắc lẫn miền Nam vì khí hậu nƣớc ta rất thuận lợi cho việc phát triển loài nấm này. Hiện nay, nấm bào ngƣ đƣợc trồng với nhiều chủng loại (khoảng 7 loại) tập trung nhiều ở Đà Lạt và Thành phố Hồ Chí Minh. Hầu hết các dòng nấm đƣợc nuôi trồng ở nƣớc ta là các giống đƣợc nhập từ nƣớc ngoài. Tuy nhiên vẫn có một số ít đƣợc khai thác ngay trên địa lý của Việt Nam sau đó đêm về nuôi trồng trên điều kiện nhân tạo. 10 Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ (Lê Duy Thắng, 1999) Loài nấm Nhiệt độ thích hợp cho tơ tăng trƣởng ( 0C) Nhiệt độ thích hợp cho ra nấm ( 0C) Pleurotus floridanus Pleurotus sajor - caju Pleurotus pulmonarius Pleurotus abalonus Pleurotus flabellatus 25-30 25-30 22-28 27-32 20-28 25 25 25 25 20-25 2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus floridanus (Hình 2.6) Đây là loài thích nghi với nhiệt độ khá rộng từ 8 - 30oC. Quả thể màu trắng sữa. Có tính kháng tạp nấm, tạp khuẩn cao. Sợi nấm có họat tính mạnh đối với việc phân giải cellulose. Sản lƣợng trên đơn vị nguyên liệu tƣơng đối cao. Nấm này có thể thích nghi với nhiều loại cơ chất khác nhau: bã mía, mùn cƣa, rơm, trấu. Khi trồng trên trấu, năng suất có thể đạt đƣợc đợt ra quả thể đầu tiên là 114g nấm tƣơi trên 360 g nguyên liệu khi có bổ sung ure, KH2PO4, cám gạo [4]. 2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor - caju (nấm sò phƣợng vỹ hay nấm sò dạng phễu) Quả thể đƣợc hình thành ở nhiệt độ tƣơng đối cao so với các loài nấm khác. Gần đây, nấm này đang dần chiếm thị trƣờng vì quả thể chắc, ăn ngon và rất thích hợp đối với khí hậu Việt Nam. Ngoài ra, dịch chiết từ nấm này có thể ức chế một số loài vi khuẩn: S. aureus và B. subtilis, E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài các cơ chất thông thƣờng, gần đây nấm này còn đƣợc trồng trên cơ chất là cây mai dƣơng để chống sự xâm lấn của chúng góp phần giải quyết nạn môi trƣờng. Loài nấm này đƣợc nhập từ Nhật Bản và đƣợc nuôi trồng thành công trên mùn cƣa đầu tiên ở Thành phố Hồ Chí Minh. 11 2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius Phần lớn đƣợc nhập từ nƣớc ngoài (Hình 2.3). Nhƣng gần đây, GS. Lê Xuân Thám và cộng sự (1999) phát hiện đƣợc một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó đƣa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cƣa [7] . 2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan. Là một loài nấm ƣa nóng nên rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1]. Nấm này có đặc điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đƣờng kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2]. Ngoài ra còn một loài khác cũng đang đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ Pleurotus eryngii, Pleurotus flabellatus. Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng thành công 2 loài nấm bào ngƣ mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7]. Hình 2.6. Pleurotus floridanus Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius Hình 2.4. Pleurotus abalonus Hình 2.5 Pleurotus sp. 12 2.3. Phƣơng pháp sắc ký - Phân tích amino acid 2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký đƣợc phát triển vào đầu tiên bởi Mikhail Semyonovich Tsvet (1901) trong quá trình nghiên cứu về chlorophyll. Đến năm 1952, Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký phân tách. Từ đó kỹ thuật sắc ký ngày vàng đƣợc phát triển cao hơn cho đến ngày nay [24]. Sắc ký là phƣơng pháp phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha động tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tính sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Nhờ vậy mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [10]. 2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đƣa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các chất, nhƣng chính sự lặp đi lặp lại hiện tƣợng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. Hầu hết các phƣơng pháp sắc lý đều đƣợc dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả của từng phƣơng pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh [8]. 2.3.3. Phân loại quá trình sắc ký Trong phƣơng pháp sắc ký pha động phải là các lƣu thể còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc ký thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa pha động và pha tĩnh mà ngƣời ta lại chia các phƣơng pháp sắc ký thành nhóm nhỏ hơn. 13 Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tƣơng tác và sự hình thành sắc ký mà ngƣời ta phân biệt các loại sắc ký nhƣ bảng 2.2. Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản [9] Dạng sắc ký Pha động Pha tĩnh Cách bố trí pha tĩnh Cơ chế trao đổi chất Khí Khí- hấp phụ Khí -lỏng Lỏng Lỏng - rắn Lỏng - lỏng Lỏng - nhựa trao đổi Lớp mỏng Rây (sắc ký gel) Khí Khí Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Rắn Lỏng Rắn Lỏng Rắn Rắn Lỏng Cột Cột Cột Cột Cột Lớp mỏng Cột Hấp phụ Phân bố Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion Hấp phụ Theo kích thƣớc phân tử 2.4.. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tích amino acid Phân tích amino acid là phƣơng pháp xác định thành phần amino acid cũng nhƣ định lƣợng chúng trong mẫu protein hay peptide. Phân tích amino acid có thể sử dụng sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography- TLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis) [15]. 2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy) - Quá trình phân tách đƣợc thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7). - Dùng viết chì, vẽ một đƣờng mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm). đánh những dấu nhỏ dọc theo đƣờng vừa kẻ. - Dùng pipett hút lƣợng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa mới đánh. Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau. Làm khô. - Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký). - Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ. 14 - Lấy ra, dùng viết chì kẻ đƣờng đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển. Làm khô. - Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy. Để khô. Tính giá trị Rf. [24] - Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn. 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ đƣợc gắn vào một giá mang thƣờng là bản thủy tinh và pha động đi qua lớp mỏng này bằng lực mao dẫn. Trong TLC một chiều, các thành phần trong mẫu đƣợc tách rời nhau bằng một lần chạy sắc ký với một dung môi nào đó, còn TLC hai chiều là một kỹ thuật sắc ký có khả năng tách mạnh bằng hai lần chạy sắc ký với hai chiều vuông góc nhau và với hai hệ dung môi khác nhau [7]. Quy trình phân tích amino acid trên TLC [23] - Lấy tấm TLC, dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh cách mép dƣới của tấm TLC khoảng 2 cm, đánh „dấu‟ trên đƣờng bút chì vừa đƣợc vẽ. Chú ý đánh dấu từng vết đều nhau và dán nhãn trƣớc để có thể không nhần lẫn khi phát hiện. - Nhỏ trên mỗi đánh dấu một giọt dung dịch amino acid mẫu, làm khô tấm TLC. - Thêm dung môi cho vào một beaker rộng điều chỉnh lƣợng dung môi để có thể phủ toàn bộ chiều ngang của tấm TLC ( chú ý phủ khoảng 1cm chiều cao của lớp mỏng). 15 - Cho tấm TLC vào beaker, mẫu đƣợc đặt phía dƣới. - Khi dung môi di chuyển đƣợc khoảng 85 % của tấm mỏng thì lấy tấm mỏng ra dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh ngang với đƣờng dung môi vừa di chuiyển đến. Để chúng khô hoàn toàn. - Cho bảng mỏng vào tủ hút, nhỏ ninhydrin vào để có thể thấy màu. Làm khô. .Khi đó amino acid sẽ xuất hiện màu trên bảng mỏng. Đánh dấu từng vết bằng bút chì ngay ở tâm. Tính giá trị Rf ( retardation factor). - Lƣu giá trị Rf để tính toán những amino acid chƣa biết. Ngoài ra, amino acid cò đƣợc phân tích trên sắc ký trao đổi ion thông qua phát hiện sau khi bị tách qua cột, sắc ký khí,, điện di mao quản, HPLC. Tuy nhiên, đối với phân tích amino acid, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thƣờng đƣợc sử dụng nhất bởi vì nó có nhiều ƣu điểm hơn nhƣ: thời gian ngắn. độ phân tách cao, dẫn xuất ổn định và có thể phát hiện thông qua UV (Ultraviolet). 2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC đƣợc ra đời vào đầu những năm1970 là một trong những công cụ phân tích đầu tay của các nhà phân tích. HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau. Những thành phần này đầu tiên đƣợc hòa tan vào trong dung môi và sau đó dƣới tác dụng của áp suất cao , chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn hợp sẽ đƣợc phân tách thành những cấu tử của chúng. Sự tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu đƣợc nhiều cấu tử khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện đƣợc và nó dễ dàng phân tách số lƣợng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau. 2.4.3.1. Pha tĩnh Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau. Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực. Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh sẽ liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn. Vì thế những chất ít phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn. 16 Size - Exclusion Dựa trên kích thuớc phân tử của thành phần đƣợc phân tích. Pha tĩnh chứa các hạt xốp bên trong có nhiều lỗ nhỏ. Những thành phần có kích thƣớc lớn hơn hạt sẽ bị loại ra ngoài và đƣợc tách rửa đầu tiên. Những cấu tử có kích thƣớc phù hợp sẽ bị hấp thu và lỗ và đƣợc tách rửa sau. Normal phase (pha bình thƣờng) Pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động . Reverse Phase (ngƣợc pha) pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Ion-Exchange đƣợc tiến hành dựa trên sự thay thế những ion trong mẫu với những ion trái dấu trong pha tĩnh. Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột. 2.4.3.2. Pha động Tùy thuộc vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi. Đối với pha bình thƣờng, thì dung môi thƣờng là không phân cực còn đối với mô hình ngƣợc pha thì thì thƣờng sử dụng có sự pha trộn giữa nƣớc và một vài dung môi hữu cơ phân cực nhƣ acetonitrile. Đối với mô hình size - exclusion, yêu cầu đối với pha động là ngăn cản mẫu gắn kết trên bề mặt của pha tĩnh. 17 2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC Bơm: Bơm trong HPLC đuợc xem là một trong những thành phần rất quan trọng trong hệ thống sắc ký lỏng. Bởi vì hệ thống sắc ký lỏng đòi hỏi phải có tỉ lệ dòng ổn định liên tục gắn liền với injector, cột và detector. Có hai loại bơm cơ bản - Bơm áp suất liên tục. - Bơm dòng liên tục. Cột: Hiện nay có rất nhiều loại cột đang đƣợc sử dụng. Tuy nhiên tùy thuộc vào loại mẫu, tính chất của mẫu mà ta có loại cột và kích thƣớc cột khác nhau. Đối với sắc ký ngƣợc pha thì cột C-18 và Pico-Tag column, 3.9 mm x 15 cm thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Detector: Một số detector thƣờng đƣợc sử dụng: - Detector Ultraviolet/visible: thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các chất hữu cơ. - Detector chuỗi diode. - Detector huỳnh quang. Và một số detector khác nhƣ detector điện hóa học,detector dẫn điện… Hệ thống dữ liệu. Để chuyển dữ liệu phân tích, detector thƣờng đƣợc nối trực tiếp với một máy vi tính. Khi đó dữ liệu đƣợc chuyển thành những peak trên sắc ký đồ và đƣợc tính toán. 2.5. Các bƣớc phân tích amino acid Phân tích amino acid đƣợc thực hiện thông qua các bƣớc sau đây [17]. - Chuẩn bị mẫu - Thủy phân protein thành những amino acid đơn. - Tạo dẫn xuất. - Phân tách amino acid trên hệ thống sắc ký - Phân tích dữ liệu và tính toán. Trƣớc khi tiến hành phân tích amino acid, quá trình chuẩn bị mẫu cũng đóng vai trò rất quan trọng vì nếu không chuẩn bị kỹ sẽ rất dễ bị nhiễm trong quá trình phân tích. - Mẫu đƣợc đặt trong một tube sạch. - Tất cả mẫu đƣợc làm khô trƣớc khi phân tích. Trong quá trình tiến hành phải đeo găng tay , tuy nhiên tránh các bụi trên găng tay bám vào mẫu. 18 2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) Để phân tích amino acid trong mẫu protein, mẫu phải đƣợc thủy phân tạo thành những amino acid đơn. Thủy phân bằng acid là phƣơng pháp thông thƣờng nhất để thủy phân protein trƣớc khi tiến hành pnân tích amino acid. Phƣơng pháp thủy phân bằng acid có thể tạo ra sự phân cắt khác nhau đối với một vài amino acid- phá hủy hoàn toàn hoặc một phần. Một số khó khăn khi thủy phân bằng acid. - Trytophan bị phá hủy hoàn toàn - Serine và threonine bị phá hủy một phần - Methionine có thể bị oxy hóa - Cysteine thƣờng đƣợc phát hiện nhƣ là cystine (nhƣng cystine thƣờng đƣợc phát hiện rất kém bởi vì chúng bị phân hủy một phần). - Asparagine và glutamine tƣơng ứng bị chuyển thành acid aspartic và acid glutamic. Nhƣ vậy, nếu kỹ thuật thủy phân không tốt có thể gây ra nhiều kết quả không chính xác. Một số phƣơng pháp thủy phân thƣờng đƣợc sử dụng trong HPLC. Phƣơng pháp 1: Dùng HCl 6N và phenol (từ 0.1- 1 %) Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất là dùng HCl có chứa phenol. Thêm phenol vào để ngăn cản phản ứng halogen hóa tyrosine.Dung dịch thủy phân: HCl 6N chứa từ 0,1 đến 1 % phenol. Phƣơng pháp tiến hành: - Cho mẫu vào tube thủy phân và làm khô (mẫu đƣợc làm khô để nƣớc không pha loãng acid). Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl [17] 19 - Thêm dung dịch thủy phân vào mẫu với tỷ lệ nhất định. - Làm lạnh tube chứa mẫu. - Mẫu thƣờng đƣợc thủy phân ở 110oC, trong 24h trong chân không hoặc trong khí trơ để ngăn cản quá trình oxy hóa. Thời gian thủy phân có thể thay đổi tùy theo mục đích phân tích. - Sau khi thủy phân làm khô mẫu trong chân không để loại bỏ acid thừa. Phƣơng pháp 2: Dùng Mercaptoathanesulfonic (MESA) 2.5M. - Mẫu đƣợc làm khô trong một tube trƣớc khi thủy phân. - Tube chứa mẫu này cho vào một tube lớn hơn đã chứa dung dịch thủy phân. - Tube thủy phân này đƣợc tiến hành trong chân không để làm bay hơi dung dịch thủy phân. Tube thủy phân đƣợc gia nhiệt từ 170oC đến 185oC khoảng 12 phút. - Sau khi thủy phân tube đƣợc làm khô trong chân không để loại bỏ acid dung dịch thừa [17]. 2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) [17] Những amino acid sẽ không đƣợc phát hiện nếu chúng không đƣợc tạo dẫn xuất. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tạo dẫn xuất, sự chọn lựa bất kỳ một kỹ thuật nào phụ thuộc vào độ nhạy, thời gian phân tích và độ chính xác của phƣơng pháp. Nói chung một nữa trong số kỹ thuật phân tách amino acid là kỹ thuật sắc ký trao đổi ion kèm theo postcolumn (ninhydrin hay o – phthaladehyde). Kỹ thuật phát hiện bằng postcolumn chỉ yêu cầu với lƣợng mẫu nhỏ (khoảng 5-10 µg protein trong một lần phân tích). Kỹ thuật phân tích amino acid liên quan đến tạo dẫn xuất precolumn cũng đƣợc ứng dụng rất rộng rãi và yêu cầu là HPLC ngƣợc pha. Kỹ thuật này rất nhạy nên đòi hỏi lƣợng mẫu phân tích rất nhỏ chỉ khoảng 0.5-1 µg. Phƣơng pháp phát hiện bằng ninhydrin postcolumn Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion với ninhydrin postcolumn là một trong những phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật định lƣợng amino acid. Sau khi amino acid đƣợc phân tách trên sắc ký sẽ đƣợc phát hiện thông qua phản ứng của chúng với ninhydrin sẽ tạo màu vàng hay màu tím. Những amino acid thƣờng cho màu tím sẽ đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng hấp thụ là 570 nm. Những amino acid cho màu nhƣ là proline thƣờng đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 440 nm. Ngoài 20 ninhydrin, o – phthalaldehyde (OPA) cũng đƣợc sử dụng trong phân tích postcolumn. Bƣớc sóng phát hiện của phƣơng pháp này thƣờng vào khoảng 348 - 450 nm. Đối với phƣơng pháp precolumn thì tác nhân tạo dẫn xuất thƣờng đƣợc sử dụng là phenylisothiocyanate (PITC). PITC phản ứng với amino acid ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-10 phút (Pierce Chemical company, 1999) tạo thành phenylisocarbamyl (PTC) và có thể đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 254 nm. Vì thế tạo dẫn xuất amin acid với PITC thông qua sắc ký ngƣợc pha (reversed-phase HPLC) có thể đƣợc sử dụng để phân tích định lƣợng amino acid với detector UV. Với phƣơng pháp này, giới hạn phát hiện cho phần lớn những amino acid là khoảng 1pmol. Độ tuyến tính tƣơng ứng (response linearity) thu đƣợc từ 20 đến 500 pmol. Để thu đƣợc kết quả tốt, lƣợng mẫu lớn hơn 500 ng trƣớc khi thủy phân là tốt nhất. Ngoài sử dụng các thành phần phản ứng nêu trên, các hợp chất sau đây cũng đƣợc sử dụng để phát hiện amino acid trong các mẫu sinh hóa. o - phthaladehyde (OPA).(dẫn xuất sau khi qua cột) Hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) (dẫn xuất tiền cột) Dimethylaminoazobenzenesulfonyl chloride (DABS-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 9-Fluornylmethyl choloformate (FMOC-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) (dẫn xuất tiền cột) 2.5.3. Phân tách trên HPLC [17] Đầu tiên, chuẩn amino acid đƣợc phân tách trƣớc với các nồng độ khác nhau để làm dữ liệu cho công việc tính toán sau này. Mẫu thƣờng đƣợc bơm với thể tích nhất định. Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC [10]. 21 Tùy theo phƣơng pháp precolumn hay postcolumn mà ta có thể sử dụng pha động, pha tĩnh, cột cũng nhƣ điều chỉnh bƣớc sóng phát hiện và detector phù hợp. Khi đó thời gian phát hiện cũng khác nhau. Nếu là PTC-aa thƣờng đƣợc phân tách trên cột cilica C18, hoặc Pico -Tag của sắc ký ngƣợc pha; pha động thƣờng là acetonitrile; bƣớc sóng phát hiện ở 254nm và tất cả các aa thƣờng đƣợc phát hiện khoảng 12 phút.không kể thời gian rửa cột hay thời gian thêm để tạo cho đƣờng nền trở lại. 2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu [10] 2.5.4.1. Định tính Để phát hiện đƣợc các amino acid, phƣơng pháp thông thƣờng là dựa vào thời gian lƣu của chuẩn đã đƣợc thực hiện chạy sắc ký trƣớc. sau đó, thời gian lƣu của mẫu đƣợc so sánh với chuẩn này và từ đo xác định từng amino acid tƣơng ứng với từng diện tích peak để định lƣợng. 2.5.4.2. Định lƣợng Thành phần của từng amino acid đƣợc thể hiện bằng phần trăm về số mol (mol%) so với tất cả những phần khác trong mẫu protein hay peptide. Chẳng hạn nhƣ nếu protein có 5 nmol Ala tổng số tất cả các amino acid trong protein là 200 nmol kể cả Ala thì phần trăm số mol của Ala là 2.5. Kết quả thu đƣợc sẽ tạo nên một profile riêng biệt đối với tất cả các amino acid trong một protein hay peptide cụ thể. 2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ Thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đã đƣợc tiến hành phân tích từ rất lâu, nhất là khi kỹ thuật sắc ký ra đời. .Năm 1962, Zakia Bano và cộng sự, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm Mysore, Ấn Độ đã tiến hành phân tích trên sắc ký giấy tròn. Và ông đã phát hiện trong nấm này chứa đến 17 amino acid. Trong đó hiện hiện đầy đủ 10 amino acid cần thiết [15]. 22 L: lycine IL:Isoleucine Ph Al: Phenylalanine Glu: Glutamic acid Thr: Threonine Ser: Serine Gly: Glycine Asp: Aspartic acid Arg: Agrinine, Pep: Peptide Lys:Lysine, His: Histidine Cys: Cysteine Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bằng sắc ký giấy tròn (Zakia Bano, 1962) 23 PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian, địa điểm thực hiện và vật liệu nghiên cứu 3.1.1. Thời gian thực hiện Khóa luận đƣợc thực hiện từ ngày 14/2/2005 đến ngày18/8/2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phòng Hóa Lý, Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.3. Vật liệu nghiên cứu Giống nấm Pleurotus floridanus Pleurotus sajor – caju Pleurtus abalonus Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Nguồn cung cấp Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) 3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết b