Phân lập Bacillus subtilis TH2 từ Natto, tạo chế phẩm lên men Natto và thử nghiệm sản xuất Natto từ đậu tương

hế. Môi trường thuận lợi để Bacillus subtilis phát triển tốt là môi trường LB hoặc môi trường thạch dinh dưỡng NA. 4. Ứng dụng Bacillus đã được sử dụng từ rất lâu trong lịch sử. Sự lên men đậu tương thực hiện bởi các chủng Bacillus subtilis natto tạo ra Natto đã được sử dụng nhiều ở Nhật trong hàng nghìn năm nay và nhiều chủng Bacillus được sử dụng trong lên men đậu cocoa từ nhiều thế kỉ. Các chủng Bacillus subtilis khác cũng có nhiều ứng dụng trong đời sống. Có loại có hoạt tính diệt nấm tự nhiên, và được sử dụng như là tác nhân kiểm soát sinh học. Bacillus subtilis cũng được chứng minh là có thể dễ dàng sử dụng các thao tác di truyền, do đó nó được sử dụng rộng rãi như là một vi khuẩn điển hình trong các nghiên cứu. Bacillus subtilis còn có khả năng tiết protein với hàm lượng lớn vào môi trường, lên tới 20-25g/l. Các chủng Bacillus có thể tạo ra lượng lớn enzym thuỷ phân sử dụng trong công nghiệp như amylaza và proteaza cho công nghiệp thực phẩm và công nghiệp tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, công nghiệp phim ảnh. Lượng enzym từ Bacillus chiếm khoảng 50% tổng số các enzym thương mại. Bên cạnh enzym, Bacillus còn được dùng để tạo ra các chất kháng sinh, các hoá chất có khả năng tăng hương vị cho thực phẩm. Bacillus subtilis còn được sử dụng trong phân bón dạng lỏng để chuyển hóa NH4+ thành axit polyglutamic để làm kho dự trữ N cho đất. Bacillus subtilis có thể phát triển trong môi trường phân bón dạng lỏng bằng cách sử dụng gluconat natri, tạo axit polyglutamic. V. CÁC SẢN PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG 1. Sản phẩm bột Natto để hoạt hóa đường ruột Bột Natto giúp cung cấp cho hệ tiêu hoá hệ vi sinh vật còn sống có nguồn gốc từ Natto. Sản phẩm này có thể dễ dàng được hấp thụ mà không gây ra mùi đặc biệt khó chịu trong suốt quá trình bảo quản. Sản phẩm này là dạng pha trộn đồng nhất được thu nhận bởi trộn 15% (trọng lượng) bột Natto trong đó có chứa vi khuẩn Natto, 50% đường lactoza để làm cơ chất cho vi khuẩn phát triển, 30% hạt cà phê nghiền mịn có kích thước 300 Mesh để làm chất tạo độ xốp và 5% vi khuẩn tạo bào tử. Sản phẩm này được đóng gói 0,5 g trong vỏ capsule cứng. Dạng sản phẩm này của Natto có tác dụng như probiotic [35]. 2. Sản phẩm Nattokinaza Enzym này là sản phẩm trao đổi chất quan trọng của Bacillus subtilis natto. Chúng đã được tách tinh chế từ Natto để thu được enzym tinh khiết và phối trộn với một số các chất khác và đóng gói dưới dạng viên nang vỏ capsule để dùng trong điều trị các bệnh về tim mạch, huyết áp. Lợi ích của loại enzym này đã được chứng minh qua một số nghiên cứu [35]. 2.1. Hiệu quả của natto trong điều trị tắc nghẽn mạch máu Bác sĩ Martin Milner thuộc trung tâm y học tự nhiên tại Portland, Oregon đã thực hiện đề tài nghiên cứu về Nattokinaza và sẽ mở rộng nghiên cứu của mình. Trong những năm nghiên cứu về bệnh liên quan tới tim mạch và phổi ông thấy rằng, “Natto và Nattokinaza là đại diện tiêu biểu nhất để ứng dụng trong phát triển các loại thuốc ngăn chặn và chữa trị các bệnh liên quan tới tim mạch”. Ông còn nói ” chúng tôi cuối cùng đã tìm ra một tác nhân tự nhiên có hiểu quả làm tan các cục máu đông với sự an toàn cao và không có hiệu ứng phụ” [36]. Nattokinaza là đối tượng cho 17 nghiên cứu cả trên người và động vật, bao gồm 2 thử nghiệm nhỏ trên người [36]. Bác sĩ Sumi và các đồng nghiệp tạo ra các cục máu đông ở chó cái và rồi đưa 4 viên nang Nattokinaza vào theo đường uống và kiểm chứng bằng 4 viên thuốc trấn an cho chó. Chiếu tia X vào mạch máu cho thấy những con chó hấp thu Nattokinaza lại có chu trình tuần hoàn máu bình thường trở lại chỉ sau 5 giờ điều trị. Trong khi đó các cục máu đông trong các con chó chỉ sử dụng thuốc trấn an cho thấy không có dấu hiệu làm tan các cục máu đông sau 18 giờ điều trị [36]. Các nhà nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm nghiên cứu Công nghệ sinh học, Công ty Dược phẩm Kobe, Nhật đã kiểm tra khả năng hoà tan cục máu nghẽn trong động mạch chính ở chuột của Nattokinaza. Các động vật được điều trị với Nattokinaza hồi phục được 60% sự tuần hoàn trở lại của dòng máu, trong khi điều trị với plasmin chỉ hồi phục được 15,8% sự tuần hoàn của dòng máu. Các nhà nghiên cứu của công ty dược phẩm JCR, Đại học bang Oklahoma kết hợp với trường Cao đẳng Y khoa Miyazaki đã kiểm tra Nattokinaza trên 12 tình nguyện viên người Nhật trong đó có 6 nam và 6 nữ ở độ tuổi 21 đến 55. Theo thử nghiệm mỗi tình nguyện viên sử dụng 200g Natto (dạng thực phẩm) trước bữa ăn sáng, và theo dõi tính tan sợi tơ huyết thông qua kiểm tra huyết tương. Kiểm tra chỉ ra rằng Natto làm tăng khả năng hoà tan cục máu: Trung bình, đo thời gian phát huy tác dụng, Nattokinaza được sử dụng vơi các tình nguyện viên vẫn duy trì được tác dụng trong vòng 2 đến 8 giờ [36]. 2.2. Lợi ích của Nattokinaza lên huyết áp Ăn Natto không chỉ hỗ trợ cho hệ tim mạch mà còn làm giảm huyết áp. Trong những năm gần đây hiệu quả này đã được tiến hành trên nhiều thử nghiệm lâm sàng. Năm 1995 các nhà nghiên cứu tại Cao đẳng Y khoa Miyazaki, và Đại học Khoa học và Nghệ thuật Kurashiki của Nhật Bản đã nghiên cứu ảnh hưởng của nattokinase tới huyết áp cả trên người và động vật [36]. Nghiên cứu trên động vật Nghiên cứu trên chuột đực cho thấy khi cung cấp 25 mg Natto, huyết áp giảm đáng kể từ 166 mmHg xuống còn 145+24 mmHg chỉ trong vòng 2 giờ, và giảm tới 144+27mmHg trong 3 giờ. Trung bình giảm 12,7 % trong 1 giờ [36]. Nghiên cứu trên người Cùng một lượng Natto như vậy được kiểm tra trên những tình nguyện viên cao huyết áp, mức độ huyết áp được đo sau khi dùng 30 g dịch chiết lạnh khô (tương ứng với 200g natto thực phẩm) theo đường uống liên tục sau 4 ngày. Kết quả cho thấy 4 trong 5 tình nguyện viên giảm huyết áp từ 173+20,5mmHg xuống 154,8 + 12,6 mmHg. Trung bình giảm được 10.9% trong 1 giờ [36]. Kết luận Natto đã đựơc sử dụng an toàn trong hơn 1000 năm qua. Nattokinaza được cho là an toàn (do có đã có thời gian dài sử dụng), nhiều lợi ích: Thuận tiện sử dụng theo đường uống, có hiệu quả lâu dài, có hiệu lực, có thể dùng trong điều trị dự phòng, đã được chứng minh là ổn định trong đường ruột và chịu được sự thay đổi của pH, nhiệt độ [36]. 3. Sản phẩm Natto Natto là sản phẩm truyền thống đã được sử dụng rộng rãi từ hàng nghìn năm nay tại Nhật và các sản phẩm truyền thống tương tự như Natto cũng được sử dụng ở các nước khác. Ngoài việc cung cấp dinh dưỡng cho người ăn nó còn cung cấp các chất có các tác dụng như một thực phẩm chức năng với những lợi ích kể trên. nhờ những tác dụng đặc biệt đó mà mặc dù Natto có mùi vị hơi khó chịu nhưng nó vẫn được ưa chuộng và ngày càng được sử dụng nhiều hơn. Tại Việt Nam, sản phẩm Nattto cũng được nhập khẩu và bày bán ở các siêu thị lớn. Lượng tiêu thụ Natto khá lớn, chủ yếu cho những người Nhật sống tại Việt Nam và một số người nước ngoài. PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Sản phẩm Natto thương mại nhập khẩu từ Nhật Bản được bán tại siêu thị Uni-mart, Hà Nội. II. HÓA CHẤT. Các hoá chất sử dụng trong đồ án gồm: Cao thịt (Merk - Đức); cao nấm men (Difco - Mỹ); agar- agar, cồn 750, 960 glucoza, đỏ fucsin, dung dịch I2, lugol, tím tinh thể (Việt Nam); peptone, NH4NO3, NH4H2SO4, KCl, KH2PO4, Na3C6H5O7.2H2O, bromtimol blue, gelatin, CaCl2.2H2O, CH3COONa, MgSO4, MnSO4, Tween 80, NaCl, K2HPO4, cồn tuyệt đối, Glyxerol (Trung Quốc). Một số hóa chất khác. NH4NO3 0,4 g MgSO4 0,2 g MnSO4 0,4 g Tween 80 1 ml Agar 14 g * Thành phần môi trường MRS (1000ml H2O) Peptone 10 g Cao thịt 8 g Cao nấm men 4 g CH3COONa 5 g K2HPO4 2 g Glucoza 20 g Thạch agar-agar 15,54 g Peptone 10,36 g Cao thịt 5,18 g * Thành phần môi trường NA (1000 ml H2O) Môi trường và các dụng cụ thí nghiệm được hấp thanh trùng ở 1100C trong thời gian 30 phút, pH môi trường 6,5-6,7. III. THIẾT BỊ Thiết bị vô trùng: tủ sấy; nồi thanh trùng HIRAYAMA HV-25/50/85/110- Nhật Bản, Thiết bị nuôi cấy và giữ giống: Tủ cấy, tủ nuôi (Nhật Bản); tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản); tủ lạnh sâu (Sanyo ultra low, Nhật Bản). Thiết bị nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào: Kính hiển vi quang học OLYMPUS, modelCHS, Nhật Bản. Các thiết bị khác: Cân điện tử SARORIUS (Nhật); máy đo pH (320 pH meter), METTLER TOLEDO, Thuỵ Sĩ; pipetman; máy đo quang Model 80 – 2088 – Anh; máy khuấy từ; lò vi sóng; máy ly tâm, máy sấy chân không,… IV. CÁC KĨ THUẬT SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI 1. Phân lập giống vi sinh vật thuần khiết [1] Cơ sơ của phương pháp: Trên môi trường dinh dưỡng đặc, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc riêng biệt. mỗi khuẩn lạc này sẽ tiếp tục được tách ra và nuôi cấy riêng. Kết quả là thu được vi sinh vật thuần khiết từ một hỗn hợp các vi sinh vật. Vật liệu: Trong đề tài nghiên cứu của mình Bacillus subtilis TH2 được phân lập từ chế phẩm Natto thương mại nhập khẩu từ Nhật. Từ chế phẩm này áp dụng các phương pháp vi sinh vật để phân lập được vi sinh vật mong muốn Phương pháp phân lập vi khuẩn: Cho 1 g mẫu, hoặc 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất thanh trùng. Ta có độ pha loãng 10-1. Tiếp đó lấy từ trong dịch pha loãng nảy 1 ml dịch cho tiếp vào 9 ml nước cất thanh trùng ta có độ pha loãng 10-2. Cứ như thế ta có độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5… Với những nồng độ đó lấy 0,1 ml canh trường cho vào đĩa pectri chứa môi trường thạch dinh dưỡng, dùng que trang dàn đều canh trường ra khắp bề mặt thạch, mỗi nồng độ trang 3 đĩa, mang nuôi ở điều kiện thích hợp 400C trong thời gian 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, các khuẩn lạc phát triển riêng rẽ, lấy que cấy móc từng khuẩn lạc cấy vào ống thạch nghiêng. Kiểm tra hình thái vi khuẩn để xác định sự đồng nhất của vi sinh vật phân lập được. Dựa vào đặc điểm hình thái học, sinh lý học để định tên vi khuẩn. 2. Phương pháp định tên vi sinh vật Khi muốn nghiên cứu bất kì một quá trình nào liên quan đến hoạt động sống của vi sinh vật ta cần phải biết vị trí phân loại của các vi sinh vật gây ra quá trình này. Để định tên vi sinh vật người ta sử dụng nhiều đặc điểm khác nhau: Đặc điểm hình thái học, về nuôi cấy, về sinh lý-sinh hoá học, các thử nghiệm huyết thanh học và thử nghiệm về tính mẫn cảm đối với thực khuẩn thể nữa. Hiện nay dựa vào cấu trúc DNA người ta cũng có thể sử dụng kít định tên vi sinh vật. Trong nghiên cứu này em sử dụng phương pháp định tên vi sinh vật dựa vào đặc điểm hình thái, khả năng trao đổi chất và lên men một số loại đường. 2.1. Nguyên tắc của phương pháp Mỗi vi sinh vật được đặc trưng bởi các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá học khác nhau. Để định tên cho vi sinh vật cần xác định xem vi sinh vật có đặc điểm hình thái như thế nào, sử dụng được các loại thức ăn ra sao và những biến đổi gì sẽ xảy ra trong môi trường khi chúng phát triển. Sự phát triển của vi sinh vật có thể tạo ra việc tích luỹ các axit hữu cơ, các sản phẩm trung hoà, các loại khí,… Căn cứ vào đó có thể xác định được loại vi sinh vật mà ta đang sử dụng. 2.2. Phương pháp Các thí nghiệm được dùng để định tên vi khuẩn bao gồm: Xác định hình dạng của vi khuẩn, khả năng tạo catalaza, khả năng sử dụng tinh bột tan, khả năng phân huỷ gelatin, khả năng đồng hoá citrate, khả năng lên men các loại đường: Galatoza, glucoza, arabinoza, rafinoza, manitol, maltoza, saccaroza, lactoza, xyloza. 2.2.1. Hình dạng vi khuẩn Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng có thành phần thích hợp ở điều kiện 370C, sau 18 – 24 giờ có thể lấy canh trường vi khuẩn để nhuộm Gram. 2.2.2. Hình thái khuẩn lạc Để quan sát hình thái khuẩn lạc, nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NA đặc trong các đĩa pectri ở 370C. Sau 24 giờ lấy đĩa ra quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc. 2.2.3. Khả năng tạo catalaza Một vài loại vi khuẩn và đại thực khuẩn có khả năng làm biến đổi hai nguyên tử O thành peroxit và superoxit. Cả hai loại phân tử này đều độc đối với vi khuẩn. Tuy nhiên nhiều loại vi khuẩn có cơ chế bảo vệ để có thể giảm thiểu tác hại của hai chất này. Các vi khuẩn có sức đề kháng như thế nàt sử dụng hai enzym để xúc tác sự chuyển ngược lại từ peroxit và superoxit thành hai nguyên tử O và nước. Một trong các enzym là catalaza và sự có mặt của nó có thể được nhận ra bằng kĩ thuật kiểm tra đơn giản. Kĩ thuật catalaza bao gồm thêm H2O2 vào canh trường hoặc trên thạch nghiêng. Nếu vi khuẩn có phản ứng catalaza chúng sẽ chuyển hoá H2O2 và tạo ra khí O2. Sự tạo khí gây ra các bong bóng biểu thị phản ứng dương tính nghĩa là vi khuẩn đó có khả năng gây phản ứng catalaza. Phương pháp: Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên đĩa, dùng que gạt dàn đều và nuôi trong tủ ấm. Khi thấy khuẩn lạc mọc thì nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3 % lên khuẩn lạc. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có catalaza trong tế bào [3]. 2.2.4. Khả năng lên men đường trong môi trường lỏng Môi trường lên men có thành phần như sau (trong 1000 ml nước máy): NH4H2SO4 1 g KCl 0,2 g MgSO4.H2O 0,2 g Peptone 1-2 g Đường 0,5 – 1 % Dùng NaOH điều chỉnh pH = 7; thanh trùng 1100C; 30 phút [3]. 2.2.5. Khả năng phân giải gelatin Thành phần môi trường để thử khả năng phân giải gelatin bao gồm các chất như sau (trong 1000 ml nước cất): K2HPO4 7 g KH2PO4 2 g MgSO4. 7H2O 0,1 g Citrate .2H2O 0,5 g Cao nấm men 1 g Gelatin 50 g CaCl2.2H2O 1 g Glucoza 10 g Pepton 10 g Dùng NaOH điều chỉnh pH = 7, thanh trùng1100C, 30 phút Đổ vào đĩa pectri nuôi ở điều kiện thích hợp. Sau khi vi khuẩn phát triển thử khả năng phân giải gelatin bằng (NH4)2SO4 trong 5-10 phút sau đó đổ đi, đo đường kính vòng phân giải. Nếu vi khuẩn có khả năng phân huỷ gelatin sẽ tạo vòng phân huỷ xung quanh chỗ khuẩn lạc phát triển [3]. 2.2.6. Khả năng sử dụng tinh bột tan Cấy vi khuẩn trên các môi trường đặc đã bổ sung 1-3 % tinh bột tan. Sau vài ngày nuôi cấy ở điều kiện thích hợp lấy ra và thử bằng dung dịch lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng phân huỷ tinh bột thì chúng sẽ tạo thành một vòng vô màu xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển (các phần khác có màu xanh tím). Thành phần môi trường (trong 1000ml nước máy): NaCl 10,32 g Peptone 5,18 g Cao thịt 5,18 g Agar 15,5 g Tinh bột tan 10-30 g pH = 6,5 – 6,7; thanh trùng 1100C; 30 phút [3]. 2.2.7. Khả năng đồng hoá xitrate Khả năng sử dụng xitrate là đặc trưng của các loài Bacillus không gây bệnh. Vì thế việc kỉêm tra khả năng đồng hoá xitrate là cần thiết để xác định chủng phân lập được là không gây bệnh. Thành phần môi trường (1000ml nước cất): NaCl 5 g Agar 20 g Bromtimol blue (5% trong cồn) 20 ml NH4H2PO4 1 g MgSO4.7H2O 0,2 g K2HPO4 1 g Na3C6H5O7.2H2O 23 g pH= 6,7; thanh trùng 1100C; 30 phút. Vi khuẩn có khả năng sử dụng xitrate khi phát triển sẽ tạo các muối cacbonat làm tăng pH của môi trường làm cho màu của chỉ thị chuyển từ màu xanh lục sang xanh lam [3]. 3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Một trong các đặc điểm của vi sinh vật là sự phụ thuộc một cách đặc biệt vào các điều kiện của môi trường xung quanh. Sự phản ứng của vi sinh vật với các điều kiện môi trường mạnh hơn với các vi sinh vật khác là do chúng có kích thước rất nhỏ bé làm cho vi sinh vật tiếp xúc chặt chẽ với môi trường. Các nhân tố môi trường ngoài rất đa dạng. Trong đó quan trọng nhất phải kể đến thành phần môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển. Chỉ một sự biến đổỉ nhỏ trong thành phần dinh dưỡng cũng có thể làm vi khuẩn phát triển mạnh mẽ hoặc bị diệt vong. Các yếu tố hoá lý cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi sinh vật như pH, nhiệt độ, áp suất, nồng độ oxy,… Những vi sinh vật chỉ phát triển trong môi trường và điều kiện ngoại cảnh giới hạn xác định. Bất kỳ biến đổi của một nhân tố nào đó trong phạm vi nhất định cũng lảm ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hoạt động trao đổi chất của chúng. trong phạm vi nghiên cứu của mình em chỉ xác định một số yếu tố ảnh hưởng sau: 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy sự phát triển của vi sinh vật Hoạt động sống của vi khuẩn có thể coi là kết quả của các phản ứng hoá học. vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào. Và mỗi loài vi khuẩn có nhiệt độ phát triển tối thích khác nhau. xác định nhiệt độ tại đó vi khuẩn tăng trưởng nhanh nhất và nhiều nhất là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu trong việc nuôi vi khuẩn thu sinh khối. Trong nghiên cứu này nhiệt độ thích hợp của vi khuẩn được xác định bằng cách nuôi vi khuẩn trong môi trường NA lỏng và đo OD sau khoảng thời gian 6h/lần. Nhiệt độ phát triển thích hợp là nhiệt độ tại cho OD max và sau thời gian ngắn nhất. 3.2 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng đến hoạt động sống của vi sinh vật Sự thay đổi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến hoạt động sống của vi sinh vật. Sự thay đổi này được xác định bằng cách đo OD ở 600 nm. Trong nghiên cứu này tôi tiến hành thay đổi 2 yếu tố trong môi trường dinh dưỡng là NaCl và glucoza để xác định điều kiện phát triển thích hợp của Bacillus subtilis Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang của canh trường vi khuẩn. 3.2.1. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phát triển của vi sinh vật Nuôi cấy vi khuẩn TH2 trong môi trường NA lỏng có bổ sung NaCl với các nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1; 3; 6; 10% ở điều kiện 400C và đo OD (600 nm) 6h/lần. Lượng canh trường bổ sung vào môi trường là 10%. 3.2.2. Ảnh hưởng của glucoza đến sự phát triển của vi sinh vật Sau khi tìm được nồng độ NaCl thích hợp cho sự phát triển của TH2, tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của glucoza tới sự phát triển của TH2 bằng cách bổ sung 10% canh trường vi khuẩn vào môi trường NA lỏng có bổ sung lần lượt glucoza với nồng độ là 0, 2, 4,6, 8, 10%. ở mỗi nồng độ tiến hành nuôi cấy ở 400C và đo OD (600nm) 6h/lần. 3.3. Thay đổi pH môi trường trong quá trình phát triển của vi sinh vật Trong quá trình phát triển của vi khuẩn tiến hành đo pH môi trường bằng máy đo pH. 4. Phương pháp tạo chế phẩm lên men Natto 4.1 Tạo chế phẩm Chủng vi khuẩn sau khi phân lập và định tên được nuôi cấy trong môi trường NA lỏng có bổ sung Glucoza 2%, 400C với tốc độ lắc 200v/p. Tiến hành thu sinh khối sau 30 h bằng ly tâm với tốc độ 7000v/p trong thời gian 15 phút. Sinh khối được bổ sung chất mang (gồm bột đậu tương, đường glucoza với tỷ lệ 3:1) và khảo sát nhiệt độ sấy để xác định nhiệt độ sấy thích hợp. 4.2. Bảo quản chế phẩm lên men Natto Mục đích: Giảm hàm ẩm của chế phẩm để cho vi sinh vật không có điều kiện phát triển hoặc phát triển rất chậm. Phương pháp: Tiến hành sấy chế phẩm trong thiết bị sấy chân không. Trong nghiên cứu này tiến hành xác định nhiệt độ sấy thích hợp bằng cách tiến hành sấy chế phẩm ở một số nhiệt độ khác nhau trong thời gian 3h. Sau đó xác định độ ẩm và tỷ lệ sống sót của tế bào. Chế độ sấy thích hợp là chế độ cho tỷ lệ tế bào sống cao nhất và có độ ẩm < 12%. Sơ đồ PII.4: Quy trình tạo chế phẩm lên men Natto Bột đậu tương (75%w/w) Chất mang Thanh trùng (1100C; 30 phút) Glucoza (25% w/w) Sinh khối vi khuẩn Chế phẩm lên men Natto Chế phẩm Sấy khô (350C; 3h) Môi trường NA lỏng bổ sung 2% glucoza; nuôi ở 400C, 30 h Canh trường vi khuẩn Phối trộn 10% Ly tâm 7000 v/p; 15 phút 4.3. Nghiên cứu đặc tính của chế phẩm 4.3.1. Xác định độ ẩm của chế phẩm lên men Natto Chế phẩm sau sấy ở các nhiệt độ khác nhau được đo độ ẩm bằng máy sấy hồng ngoại. Mục đích của việc này là xác định độ ẩm của chế phẩm sau khi sấy nhằm tìm ra phương pháp sấy thích hợp nhất cho việc bảo quản chế phẩm. 4.3.2. Xác định số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và xác định tỷ lệ tế bào sống Hoà 1g chế phẩm vào 9 ml nước cất thanh trùng, pha loãng kế tiép dung dịch đến các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4,… sau đó ứng với mỗi nồng độ pha loãng cấy trải dịch pha loãng lên 3 đĩa thạch môi trường thích hợp. Đặt đĩa thạch trong tủ cấy 400C, thời gian 18-24 h. Dùng phương pháp đếm khuẩn lạc và tính kết quả. Chỉ đếm các đĩa có ừ 30-300 khuẩn lạc. Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g chế phẩm được tính theo phương pháp đếm CFU (Colony forming unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc) [7]. đếm 3 đĩa của mỗi nồng độ pha loãng và ết quả là giá trị trung bình cả 3 lần đếm. * CFU của chế phẩm được tính theo công thức sau: N = (Ai x Di) / V Trong đó Ai: Số khuẩn lạc trung bình/đĩa. Di: Độ pha loãng. V: Lượng dịch huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (0,1 ml). * Tỷ lệ tế bào sống (TTS) TTS = (CFUSS/ CFUTS) x (mSS/mTS) Trong đó CFUTS: CFU trước khi sấy CFUSS: CFU sau khi sấy mSS: Khối lượng chế phẩm sau khi sấy mTS: Khối lượng chế phẩm trước khi sấy [8]. 5. Quy trình sản xuất Natt Sơ đồ PII.6: Quy trình sản xuất Natto Chế phẩm (1g) Ngâm nước (12-24 h; 250C) Tàng trữ (400C, 48h) Nước cất (1 ml) Đậu tương Hấp chín (1100C,30 phút) Hoà tan Phối trộn Lên men (400C; 24h) Sản phẩm Natto 5.1. Vật liệu Đậu tương 500 g. Chế phẩm vi sinh vật Lựa chọn và ngâm đậu Trước khi ngâm đậu tương phải phân loại đậu tương theo kích thước hạt. Đậu tương sử dụng phải đạt tiêu chuẩn như sau: 5.1.1. Kích thước Đậu tương được phân thành 4 loại theo đường kính: - Loại rất nhỏ d < 5,5 mm - Loại nhỏ vừa d = 5,5-7,3 mm - Loại vừa d = 7,3-7,9 mm - Loại lớn d > 7,9 mm Kích thước: Người ta thường dùng loại đậu nhỏ và nhỏ vừa để làm natto. Một số nơi người ta lại thích dùng đậu tương loại to. Natto từ đậu tương nhỏ và nhỏ vừa có hương đặc trưng riêng và vị đậm do lên men quá mức. Có báo cáo cho rằng hoạt tính của protease kiềm tính (subtilisin) ở natto làm từ đậu nhỏ thì cao hơn từ đậu to. Tuy nhiên hoạt tính của protease trung tính (metalloprotease) thì không khác nhau với các kích thước đậu tương khác nhau. Kết quả này cho thấy sự thủy phân protein từ đậu nhỏ lớn hơn của đậu lớn trong suốt quá trình nửa sau của quá trình lên men khi giá trị pH của sản phẩm tăng do hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn. Điều này có thể gây ra mùi và vị mạnh hơn của natto làm từ đậu nhỏ so với đậu lớn. Natto từ đậu nhỏ có mùi amoniac yếu hơn và cho thấy tốc độ thủy phân protein chậm hơn mặc dù mùi natto như vậy vẫn có thể chấp nhận. 5.1.2. Màu sắc Đậu tương có màu nâu nhạt lấp lánh hoặc bề mặt màu vàng nâu và rốn hạt màu vàng nhẹ Natto làm từ. Đậu tương có màu nâu hoặc đen theo truyền thống không được bán ở Nhật do nó không ngon và không có mùi amoniac đặc trưng. Tuy nhiên các sản phẩm Natto từ đậu tương đen hiện nay đang được bán do hàm lượng polyphenol của nó đã được tăng lên. 5.1.3. Ảnh hưởng của chất lượng của đậu tương tới chất lượng Natto thành phẩm a/ Hàm lượng protein Tế bào Bacillus subtilis natto sử dụng protein, polypeptit và axit amin trong đậu tương để phát triển. Chất lượng, chủng loại polypeptit và axit amin được tạo ra bởi sự hoạt động của vi khuẩn trong quá trình lên men ảnh hưởng tới yêu cầu về mùi của Natto. Bởi những thông số này các loại đậu tương có hàm lượng protein cao, màu nhạt và độ bóng được sừ dụng khi lên men Natto đã cho chất lượng sản phẩm tốt hơn. b/ Hàm lượng đường Ảnh hưởng mạnh đến chất lượng và mùi vị của Natto. Đậu tương phải có hàm lương hydratcarbon sẵn có, đủ để vi khuẩn phát triển. Bởi vì đậu tương nhỏ hơn bình thường có hàm lượng đường cao hơn, nên nó được ưa dùng hơn trong quá trình sản xuất Natto. Vì sự bảo quản Natto cần xác định được mùi amoiac nên hàm lượng amoniac cần được quan tâm như là đặc tính quan trọng nhất trong quá trình sản xuất Natto. Tuy nhiên có báo cáo cho rằng đậu tương với hàm lượng đường cao thì không phải cần thiết nhất, hàm lượng đường tự do thì không quan trọng bằng hàm lượng đường tổng số. Vì lí do này Bacillus subtilis natto có thể tận dụng các saccharit như sucroza, rafinoza và stachynoza (nhưng không sử dụng tinh bột) cho sự phát triển. Các hạt đậu nhỏ thì dễ mềm hơn các hạt lớn hoặc trung bình khi hấp. Sự liên quan giữa độ chắc của đậu và hàm lượng amoniac trong quá trình sản xuất Natto đã được biết tới. Báo cáo này cho rằng trong những hạt rắn, khi đậu tương chín, sự thủy phân các hợp chất của Bacillus subtilis natto có thể chỉ xảy ra ở trên bề mặt. Còn các thành phần bên trong chưa được thủy phân. Điều này nghĩa là chỉ các đường ở bề mặt được thủy phân trong thời gian ngắn và thủy phân protein cũng chỉ xảy ra trong thời kì đầu của lên men. Điều này tạo ra mùi mạnh. Do đó phải chọn đậu nhỏ và có hàm lượng đường cao rồi hấp thật mềm. Tiêu chuẩn hấp 1,5 KG/cm2 trong 20 phút. 5.2. Thiết bị Nồi hấp (tốt nhất là nồi hấp áp lực). Khay làm bằng thép không gỉ hoặc inox dài 25 cm, rộng 12 cm, cao 5cm. Thiết bị ổn nhiệt, thiết bị giữ lạnh, nhiệt kế 5.3. Phương pháp 5.3.1. Ngâm đậu tương Đậu tương được tạo điều kiện ngậm nước để trương nở với tỷ lệ đậu tương:nước = 1:3 Thời gian ngâm: Mùa đông 24h, mùa hè 12h Dừng ngâm nước khi quan sát thấy có hiện tượng sủi bong bóng trên bề mặt nước ngâm. 5.3.2. Hấp chín đậu tương Mục đích: Phá vỡ cấu trúc, phá vỡ thành tế bào để vi sinh vật có thể xâm nhập vào. Điều kiện: 1100C, 1at Thời gian: 30 phút Thiết bị: Sử dụng nồi hấp Sau đó hạ nhiệt độ xuống tới 500C Đậu tương chín được cho vào các khay với chiều dày lớp đậu tương vừa phải để vi sinh vật đủ oxy để có thể phát triển. 5.3.3. Chuẩn bị giống Lấy 1 g chế phẩm hoà vào 1 ml nước cất ta được dung dịch vi khuẩn. Dung dịch này đem trộn với đậu tương đã hấp chín rồi đem lên men. 5.3.4. Lên men Nhiệt độ lên men: 370C- 420C Thời gian:24 giờ Điều kiện: Hiếu khí Thiết bị: Quá trình lên men thực hiện trong thiết bị ổn nhiệt 5.3.5. Tàng trữ Mục đích: Tạo hương vị, màu sắc và trạng thái vật lý của sản phẩm. Thời gian tàng trữ: 2 ngày Nhiệt độ: 40C. Sản phẩm Natto sau quá trình chế biến phải đạt tiêu chuẩn sau: - Natto có độ nhớt thích hợp - Vị ngọt - Màu thay đổi nhẹ sau khi tàng trữ - Rốn hạt và bề mặt vẫn giữ được màu vàng màu sáng. 6. Đặc tính cảm quan của sản phẩm Sản phẩm Natto tạo ra được so sánh về mặt cảm quan như kích thước, màu sắc, mùi vị, độ nhớt với Natto thương phẩm ở trên thị trường. PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phân lập vi khuẩn TH2 từ Natto Lấy chế phẩm (khoảng 1-2g) cho vào ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng sau đó lắc mạnh, có thể sử dụng máy Votex, để vi khuẩn phân bố vào trong nước. Ống nghiệm này được đun tới nhiệt độ 750C trong khoảng 20 phút. Dùng pipet hút 0,1 ml dịch trong ống này đem trải lên đĩa pectri chứa môi trường MRS, dùng que trang dàn đều dịch lên bề mặt và nuôi cấy ở 370C trong thời gian 24h. Khi vi khuẩn đã mọc lên thành các khuẩn lạc riêng rẽ tiếp tục làm sạch để thu vi khuẩn thuần khiết. Hình PIII.1: Chế phẩm Natto dùng để phân lập vi khuẩn Phương pháp phân lập được tiến hành như vậy dựa trên cơ sở vi khuẩn Bacillus subtilis là vi khuẩn có khả năng tạo bào tử ở điều kiện nhiệt độ 750C. Phương pháp này giúp loại bỏ các tế bào sinh dưỡng. Đồng thời do sản phẩm Natto được sản xuất từ chủng vi sinh vật thuần khiết nên việc lựa chọn các khuẩn lạc phát triển nhiều nhất trên bề mặt thạch là từ các tế bào có khả năng tạo bào tử cho khả năng phân lập được Bacillus subtilis là rất cao. Sau một số lần làm sạch với nguyên tắc như vậy đã phân lập được vi khuẩn từ mẫu chế phẩm Natto. Vi khuẩn phân lập được đặt tên là TH2 và tiếp tục được định tên. 2. Định tên vi khuẩn TH2 Sau khi phân lập được TH2 từ Natto, ta tiến hành định tên vi khuẩn dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn. Vi khuẩn TH2 sau khi phân lập được tiến hành định tên theo phương pháp vi sinh. Với điều kiện nuôi cấy 37°C nhận được các kết quả như sau: 2.1 Hình dạng vi khuẩn Nuôi vi khuẩn trong môi trường NA ở 37°C, sau 18 h đem nhuộm Gram. Kết quả cho thấy vi khuẩn TH2 là các trực khuẩn có khả năng tạo bào tử và bắt màu Gram dương. Hình PIII.2.1: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn TH2. 2.2 Hình thái khuẩn lạc Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường NA, vi khuẩn TH2 phát triển thành các khuẩn lạc riêng rẽ với hình dạng dưới đây Hình PIII.2.2: Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn TH2 Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường NA được thể hiện trong bảng PIII.2.2 dưới đây Bảng PIII.2.2: Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis TH2. Đặc điểm Kết quả Hình dạng Tròn không đồng đều, màu trắng sữa (ở rìa mép trắng trong và đi từ ngoài vào trong đục dần) Kích thước Đường kính 5 mm Mép bờ Răng cưa không đều Bề mặt Nhăn nheo, có núm ở giữa, nhô lên cao hơn hẳn bề mặt khuẩn lạc Mặt cắt ngang Có sự lối lõm, không đều Vị trí phát triển Trên bề mặt thạch, bám không chắc chắn vào bề mặt. 2.3. Khả năng tạo Catalaza Nhỏ giọt H2O2 3 % lên khuẩn lạc của vi khuẩn TH2 đã phân lập được thấy có bọt khí xuất hiện. điều đó chứng tỏ TH2 có khả năng tạo Catalaza và phản ứng Catalaza là dương tính. 2.4. Khả năng sử dụng tinh bột tan Sau khi cấy huyền phù vi khuẩn lên môi trường NA có bổ sung 2 % tinh bột tan, nuôi cấy ở 37°C sau 24 giờ và nhuộm môi trường bằng lugol cho thấy có xuất hiện vòng vô màu xung quanh chỗ vi khuẩn phát triển. Như vậy TH2 có khả năng sử dụng tinh bột tan. 2.5. Xác định khả năng phân huỷ gelatin Canh trường vi khuẩn được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, sau khi thử khả năng phân giải bằng (NH4) 2SO4 thấy có vòng phân huỷ gelatin đường kính 5mm xung quanh chỗ có khuẩn lạc phát triển. như vậy TH2 có khả năng tạo gelatinaza và khả năng phân huỷ gelatin là dương tính. 2.6. Khả năng đồng hoá xitrat Cấy giống theo hình zic zắc trên ống thạch nghiêng chưa môi trường như kể trên và nuôi 18-24 h cho thấy không có sự đổi màu môi trường từ xanh lục sang xanh lam chứng tỏ TH2 không có khả năng đồng hoá xitrat. 2.7. Khả năng lên men các loại đường Được tiến hành trong môi trường lỏng kết quả cho thấy vi khuẩn TH2 có thể sử dụng tất cả các loại đường đã kiểm tra bao gồm: Glucoza; Saccaroza; Maltoza; Manitol; Xyloza; Arbinoza; Arfinoza; Lactoza; D-galactoza. Bảng kết quả tổng hợp Các kết quả định tên được tổng hợp vào bảng sau và được so sánh với các chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất [37]; và Bacillus subtilis CN2 phân lập từ nước mắm [38]. Bảng PIIII.2: Kết quả định tên vi khuẩn theo phương pháp vi sinh Các đặc tính TH2 Bacillus subtilis Bacillus subtilis CN2 Hình dạng Hình que, rời rạc Hình que, rời rạc Hình que, rời rạc Gram + + + Catalaza + + + Tinh bột tan + + + Gelatin + + + Đồng hoá xitrat - + + Glucoza + + + Saccaroza + Không kiểm tra Không kiểm tra Maltoza + - + Manitol + + + Xyloza + - + Arabinoza + + + Rafinoza + - + Lactoza + + + D-galactoza + + - Dựa vào bảng PIII.2 ta có thể kết luận vi khuẩn đã phân lập được thuộc chủng Bacillus, loài subitlis, chủng này được đặt tên là TH2. Tuy cùng là loài Bacillus subtilis nhưng do là các chủng được phân lập từ các nguồn khác nhau nên có một số đặc tính khác nhau. 3. Xác định đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Bacillus subtilis TH2 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của Bacillus subtilis TH2 Môi trường sử dụng để xác định sự phát triển của vi khuẩn tại các nhiệt độ khác nhau là môi trường NA tại các nhiệt độ khác nhau là 20, 30, 40 và 50 0C. Đo OD ở bước sóng 600 nm trong quá trình lên men 6 h/lần. Kết quả sự phát triển của vi khuẩn được thể hiện trên bảng và trên đồ thị sau: Bảng PIII.3.1:Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của Bacillus subtilis TH2 Thời gian (h) OD600nm ở các nhiệt độ khác nhau 200C 300C 400C 500C 0 0.003 0.014 0.003 0.011 6 0.003 0.055 0.004 0.014 12 0.003 0.233 0.010 0.305 18 0.004 0.442 0.524 1.197 24 0.005 1.465 1.280 1.858 30 0.006 1.851 1.970 1.921 36 0.007 1.999 2.052 1.940 42 0.007 2.077 2.230 1.969 48 0.009 2.250 2.268 2.020 54 0.025 2.298 2.385 2.082 60 0.200 2.301 2.688 2.109 66 0.205 2.325 2.674 2.120 72 0.228 2.346 2.612 2.186 78 0.229 2.353 2.526 2.202 84 0.247 2.423 2.520 2.214 90 0.249 2.447 2.512 2.238 96 0.252 2.494 2.217 2.260 102 0.260 2.511 2.210 2.276 108 0.300 2.522 2.202 2.357 114 0.252 2.555 - 2.400 120 0.306 2.568 - 2.336 126 0.311 2.541 - 2.275 132 0.320 2.550 - 2.173 138 - 2.517 - 2.171 144 - 2.178 - - Ghi chú (-): Chưa xác định Hình PIII.3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của Bacillus subtilis TH2 Từ bảng PIII.3.1 và đồ thị trên hình PIII.3.1 thể hiện sự phát triển của vi khuẩn ta thấy khi lên men mật độ của vi khuẩn cao nhất sau 60 h trong điều kiện 40°C (OD600nm = 2,688). Ở nhiệt độ này, do mới được bổ sung vào môi trường, vi khuẩn phải trải qua giai đoạn thích nghi khá dài. Tới 12 h vi khuẩn bước vào pha phát triển logarit. Sau 60 h vi khuẩn chuyển sang pha phát triển cân bằng. Giai đoạn này kéo dài tới 108h, sau đó vi khuẩn bắt đầu bước vào giai đoạn suy thoái. Còn khi nuôi cấy trong các điều kiện nhiệt độ khác thì sự phát triển của vi khuẩn chậm hơn nhiều. Sự phát triển chậm nhất được quan sát ở nhiệt độ 200C, tại nhiệt độ này thời gian thích ứng của vi khuẩn là rất dài (kéo dài tới 132 h)và do giới hạn về thời gian thí nghiệm nên không xác định được giai đoạn phát triển cân bằng; trong điều kiện 300C thì vi khuẩn phát triển tốt nhưng mật độ tế bào đạt tối đa sau thời gian khá dài, tới tận 132 h; mật độ tế bào cũng đạt tương đối cao trong điều kiện lên men ở 500C nhưng thời gian để đạt tới nồng độ này lên tới 156 h. Như vậy qua việc khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ta thấy nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn TH2 là 40°C. Điều này chứng tỏ Bacillus subtilis TH2 phân lập từ Natto là loại vi khuẩn ưa nhiệt. Tuy vậy, nhiệt độ này vẫn là khá thấp so với một số loài Bacillus subtilis pphân lập từ đất (600C) [37] và Bacillus subtilis CN2 phân lập từ nước mắm (550C) [38]. 3.2. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phát triển của Bacillus subtilis TH2 Nuôi cấy vi khuẩn ở điều kiện 40C, sử dụng môi trường NA có bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau 0; 0,5; 1; 3; 6; 10 %. Do mục đích là thu sinh khối nên chỉ khảo sát ảnh hưởng của NaCl trong khoảng 0- 60 h, đây là thời gian để vi khuẩn đạt đến giai đoạn phát triển cân bằng (theo phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ). Đo OD ở bước sóng 600 nm để xác định ảnh hưởng của NaCl lên sự phát triển của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau ta có kết quả được thể hiện trên đồ thị như sau: Bảng PIII.3.2: Ảnh hưởng của NaCl đến sự phát triển của Bacillus subtilis TH2 Thời gian (h) OD600nm ở các nồng độ NaCl khác nhau 0% 0.5% 1% 3% 6% 10% 0 0.014 0.003 0.014 0.016 0.017 0.013 6 0.025 0.004 0.03 0.019 0.033 0.034 12 0.025 0.010 0.035 0.022 0.039 0.02 18 1.401 0.524 1.021 1.165 0.241 0.012 24 1.945 1.280 1.559 1.275 1.202 0.139 30 1.977 1.970 1.872 1.415 1.32 0.567 36 1.781 2.052 1.635 1.417 1.33 0.689 42 2.278 2.230 1.892 1.419 1.436 0.81 48 2.444 2.268 1.991 1.856 1.411 1.23 54 2.495 2.385 2.14 1.883 1.709 1.242 60 2.52 2.688 2.405 1.736 1.356 0.393 66 2.543 2.674 2.165 2.215 1.381 0.135 Thời gian (h) Hình PIII.3.2: Ảnh hưởng của NaCl lên sự phát triển của Bacillus subtilis TH2. Từ kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự phát triển của vi khuẩn ta thấy: Trong thời gian từ 0 -12 h vi khuẩn phát triển rất chậm do đây là giai đoạn thích nghi của vi khuẩn với các thành phần NaCl trong môi trường. Giai đoạn phát triển luỹ tiến bắt đầu từ 12 đến 60 giờ. Ở giai đoạn này mật độ của vi khuẩn tăng rất nhanh và ở nồng độ NaCl là 0% thì sự phát triển này là nhanh nhất và cao nhất. Sau 30 giờ mật độ vi khuẩn cao nhất ở nồng độ NaCl 0 %. Sau khi khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trong giai đoạn phát triển luỹ tiến ta thấy môi trường không bổ sung NaCl là tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn với mục đích thu sinh khối. Như vậy môi trường thu sinh khối không cần bổ sung NaCl. 3.3. Ảnh hưởng của Glucoza đến sự phát triển của Bacillus subtilis TH2 Với điều kiện nhiệt độ 40°C và môi trường NA không bổ sung NaCl, để xác định ảnh hưởng của nồng độ Glucoza, ta bổ sung nó vào môi trường ở 6 nồng độ là 0, 2, 4, 6, 8, 10 %. Xác định sự phát triển của tế bào thông qua đo OD tại bước sóng 600 nm. Kết quả khảo sát được thể hiện ở đồ thị sau: Bảng PIII.3.3: Ảnh hưởng của Glucoza tới sự phát triển của Bacillus subtilis TH2. Thời gian (h) OD600nm tại các nồng độ glucoza khác nhau 0% 2% 4% 6% 8% 10% 0 0.003 0.036 0.039 0.047 0.046 0.035 6h 0.004 1.049 0.839 0.853 0.583 0.631 12 0.010 1.932 1.873 1.835 1.583 1.590 18 0.524 2.237 2.476 2.564 2.173 2.266 24 1.280 2.378 2.571 2.577 2.598 2.532 30 1.970 2.527 2.608 2.779 2.741 2.741 36 2.052 2.592 2.733 2.817 2.763 2.686 42 2.230 2.690 2.841 2.840 2.807 2.765 48 2.268 2.675 2.751 2.814 2.771 2.788 54 2.385 2.669 2.625 2.756 2.764 2.798 60 2.688 2.632 2.547 2.684 2.756 2.678 66 2.674 2.626 2.435 2.647 2.742 2.641 Hình PIII.3.3: Ảnh hưởng của Glucoza tới sự phát triển của Bacillus subtilis TH2 Qua đồ thị ta thấy ảnh hưởng của glucoza tới sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 là rất rõ rệt. Khi môi trường có bổ sung glucoza thì vi khuẩn phát triển rất tốt, giai đoạn thích nghi rất ngắn và đạt tới giai đoạn phát triển luỹ tiến rất nhanh. Chỉ sau 30 h vi khuẩn đã đạt đến giai đoạn phát triển cân bằng. Giai đoạn cân bằng kéo dài đến 60 h thì mật độ tế bào bắt đầu giảm nghĩa là chuyển sang giai đoạn suy thoái. Sinh khối cần được thu ở đầu giai đoạn phát triển cân bằng. ở thời điểm này thì với các nồng độ Glucoza khác nhau cũng có sự chênh lệch về mật độ sinh khối thấp. Ngược lại, khi không bổ sung glucoza thì vi khuẩn phát triển chậm hơn hẳn kéo dài thời gian thích nghi tới tận 12h và giai đoạn phát triển luỹ tiến kéo dài từ 12 – 60 giờ. Như vậy để thu sinh khối vi khuẩn ta có thể sử dụng môi trường chứa 2% glucoza để giảm thời gian nuôi cấy, thành phần và chi phí cho môi trường thu sinh khối. 3.4. Thay đổi của pH trong quá trình phát triển của vi khuẩn Với các điều kiện nuôi cấy thích hợp, tiến hành đo pH của vi khuẩn trong quá trình phát triển tại một số nhiệt độ 30, 40 và 500C ta có bảng kết quả sau: Bảng PIII.3.4: Thay đổi pH môi trường trong quá trình phát triển của Bacillus subtilis TH2 Thời gian (h) Giá trị pH tại các nhiệt độ khác nhau 300C 400C 500C 0 4.84 4.84 4.84 6 4.86 4.87 4.87 12 4.89 4.93 4.99 18 5.44 6.51 7.04 24 7.66 7.75 7.85 30 7.99 8.05 8.11 36 8.00 8.1 8.15 42 8.10 8.12 8.08 48 8.34 8.39 8.44 54 8.41 8.42 8.47 60 8.46 8.45 8.42 66 8.48 8.5 8.56 72 8.51 8.54 8.74 78 8.63 8.65 8.71 84 8.68 8.68 8.68 90 8.55 8.71 8.64 96 8.76 8.67 8.63 102 8.80 8.6 8.59 108 8.77 8.58 8.55 114 8.68 8.58 8.54 120 8.74 8.43 8.51 126 8.88 8.45 8.51 132 8.87 8.5 8.53 138 9.04 8.49 8.54 144 8.94 8.5 8.56 150 8.91 8.44 8.59 156 8.96 - - 162 8.98 - - Ghi chú (-): Chưa xác định Hình PIII.3.4: Thay đổi của pH trong quá trình phát triển của Bacillus subtilis TH2. Từ kết quả đo sự thay đổi pH trong quá trình nuôi cấy cho thấy sự thay đổi pH là không đáng kể, pH trong môi trường tăng dần từ 4,84 đến 8,9. Như vậy trong quá trình phát triển của Bacillus subtilis TH2 không có sự tạo thành axit trong môi trường. 4. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật lên men Natto 4.1 Tạo chế phẩm lên men Natto Nuôi vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 trong môi trường NA bổ sung 2% Gluoza, 40°C, 30 h, lắc 200 v/p. Canh trường được ly tâm ở 7000 v/p trong 10 phút để thu sinh khối. Chất mang được sử dụng để tạo chế phẩm là hỗn hợp của đậu tương và glucoza theo tỷ lệ Glucoza : Đậu tương = 1:3 (w/w). Tỷ lệ phối trộn Sinh khối : Chất mang = 8 %(w/w). Hình PIII.4.1: Chế phẩm lên men Natto 4.2 Bảo quản chế phẩm lên men Natto Chế phẩm được đem sấy để giảm độ ẩm và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến đặc tính của sản phẩm Chế phẩm sau khi sấy được xác định độ ẩm bằng máy sấy hồng ngoại, kết quả độ ẩm của chế phẩm khi sử dụng các chế độ sấy được thể hiện ở đồ thị sau Bảng PIII.4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy tới độ ẩm của chế phẩm Độ ẩm của chế phẩm ở các nhiệt độ sấy khác nhau 400C 500C 600C 700C 800C Độ ẩm 10,6 10,2 9,85 8,5 8,0 Hình PIII.4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy tới tỷ lệ tế bào sống của chế phẩm Từ hình PII.4.2 và bảng PIII.4.2 ta thấy sấy ở nhiệt độ nào cũng giảm độ ẩm của chế phẩm xuống dưới 12% nhưng nhiệt độ sấy tại đó vi khuẩn có tỷ lệ sống sót cao nhất là 400C với tỷ lệ lên tới 81,7%. Điều này là do đây là nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn phát triển nên trong quá trình sấy vi khuẩn không bị tiêu diệt. Khi tăng nhiệt độ lên 500C thì lượng vi khuẩn sống sót giảm mạnh chỉ còn 36% và lên tới 600C thì tỷ lệ tế bào sống là 20,1%. Nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này là do nhiệt độ này cao hơn nhiều so với nhiệt độ tối thích của vi khuẩn nên phần lớn các tế bào bị giết chết. Cũng theo hình PIII.4.2 khi sấy chế phẩm ở nhiệt độ 700C thì tỷ lệ tế bào sống lại lớn hơn khi sấy ở 600C. Điều này có thể giải thích là do nhiệt độ này gần bằng nhiệt độ tạo bào tử của Bacillus subtilis nên các tế bào sinh dưỡng đã chuyển sang dạng bào tử. Tỷ lệ sống sót của tế bào giảm xuống chỉ còn 9,2% khi chế phẩm được sấy ở 800C do đây là nhiệt độ quá cao so với khoảng nhiệt độ của Bacillus subtilis. Như vậy sau khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy ta đã xác định được nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo chế phẩm là 400C trong thời gian 3 h. 4.3. Đặc tính của chế phẩm lên men Natto Chế phẩm lên men Natto thu được có đặc tính sau Bảng PIII.4.3: Đặc tính chế phẩm vi sinh lên men Natto Các chỉ tiêu CFU trước sấy 4,8.108 CFU sau sấy 3,92.108 Tỷ lệ tế bào sống 81,7% Độ ẩm 10,6% Màu sắc Vàng nâu Trạng thái Bột khô, mịn Mùi Thơm 5. Thử nghiệm quy trình lên men thu Natto từ chế phẩm vi sinh. Sử dụng đậu tương và chế phẩm vi sinh vật để tiến hành lên men thu Natto theo quy trình đã trình bày. Trong quy trình sản xuất thử nghiệm Natto tiến hành xác định số đơn vị khuẩn lạc của chế phẩm bằng cách pha loãng chế phẩm và cấy lên đĩa pectri, đếm số khuẩn lạc tạo thành, kết quả được thể hiện trên bảng sau: Thời gian (h) Hình PIII.5: Sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men Natto Theo đúng quy trình lên men đã nêu trong phần vật liệu và phương pháp, đánh giá chất lượng cảm quan trong quá trình lên men Natto thu được bảng số liệu sau: Bảng PIII.5.1: Nhận xét cảm quan Natto trong quá trình lên men Các chỉ tiêu Thời gian xác định (h) 6 12 18 24 Màu sắc Màu vàng nhạt của đậu tương Màu vàng hơi đậm Màu vàng sậm Màu vàng ngả sang nâu Mùi Hơi chua Mùi chua Mùi chua rõ rệt, mùi amoniac nhẹ Mùi chua mạnh, mùi amoniac đặc trưng Vị Vị bùi Vị bùi, hơi chua Vị bùi, hơi có mùi Vị ngọt, bùi đặc trưng Bề mặt Trơn Hơi nhăn Nhăn khá rõ Nhăn nheo Thời gian lên men thu Natto là 24 h. Sau quá trình lên men Natto được giữ lạnh trong 48 h để hoàn thiện chất lượng sản phẩm, tăng mùi vị, độ nhớt và chất lượng cảm quan. So sánh Natto sản xuất thử nghiệm với Natto thương mại có bán sẵn trên thị trường thu được bảng sau: Natto sản xuất thử nghiệm Natto thương phẩm Hình PIII.5.2: Sản phẩm Natto Bảng PIII.5.2: So sánh cảm quan của Natto thương mại và Natto chế phẩm Các chỉ tiêu Natto sản xuất thử nghiệm Natto thương mại Màu sắc Nâu vàng Nâu đậm Mùi vị Mùi amoniac khá mạnh, khó chịu Mùi amoniac nhẹ, khó chịu Bề mặt Trơn, nhẵn, sờ vào thấy dính, nhớt Dính, nhớt Cấu trúc hạt đậu đã lên men Mềm, mịn Khá mềm, mịn Vị Ăn vào thấy có độ bùi, nhớt, vị nhạt, khó ăn Ăn thấy bùi, ngọt, nhớt, vị đậm, khó ăn Kích thước hạt đậu Rộng 5mm, dài 12mm Rộng 3mm, dài 6mm  Độ nhớt Khi trộn các hạt đậu tương lên, chúng dính vào với nhau trong lớp polysaccarit có màu nâu, trong, nhớt kéo dài. Độ nhớt mạnh, các hạt đậu dính vào với nhau Từ bảng so sánh giá trị cảm quan như trên ta có thể thấy độ tương đồng của Natto được sản xuất thử nghiệm có độ tương đồng khá cao so với sản phẩm Natto thương mại có bán sẵn trên thị trường. Sự sai khác về màu sắc và kích thước có được là do Natto sản xuất thử nghiệm được sản xuất từ loại đậu tương của Việt Nam khác hẳn với đậu tương được dùng để sản xuất chế phẩm thương mại vì chế phẩm này được nhập khẩu từ Nhật. Sự khác nhau về kích thước của hạt đậu cũng làm ảnh hưởng tới độ nhớt của Natto tự sản xuất làm cho chúng có độ nhớt kém hơn so với Natto thương phẩm. Chính vì sự sai khác này mà trong quá trình sản xuất Natto cần tăng thời gian lên men đậu tương hơn 24 để vi khuẩn có điều kiện phân huỷ protein trong đậu tương một cách triệt để hơn. KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis TH2 từ Natto, tạo chế phẩm lên men Natto và thử nghiệm sản xuất Natto từ đậu tương” em đã thu được những kết quả như sau: 1. Phân lập được vi khuẩn TH2 từ Natto. Xác định TH2 từ Natto là thuộc loài Bacillus subtilis, đặt tên là Bacillus subtilis TH2 Xác định một số điều kiện thích hợp cho thu sinh khối Bacillus subtilis TH2: Nhiệt độ, NaCl, Glucoza. Từ đó tìm môi trường thích hợp để nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn phục vụ cho sản xuất chế phẩm lên men Natto: Môi trường NA bổ sung 2% Glucoza, nhiệt độ 40°C, thời gian nuôi 30h. Tạo được chế phẩm vi sinh lên men Natto: Chọn được điều kiện sấy thích hợp là 40°C với thời gian 3 h trong thiết bị sấy chân không. Sử dụng chế phẩm vi sinh để thử nghiệm lên men Natto từ đậu tương: Natto thu được có giá trị cảm quan tương đối giống với Natto có bán trên thị trường. ĐỀ NGHỊ Natto là một loại thực phẩm có rất nhiều lợi ích và nó đã, đang và sẽ được sử dụng như một sản phẩm chức năng. Ở nước ta Natto còn phài nhập khẩu nên có giá thành cao và thị trường của Natto còn hạn chế. Nhưng trong tương lai chắc chắn nhu cầu về Natto sẽ tăng lên và việc sản xuất Natto ngay trong nước sẽ đem lại hiệu quả kinh tế không nhỏ cho người trồng đậu tương cũng như nhà sản xuất Natto. Để có thể sản xuất được Natto chúng tôi thiết nghĩ đề tài còn cần phải được tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện để tìm được điều kiện sản xuất chế phẩm vi sinh và sản phẩm Natto tốt hơn, tốn ít chi phí hơn. Mặt khác hiện nay sản phẩm Natto còn chưa được biết đến rộng rãi. Để Natto trở nên phổ biến thì chúng ta còn cần nhiều nghiên cứu để xác định những thành phần có giá trị dinh dưỡng và các tác dụng to lớn của nó như hàm lượng protein, hàm lượng các hợp chất cacbon, các vitamin và khoáng chất và các chất có hoạt tính sinh học khác. Với những lý do như trên chúng tôi đề nghị: Nghiên cứu khả năng phân huỷ protein của chủng Bacillus subtilis TH2 với đầy đủ yếu tố ảnh hưởng để có thể tìm ra điều kiện tối ưu cho việc tạo sinh khối vi khuẩn. Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để tiến hành tạo chế phẩm lên men Natto với chi phí thấp nhất. Xác định các thành phần và hàm lượng các chất dinh dưỡng như protein, vitamin cũng như các chất có tác dụng sinh học, y học trong Natto. TÀI LIỆU THAM KHẢO GS N.X.EGÔRÔ hiệu đính; Người dịch GS NGUYỄN LÂN DŨNG. Thực tập vi sinh vật, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. Lương Đức Phẩm, Vi sinh vật lương thực và thực phẩm. Phan Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Bùi Gia Tường, Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo dục, 1997 Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tô Kim Anh(1997), Thí nghiệm hoá sinh công nghiệp, Hà Nội. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty(1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục. Lê Ngọc Tú(1997), Hoá sinh công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội. Lê Thanh Bình, Phạm Thị Ngọc Lan, Lên men vi khuẩn lactic các phế thải hữu cơ, môt giải pháp hữu hiệu để bảo quản và tái thu hồi, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 36, số 3, 1997. 8. Đỗ Thị Hạnh(2005), Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua để ứng dụng vào công nghệ sản xuất nemchua nhằm nâng cao chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản, Hà Nội.. Tài liệu nước ngoài 9. Dr. James Zhou, Ph.D.(1999), “Soy Isoflavones: A Review of Literature and Use”, Focus on Allergy Research Group newsletter. Sakar PK, Cook PE, and Owens ID (1993), Bacillus fermentation of soybean World J Microbiol Biotechnol Chuanlai Xu, Kaihao,… Effecta of fermentation tempertature and time on the Physicochemiscal and Sensory Characteristics on Douchi. Wuxi City, Jiangsu, P.R China, 2005. Edward R.Farnworth Ph.D(2003), Handbook of fermentation functional food, CRC Press, Canada. 13. Doerge and Sheehan, Letter to the FDA, Feb 18, 1999. 14. Lephart ED, Thompson JM, Setchell KD, Adlercreutz H, Weber KS, Phytoestrogens decrease brain calcium-binding proteins... Brain Res 2000 Mar 17;859(1):123-31. 15. Soy Infant Formula Could Be Harmful to Infants: Groups Want it Pulled. Nutrition Week, Dec 10, 1999;29(46):1-2. 16. Cassidy A, Bingham S, Setchell KD, Biological effects of a diet of soy protein rich in isoflavones on the menstrual cycle of premenopausal women. Am J Clin Nutr 1994 Sep;60(3):333-40. 17. Setchell KD, Zimmer-Nechemias L, Cai J, Heubi JE, Exposure of infants to phyto-oestrogens from soy-based infant formula. Lancet 1997 Jul 5;350(9070):23-27. 18. Rackis, J. J., " Biological and physiological factors in soybeans," Journal of the American Oil Chemists’ Society, 51: 161A-170A, January 1974. 19. Setchell, K. D. R., "Phytoestrogens: the biochemistry, physiology, and implications for human health of soy isoflavones," American Journal of Clinical Nutrition, 68 (Supplement): 1333S-46S, 1998. 20. O'Dell TJ, Kandel ER, Grant SG, Long-term potentiation in the hippocampus is blocked by tyrosine kinase inhibitors. Nature 1991 Oct 10 353:6344 558-60. 21. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Food & Nutrition Research Briefs, July 1997. 22. Tạp chí National soybean research laboratory, số ra ngày 13/2/2006. 23. Tạp chí Japanese microbiologycal research. 24. Tạp chí Y khoa Naval, Đại học Y khoa Hokkaido, 1936-1939. 25. Food of Akita home page.com 26. for everybody Homepage.com/ 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. Japan function foods research association, 2004. 34. Sumi et al, Experientia, Vol. 43, 1110-1111, 1987. 35. Products, Nattokinase Product Description, Product Ingredients.htm 36. For Nattokinase, Nattokinase Usage Elucidation, Discovery Of Nattokinase.htm 37. Folasade M.OLAJUYIGBE và Joshua O.AJELE, Production dynamics of extracellular protease from Baillus specie, African Journal of Biotechnology Vol.4 (8), pp. 776-779, August, 2005. 38. Tran Lien Ha, Nagano Hiroko,Tran, Isolation and characteristics of Bacillus subtilis CN2 and its collagenase production, Journal of Food Science, Vol 67 (3), 1184-1187, 2002.