Phân lập, chẩn đoán bệnh bạc lá lúa bằng kỹ thuật phân tử và bảo quản nguồn bệnh cho nghiên cứu

PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN BỆNH BẠC LÁ LÚA BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ VÀ BẢO QUẢN NGUỒN BỆNH CHO NGHIÊN CỨU DENTIFICATION OF RICE BACTERIAL LEAF BLIGHT Xanthomonas oryzae BY PCR Đoàn Thị Thanh Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam Abstract Bacterial blight (BB) is one of the most destructive disease of rice plants in almost rice growing countries in both temperature and tropical regions especially in Asia. This is also a major disease of rice in Viet nam. This disease is multiplicate increase during the past 10 years in the Northern Vietnam in both two seasons of rice. We collected 0 isolates of the bacterial leaf bright of rice from various regions of Northern Vietnam. The identification of Xanthomonas oryzae (X.oryzae) species by PCR showed that: There are 29 isolates of X.oryzae by using primers XR -F and XR -R2. Time preservation of X.oryzae in liquid glycerol last one year, in skim milk medium over one year and in water only two months. Keywords: Xanthomonas oryzae, PCR. . ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạc lá nguyên nhân do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây nên, là một trong những bệnh hại nguy hiểm đối với cây lúa trong cả hai vụ: vụ xuân và vụ mùa ở nƣớc ta. Những năm gần đây bệnh gây thiệt hại rất nặng, đặc biệt là trên các giống lúa lai và những giống lúa thuần nhập nội từ Trung quốc. Do vậy cần xác định chính xác nguồn bệnh làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống là cần thiết. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành thu thập. phân lập và xác định nguồn bệnh bạc lá bằng kỹ thuật PCR. Bảo quản nguồn bệnh phân lập đƣợc để làm vật liệu nghiên cứu. . PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Vật liệu nghiên cứu bao gồm 0 nguồn bệnh đƣợc thu thập từ các vùng trồng lúa ở miền Bắc Việt Nam. - Các môi trƣờng để phân lập và bảo quản vi khuẩn và hoá chất cần thiết để chạy PCR xác định nòi vi khuẩn bạc lá lúa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phân lập nòi vi khuẩn bạc lá lúa trên môi trƣờng Wakimoto, 1995. - Phƣơng pháp lây nhiễm theo GS.TS.S.Taura (2000). - Phƣơng pháp PCR để xác định nòi vi khuẩn theo GS.TS.S.Taura (2000). - Phƣơng pháp bảo quản của Wakimoto (1995) và nguy Hwang (1998). . KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .1. Thu thập nguồn bệnh Chúng tôi đã thu thập nguồn bệnh từ các vùng trồng lúa ở miền Bắc Việt nam. Kết quả thu đƣợc ở bảng 1. Bảng1. Danh sách các isolates đã thu thập STT Nơi thu thập STT Nơi thu thập 1 Dòng vi khuẩn chuẩn từ RR 17 VAS , Hà Nội - 6 2 An Khánh, Hoài Đức, Hà Tây 18 Sơn Tây, Hà Tây  An Khánh, Hoài Đức, Hà Tây 19 TT xã, Sơn Tây, Hà Tây 4 VAS , Hà Tây 20 Sơn Tây, Hà Tây 5 Hoài Đức, Hà Tây 21 Văn Giang, Hƣng ên -1 6 Đồng Hỷ, Thái Nguyên 22 Văn Giang, Hƣng ên -2 7 Đồng Hỷ, Thái Nguyên 2 Trại TN Lai Cách, Hƣng ên -1 8 ĐH Nông Lâm, Thái Nguyên 24 Trại TN Lai Cách, Hƣng ên -2 9 Thanh Trì, Hà Nội 25 Trƣờng NN, Việt ên, Bắc Giang 10 VAS , Hà nội -1 26 Đông Hƣng, Thái Bình 11 VAS , Hà nội -2 27 Hƣng Hà, Thái Bình 12 VAS , Hà nội - 28 Thái Thuỵ, Thái Bình 1 Quế Võ, Bắc Ninh -1 29 Gia Lâm, Hà Nội 14 Quế Võ, Bắc Ninh -2 0 Trâu Quì, Hà Nội 15 VAS , Hà nội -4 1 Văn Giang, Hƣng ên 16 VAS , Hà nội -5 .2. Lây nguồn bệnh để xác định isolates là bệnh Xanthomnas oryzae - Trƣớc xác định bệnh tiến hành lây thử lên dòng mẫn cảm là R24 để thử độc tính của vi khuẩn sau bảo quản. - Tạo dung dịch lây nhiễm: Sau 48 giờ vi khuẩn nuôi cấy trong môi trƣờng Wakimoto mọc. Khi đó ta lấy một vòng vi khuẩn hoà với 10 ml nƣớc tạo dung dịch có nồng độ vi khuẩn từ 108- 10 9 / 1 ml nƣớc. Đem dung dịch đó đi lây nhiễm. - Lây nhiễm mỗi chủng 1 cây, mỗi cây cắt toàn bộ lá có trên cây đó. Kết quả ở hình 1. 1 2  4 Hình 1. Lây nhiễm nguồn bệnh để thử độc tính 1, 2. Nguồn có độc tính cao; . Nguồn có độc tính trung bình, 4. Nguồn kháng bệnh. .. Ly trích DNA Tất cả các isolates đựơc nuôi cấy trên môi trƣờng Wakimoto, 1995. sau 49 giờ để chiết tách AND. Phƣơng pháp chiết tách ADN thep phƣơng pháp của Wakimoto, 1995. .4. Xác định bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR Xác định bệnh bạc lá lúa nhờ cặp mồi của XR -F và XR -R2 theo phƣơng páhp của Adachi và ku (2000). .4.1. Phản ứng PCR + Hoá chất cần cho phản ứng PCR Hoá chất cần cho phản ứng gồm Taq bufer, Trí-HCL, KCl, Trion X-100, Taq polymera, MgCl2, dNPT, DNA khuôn,vv.. + Nhân gen Sau khi đã hoàn chỉnh các mẫu ly trích DNA trên ta tiến hành nhân gen. Đặt các mẫu vào trong máy nhân gen theo một chu kỳ nhiệt nhất định, đối với gen bệnh bạc lá chúng tôi dùng một chu kỳ nhiệt riêng. .4.2. Điện di sản phẩm PCR Sau khi kết thúc phản ứng PCR, tiến hành chạy điện di sản phẩm nhân gen, chạy điện với agarose 2%.: Sau khi đã pha trộn đầy đủ, ủ chúng ở 70C trong Water bath hoặc ven trong vòng 6 tiếng, hoặc có thể ủ qua đêm. Tiếp đó chạy điện di sản phẩm gen cắt bằng agarose 2%. Lúc này có thể phân biệt đƣợc các vạch. Thƣờng điện di dòng điện có hiệu điện thế là 60V, cƣờng độ dòng điện là 200 mA trong 0 phút. Trong trƣờng hợp muốn có kết quả nhanh có thể chạy với dòng điện 100 V, cƣờng độ dòng điện 200 mA trong 15 phút. Tuỳ từng trƣờng hợp mà có thể xử lý cƣờng độ, hiệu điện thế cũng nhƣ thời gian khác nhau. .5. Kết quả phản ứng PCR để xác định bệnh bạc lá từ các isolates Sau khi điện di, quan sát các vạch trên gel, chúng tôi thu đƣợc kết quả ở hình 2: Hình 2. Xác định nguồn vi khuẩn X.oryzae bằng PCR - Đường 1: Gồm các isolates từ 1-15: số 1 là nguồn bệnh chuẩn X.oryzae - Đường 2: số isolates từ 16-0: số isolates theo thứ tự của bảng 1. Kết quả ở hình 2 cho thấy 0 isolates thu thập đều là vi khuẩn X.oryzae vì vạch băng trùng với vạch băng số 1 dòng chuẩn của vi khuẩn X.oryzae. .6. Các phương pháp bảo quản vi khuẩn X.oryzae - Phƣơng pháp bảo quản bằng nƣớc cất: sau khi cấy vi khuẩn 2- ngày trên môi trƣờng SPA (môi trƣờng Wakimoto, 1995). Lấy 0.2ml dịch khuẩn ở nồng độ 104 tế bào /ml cho vào 1ml nƣớc cất vô trùng, lắc đều và bảo quản ở 6-80C. Sau 1, 2, , 4 tháng cấy chuyển 1 lần để xác định mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn. - Phƣơng pháp bảo quản bằng phủ dung dịch glycerol: Lấy 0.2ml dịch khuẩn ở nồng độ 104 -6tế bào /ml cho vào 1ml nƣớc cất vô trùng, lắc đều và bảo quản ở 6-80C. Sau 4, 8, 12 tháng cấy chuyển 1 lần để xác định mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn. - Phƣơng pháp bảo quản vi khuẩn trong băng: Lấy 0.2ml dịch khuẩn ở nồng độ 104 -6tế bào /ml cho vào 1ml nƣớc cất vô trùng, lắc đều và bảo quản ở 6-80C. Sau 4, 8, 12 tháng cấy chuyển 1 lần để xác định mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn. Kết quả đựơc ghi nhận ở bảng 2: Bảng 2. Mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn qua các giai đoạn bảo quản Phƣơng pháp bảo quản Đƣờng kính khuẩn lạc (mm) Tỷ lệ sống (%) Thời gian mọc (giờ) Trong nước cất 1 tháng 2 tháng  tháng 4 tháng 0.60 0.0 0.10 0 100 65 15 0 48 50 56 0 Trong glycerol 4 tháng 8 tháng 12 tháng 16 tháng 0.66 0.67 0.65 0.60 100 100 98 40 48 48 48 54 Trong Skim milk 4 tháng 8 tháng 12 tháng 16 tháng 0.68 0.70 0.68 0.69 100 100 100 98 48 48 48 48 Kết quả ở bảng 2 cho thấy bảo quản vi khuẩn X.oryzae trong nƣớc cất chỉ đƣợc 1-2 tháng, trong glycerol khoảng 12 tháng, trong Skim milk là trên 16 tháng. V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 1. Thu thập đƣợc 0 isolates ở các vùng khác nhau để phân lập bệnh bạc lá lúa. 2. Chẩn đoán đƣợc 29 isolates là vi khuẩn X.oryzae bằng kỹ thuật PCR do sử dụng cặp mồi chọn lọc. 4.2. Đề nghị: Cần nghiên cứu và thu thập thêm nhiều nguồn vi khuẩn bạc lá lúa trên các vùng bị bệnh hại. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Adachi.N. and T. ku, 2000. PCR mediated detection of Xanthomonas oryzae pv. ryzae by aplification of 16S-2S rDNA spacer sequence. J. Gen.Plant Pathol. 66: 0-09. 2. zuka, A and kaku, H, 2000. A historical review of bacterial blight of race. Bull. Nati. nst. Agrobiol. Resour. 15:1-207. . Suwas, T. 1962. Studies on the culture media of Xanthomonas oryzae (yeda et. shiyama) 4. Wakimoto, S, 1995. Studies on multipulication of P phage (Xanthomonas oryzae bacteriophage) 1. neăstep growth experiment under variuos condition. Sci.Bull.Fac.Agric. Kyushu niv. 15: 151-160 (in Lapanese with nglish summary). 5. Phan Hữu Tôn, 2004. Chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu bệnh bạc lá miền Bắc Việt nam. Hội nghị quốc tế Quốc gia về chọn tạo giống lúa. Nhà xuất bản nông nghiệp, tr.115-120, 2004.