Phân lập huperzinin từ cây thạch tùng dương (lycopodium casuarinoides spring, lycopodiaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 191 PHÂN LẬP HUPERZININ TỪ CÂY THẠCH TÙNG DƯƠNG (LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE) Nguyễn Ngọc Chương*, Trần Công Luận** TÓM TẮT Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Nhóm alkaloid của họ Thạch tùng thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Trong số những loài thạch tùng mọc ở Việt Nam, cây Thạch tùng dương phân bố nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên. Nghiên cứu phân lập alkaloid trong loài này làm cơ sở cho các thử nghiệm sinh học tiếp theo. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi Diaion HP-20 và sắc ký cột cổ điển trong quy trình phân lập alkaloid của cây Thạch tùng dương. Thực hiện các phương pháp đo phổ UV, phổ hồng ngoại, điểm chảy, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được. Kết quả: Sử dụng hai phương pháp sắc ký trao đổi ion và phương pháp sắc ký cột cổ điển rất thuận lợi để phân lập được Huperzinin trong cây Thạch tùng dương. Kết luận: Kết quả của đề tài là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu phân lập các alkaloid thạch tùng và các thử nghiệm sinh học tiếp theo. Từ khóa: Họ Thạch tùng, Thạch tùng dương, Huperzinin, alkaloid trong họ Thạch tùng. ABSTRACT ISOLATION HUPERZININE FROM LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING, LYCOPODIACEAE Nguyen Ngoc Chuong, Tran Cong Luan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 191 - 196 Background - Objectives: Lycopodium alkaloids have attracted great attention from scientists in the world. Lycopodium casuarinoides, a member of Lycopodiaceae, widely distributes in the Highland Central of Viet Nam. Studying on isolation of lycopodium alkaloids from this species would have contributed to subsequent biological tests. Methods: Ion exchange chromatography with Diaion Hry P-20 and column chromatography were used in alkaloid extraction and isolation processes from Lycopodium casuarinoide. The chemical structure of isolated compound was elucidated by UV spectrum, infrared spectrum, melting points, nuclear magnetic resonance spectrum. Results: Both two methods of ion exchange chromatography and column chromatography method are very useful for isolation Huperzinine from Lycopodium casuarinoide. Conclusion: The results of this research would have contributed to subsequent isolation study of other lycopodium alkaloids and biological testing. Keywords: Lycopodiaceae, Lycopodium casuarinoides, Huperzinine, lycopodium alkaloids. ĐẶT VẤN ĐỀ Những hợp chất tự nhiên alkaloid của họ Thạch tùng có khung cấu trúc cơ bản là lycodin, lycopodin, fawcettimin và nhóm có * Khoa Y học Cổ Truyền – Đại học Y Dược Tp. HCM ** Trung Tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Ngọc Chương ĐT: 0913649750 Email: chuong0911@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 192 cấu trúc khác. Vào năm 1986, khi tác giả Liu và cộng sự đã phát hiện ra khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase của huperzin A và huperzin B phân lập từ cây Thạch tùng răng thì các alkaloid của họ Thạch tùng đã và đang được quan tâm của nhiều nhà khoa học nghiên cứu phân lập, thử tác dụng sinh học và tổng hợp hữu cơ. Hàng loạt các công trình nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới về các cây thuộc họ Thạch tùng đã được công bố trong thời gian gần đây(1,2,6). Ở nước ta, có nhiều loài trong họ Thạch tùng được tìm thấy ở các vùng núi cao thuộc các tỉnh Tây Nguyên nhưng chưa được nghiên cứu, trong đó có cây Thạch tùng dương (3,5). Để góp phần nghiên cứu phân lập các hợp chất tự nhiên của loài này, làm cơ sở để thực hiện nghiên cứu tác dụng sinh học về sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân lập alkaloid trong cây Thạch tùng dương. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Toàn cây Thạch tùng dương (Lycopodium casuarinoides Spring, Lycopodiaceae) được thu hái ở rừng Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng, rửa sạch, phơi khô âm can, tán thành bột thô. Hóa chất và trang thiết bị Hóa chất - dung môi Dicloromethan, cloroform, methanol, ethyl acetat, diethyl ether, aceton, n-hexan, isopropanol (Trung Quốc), NH4OH, HCl 5% NaOH 1N (Việt Nam), thuốc thử Dragendorff. Trang thiết bị Bản mỏng silica gel 60 F254, silica gel cỡ hạt 40-63 µm (Merck, Đức). Diaion loại hạt HP-20 do hãng Misubishi (Nhật) sản xuất. Cân phân tích Satorius độ nhạy 0,1 mg (Nhật), bếp cách thủy Memmert WB.14 (Đức), máy cô quay buchi R300 (Thụy sỹ), máy siêu âm Sanorex RK510 H (Pháp), máy đo phổ hồng ngoại FTIR - 820PC Bruker, máy đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV 500 (500 MHz), máy soi UV hai bước sóng 254 nm và 365 nm Vilber Lourmat (Pháp), máy quang phổ UV-Vis 1800 Shimadzu (Nhật). Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực vật học Nguyên liệu là toàn cây Thạch tùng dương tươi, có đầy đủ rễ, thân, lá được thu hái ở rừng Quốc gia Bidoup - Núi Bà, Lâm Đồng. Mẫu thu thập được chụp hình và ghi nhận đặc tính sinh thái. Kết hợp với các đặc điểm về hình thái, sử dụng tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành, để định danh chính xác tên khoa học của loài nghiên cứu. Nguyên liệu được cắt nhỏ, phơi khô trong bóng râm, và xay bột dùng để soi bột, nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học hóa học, thử tinh khiết. Chiết xuất 10 kg bột thô Thạch tùng dương được làm ẩm bằng methanol, cho vào bình ngấm kiệt, chiết kiệt alkaloid bằng methanol. Cô dịch chiết dưới áp suất giảm, cắn thu được chiết tiếp tục hòa tan với acid HCl 5%, lọc thu dịch acid, dịch này được lắc với diethyl ether để loại tạp chất kém phân cực, sau đó kiềm hóa bằng NH4OH đến pH=10 thu được dịch alkaloid toàn phần. Phân lập và tinh chế Sắc ký cột trao đổi ion Dịch alkaloid toàn phần được nạp vào cột Diaion HP 20. Sau đó, lần lượt cho các dung môi nước khử ion, methanol 20%, methanol 100%, dicloromethan. Phân đoạn methanol 100% và dicloromethan được cô đến cắn thu được hai phân đoạn alkaloid. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát hiện bằng đèn UV 254 nm và thước thử Dragendorff. Sắc ký cột cổ điển Cột thủy tinh (6 x 70 cm), pha tĩnh silica gel cỡ hạt 40-63 µm, nạp mẫu ướt bằng cách hòa tan mẫu vừa đủ với dicloromethan, mẫu nạp là Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 193 phân đoạn methanol 100%. Pha động ban đầu triển khai bằng dung môi dicloromethan, sau đó tăng dần thể tích methanol đến tỉ lệ dicloromethan:methanol (90:10), thể tích hứng mỗi lần 100 ml, tốc độ 2 ml/phút. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,1), phát hiện bằng đèn UV 254 nm và thuốc thử Dragendorff. Kiểm tra độ tinh khiết Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, triển khai bản mỏng bằng ba hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Sắc ký đồ của chất tinh khiết phải cho một vết gọn duy nhất khi soi dưới đèn UV 254 nm và có màu cam với thuốc thử Dragendorff. Đo điểm chảy Xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo điểm chảy. Đo phổ UV Xác định cấu trúc Dùng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thực vật học Đặc điểm hình thái Cây thảo mọc bò trên mặt đất hoặc trên cây khác; thân cứng, dài, thân chính rộng khoảng 3 mm, lưỡng phân đều; lá hình kim hay dải nhọn, không cuống, ở thân chính lá nhỏ và mọc thưa, ở nhánh lá mọc dày và lớn hơn. Lá sinh sản khác lá thường và tập trung thành bông bào tử ở đỉnh nhánh, dạng chùy. Túi bào tử hình thận. Hình 1. Đặc điểm hình thái Thạch tùng dương Đặc điểm vi phẫu A B C Hình 2.Vi phẫu rễ (A), thân (B), lá (C) Thạch tùng dương Vi phẫu rễ Vi phẫu rễ Thạch tùng dương có tiết diện tròn hoặc gần tròn. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm lớp ngoại bì mang lông hút, vòng đai mô cứng hóa sợi, vùng tủy chứa libe và gỗ xếp xen kẽ (phân hóa chưa rõ rệt). Thân lưỡng phân đều Bông bào tử Lá Rễ Lá Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 194 Vi phẫu thân Vi phẫu thân Thạch tùng dương có tiết diện tròn hoặc gần tròn, có nhiều rãnh. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm lớp biểu bì, mô mềm vỏ, mô mềm có vách hóa gỗ, một số bó dẫn phụ nằm trong vùng mô mềm vỏ, vòng đai mô cứng bao quanh vùng tủy, vùng tủy gồm libe và gỗ xếp khá đặc sắc, gỗ ở giữa xếp thành dãy. Vi phẫu lá Vi phẫu lá Thạch tùng dương có cấu tạo từ ngoài vào trong gồm lớp biểu bì mang lỗ khí, mô mềm giậu, vùng tủy gồm bó dẫn chưa phân hóa, xung quanh có tế bào tẩm mộc tố. Đặc điểm bột dược liệu Cảm quan: Bột màu nâu vàng, mùi thơm nhẹ. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Biểu bì mang lỗ khí, mảnh mô mềm, mảnh nhựa, bào tử, sợi, mạch vạch, mạch xoắn. Bào tử Biểu bì mang lỗ khí Mảnh mô mềm Mảnh nhựa Mạch vạch Mạch xoắn Hình 3. Đặc điểm bột dược liệu Thạch tùng dương Kết quả đo độ ẩm, độ tro và hàm lượng chất chiết được Bảng 1. Độ ẩm của Thạch tùng dương Lần đo Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Độ ẩm (%) 8,68 8,47 8,30 8,48 Bảng 2. Độ tro của Thạch tùng dương Lần đo Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Độ tro toàn phần (%) 3,81 4,30 3,83 3,98 Độ tro không tan trong HCl (%) 0,13 0,15 0,12 0,13 Bảng 3. Hàm lượng chất chiết được của Thạch tùng dương Lần đo Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Chiết lạnh với nước (%) 19,10 19,25 19,20 19,20 Chiết lạnh với methanol (%) 18,35 18,65 18,60 18,55 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật Sơ bộ định tính thành phần hóa thực vật của cây Thạch tùng dương gồm có triterpenoid tự do, alkaloid, coumarin, saponin, acid hữu cơ và chất khử. Kết quả các phân đoạn từ cột Diaion HP-20 Trong các phân đoạn thu được từ cột Diaion HP-20 chỉ có phân đoạn methanol 100% (6,6g) và dicloromethan (0,7g) dương tính với thuốc thử Dragendroff. Phân đoạn nước và methanol 20% không có alkaloid. Chuẩn bị mẫu: 6,6 g cắn alkaloid thu được từ phân đoạn methanol 100% được hòa tan với lượng vừa đủ với dichloromethan, nạp mẫu ướt vào cột sắc ký (6 x70 cm). Pha tĩnh khoảng 450 g sillicagel hạt vừa (kích thước 0,040-0,063 mm). Nhồi cột và ổn định cột khoảng 2 giờ bằng dung môi dicloromethan. Khai triển cột với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH có tỷ lệ thay đổi từ 100:0 đến 80:20. Tốc độ 2ml/ phút. Thể tích hứng 100 ml. Kết quả thu được 8 phân đoạn bao gồm các alkaloid khác nhau. Phân đoạn I sau khi cô thu hồi dung môi, trên bình cầu xuất hiện các tinh thể màu vàng nhạt, tinh thể này được rửa bằng aceton và kết tinh lại bằng aceton-methanol (1:1). Tái kết tinh lại nhiều lần đến khi thu được tinh thể không màu, đặt tên là HT1. Kết quả thu được 1,07g HT1. Kiểm tra độ tinh khiết chất HT1 Tiến hành triển khai SKLM với các hệ dung môi khác nhau, phát hiện bằng soi đèn UV 254 nm, 365 nm, thuốc thử Dragendorff. Hình 1 cho thấy HT1 là một chất tinh khiết. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 195 CH2Cl2-MeOH-NH3 (90:10:0,5) EtOAc-MeOH-H2O-NH3 (100:13,5:10:0,5) n-hexan-EtOAc-NH (40:60:0,5) Hình 4: Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của HT1 Xác định cấu trúc HT1 HT1 kết tinh dạng tinh thể hình kim không màu, dễ tan trong CH3Cl3, CH2Cl2, MeOH; cho màu cam bền với thuốc thử Dragendorff. Phổ IR của HT1. Các băng hấp thụ ở 1660, 1619, 1554 cho thấy HT1 có tín hiệu của nhóm ceton, nối đôi ở carbon α-β. Phổ MS của HT1. Phổ LC MS (ESI+) có mảnh chính m/z = 271,25 cho thấy [M+H]+ = 271,25 và dạng dimer [2M+H]+ = 541,31. Do đó HT1 có khối lượng phân tử tương đương 270, tương ứng với công thức phân tử là C17H22N2O (Ω=8) Phổ UV của HT1 Phổ UV trong MeOH của HT1 cho cực đại hấp thu tại 229,50 nm và 308,00 nm. Phổ NMR của HT1. Phổ 13C-NMR cho 16 tín hiệu carbon. Phổ 1H-NMR lấy tích phân cho 22 nguyên tử hydro. Phổ NMR cho thấy sự hiện diện của 16 nhóm tín hiệu carbon, trong đó có 1 tín hiệu của của 2 carbon tương đương, bao gồm: 3 nhóm methyl, gồm: 1 CH3-C= (δC 22,849 ppm); 1nhóm (CH3)2-N (δC 39,512 ppm) 3 nhóm methylen, gồm: 2 nhóm -CH2- sp3 (δC 29,152 và 44,469 ppm), 1 nhóm =CH2 sp2 (δC 116,258 ppm) 6 nhóm methin, gồm: 2 nhóm >CH- sp3(δC 38,808 và 45,840); 4 nhóm =CH- sp2 (δC 117,624; 124,479; 140,221 và 142,433 ppm) 5 nhóm Carbon bậc 4, gồm: 1 nhóm –NH- C=O (δC 165,119 ppm); 3 nhóm >C= sp2 (δC 118,723; 134,315 và 142,823 ppm); 1 nhóm >C-N< (δC 59,888 ppm) Từ các dữ liệu phân tích được, định hướng HT1 về hợp chất huperzinin 11 12 13 4 56 7 N H 1 23 14 8 15 O 10 N H 16 Hình 5. Công thức phân tử huperzinin. Các kết quả của phổ NMR 1 chiều và 2 chiều đã chứng minh alkaloid HT1 là huperzinin. UV 365 UV 254 TT Dragedorff UV 365 UV 254 TT Dragedorff UV 365 UV 254 TT Dragedorff Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 196 Bảng 4. Bảng dữ liệu phổ NMR của HT1và So sánh các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của HT1với huperzinin trong tài liệu (4) HT1 (500MHz, CDCl3) Huperzinin(400MHz, CDCl3)[4] C DEPT δC(ppm) δH (ppm,m,J) HMBC COSY δC(ppm) δH (ppm,m,J) 1 C 165,1 ─ ─ ─ 165,1 2 CH 117,6 6,45 (d, J=9,4) 1, 4 3 117,6 6,45 (d, J=9,4) 3 CH 142,4 7,66 (d,J=9,45) 1, 5, 13 2 142,4 7,66 (d,J=9,45) 4 C 118,7 ─ ─ ─ 118,7 5 C 142,8 ─ ─ ─ 142,8 6 CH2 29,2 2,98 (dd, J=17,6/5,1) 2,42 (s) 5, 7, 8, 12 7 29,2 2,98 (dd, J=17,6/5,1)2,42 (s) 7 CH 38,8 2,42 (s) 8, 12, 13 6, 8, 12 38,8 2,42 (s) 8 CH 124,5 5,36 (d, J=5,1) 7, 14, 16 7, 14 124,5 5,36 (d, J=5,1) 10 CH2 116,3 5,19 (dd, J=17/1,7) 5,05 (dd, J=10,1/1,85) 11, 12 11 116,3 5,19 (dd, J=17/1,7) 5,05 (dd, J=10,1/1,85) 11 CH 140,2 5,96(ddd, J=17/10,1/10,1) 12 10 140,2 5,96(ddd, J=17/10,1/10,1) 12 CH 45,8 2,86 (dd, J=10,1/3,9) 6, 7, 10, 13 7, 11 45,8 2,86 (dd, J=10,1/3,9) 13 C 59,9 ─ ─ ─ 59,9 14 CH2 44,5 1,62 (d, J=17,35) 2,79 (d, J=17,35) 4, 8,12, 13, 15, 16 8, 16 44,5 1,62 (d, J=17,35) 2,79 (d, J=17,35) 15 C 134,3 ─ ─ ─ 134,3 16 CH3 22,8 1,54 (s) 6, 8, 14, 15 14 22,8 1,54 (s) N(Me)2 CH3 39,5 2,42 (s) 7, 12, 13, 8 ─ 39,5 2,42 (s) CH3 39,5 2,42 (s) 12, 13 ─ 39,5 2,42 (s) N-H 13,00 (s) ─ ─ KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu đã xác định về mặt thực vật học cũng như phương pháp nghiên cứu hóa học phù hợp đối với cây Thạch tùng dương, đã xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập được một alkaloid từ cây này. Đã kiểm tra các chỉ tiêu hóa lý như điểm chảy, độ hấp thu UV, phổ IR. Cấu trúc được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm 1D và 2D NMR đã chứng minh alkaloid là huperzinin được phân lập từ cây Thạch tùng dương ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cũng là cơ sở phục vụ cho các nghiên cứu phân lập tiếp tục các alkaloid khác trong loài này và các thử nghiệm sinh học tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Olafsdottir ES, Halldorsdottir ES, Pich NM, and Omarsdottir S (2013).“Lycopodium alkaloid: Pharmacology”. Natural products, 39, pp. 1241, 1243, 1248, 1252 -1 253. 2. Liu JS and MF Huang (1994). “The alkaloids huperzines C and D and huperzinine from “Lycopodiastrum casuarinoides”. Phytochemistry, 37(6), pp. 1759 - 1761. 3. Phạm Hoàng Hộ (2000). Cây cỏ Việt nam. NXB Trẻ, quyển 1, tr. 22 - 26. 4. Yin S, Fan CQ, ang, XN W and Jian-Min Yue (2006).“Lycodine- Type Alkaloid from Lycopodium casuarinoides”, Helvetica Chimica Acta, 89, pp. 138, 140. 5. Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999). Cây cỏ có ích ở Việt Nam, NXB. Giáo dục, tập1, tr. 34, 58. 6. Xiaoqiang Ma and David R. Gang (2004). “The lycopodium alkaloid”. Nat.Prod. Rep., 21, pp. 753 ,758 - 759. Ngày nhận bài báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/10/2013, 17/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014