Phân lập một số hợp chất Saponin từ cây đu đủ rừng (trevesia palmata)

T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 23 PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ CÂY ĐU ĐỦ RỪNG (Trevesia palmata) Lê Thị Thanh Thảo*; Đỗ Quyên**; Nguyễn Thị Ngọc* Lê Thanh Sơn*; Bùi Hữu Tài***; Phan Văn Kiệm*** TÓM TẮT Mục tiêu: phân lập một số hợp chất saponin từ dịch chiết methanol của lá cây đu đủ rừng (Trevesia palmata). Phương pháp: lá cây đu đủ rừng được sấy khô ở 40°C, nghiền nhỏ, chiết siêu âm với methanol và cô đặc tới cặn chiết. Cặn chiết được tạo huyền phù với nước và chiết lần lượt với các dung môi tăng dần độ phân cực (n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat). Tinh chế phân đoạn nước bằng phương pháp sắc ký (sắc ký bản mỏng, sắc ký cột) sử dụng các chất hấp phụ silica gel, pha đảo (RP C-18), diaion (HP-20) để thu được hợp chất saponin. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được trên thông số lý hóa của chúng như độ quay cực, số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 chiều và 2 chiều), phổ khối lượng và so sánh với các số liệu đã công bố. Kết quả: từ phân đoạn nước của lá cây đu đủ rừng, ba hợp chất saponin với dạng khung aglycon ursan (1, ilekudinosid C) và olean [2, hederagenin-3-O-β-D- glucopyranosyl-(1’3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1’2)-α-L-arabinopyranosid và 3, davisianosid B] đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Kết luận: kết quả bước đầu làm sáng tỏ thành phần hóa học của lá cây đu đủ rừng bao gồm ba hợp chất saponin 1-3 có cấu trúc khung aglycon dạng ursan và olean. * Từ khóa: Đu đủ rừng; Ursan saponin; Olean saponin. Isolation of Saponin Constituents from Trevesia palmata Summary Objectives: To isolate several saponin compounds from methanol extract of Trevesia palmata leaves. Material and methods: Dried and powdered leaves of Trevesia palmata were ultrasonically extracted with methanol and evaporated to get dry residue. The extract residue was partitioned with n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate to give corresponding fractions and water layer. The water layer was purified using various chromatographic technique to obtain separate saponin compounds. Chemical structures of the isolated compounds were determined based on their physico-chemical properties such as optical rotation, NMR and MS data and were then compared with those published data. Results: Three saponin compounds with ursane-type (1, ilekudinoside C) and oleane-type [2, hederagenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1’3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1’2)-α- L-arabinopyranoside; and 3, davisianoside B] were isolated and identified. Conclusions: Chemical constituents of the leaves of T. palmata were roughly clarified including three ursane- types and oleane-type saponins (1-3). * Key words: Trevesia palmata; Ursane-type saponin; Oleane-type saponin. * Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông ** Trường Đại học Dược Hà Nội *** Viện Hóa sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Thanh Thảo (lethanhthao2604@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 19/08/2016 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2016 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 24 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây đu đủ rừng có tên khoa học Trevesia palmata thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Theo Từ điển Cây thuốc Việt Nam, ở một số nơi, đu đủ rừng còn có tên gọi khác là Thông thảo gai hay Thầu dầu núi [1]. Cây mọc ở chỗ ẩm, phân bố rộng khắp các tỉnh ở nước ta như Sơn La, Lào Cai, Hà Nội, Quảng Trị, Lâm Đồng. Người dân thường sử dụng đu đủ rừng với tác dụng giải nhiệt, mát gan, chữa phù thũng, đái dắt, tê thấp, gãy xương [1]. Nghiên cứu trên thế giới về loài T. palmata cho thấy sự có mặt của nhiều hợp chất triterpen saponin. Đây cũng là một lớp hợp chất chính mang lại tác dụng sinh học của loài này [2]. Nhằm góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của cây đu đủ rừng, trong bài báo này: Chúng tôi công bố kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 3 hợp chất saponin từ dịch chiết methanol của lá cây đu đủ rừng. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu. * Nguyên liệu: - Dược liệu: lá cây đu đủ rừng được thu hái tại xã Thanh Thùy, huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang, tên khoa học: Trevensia palmata (Robx. ex Lindl.) Vis. Họ: Nhân sâm; mẫu tiêu bản HNIP/18247/16. Mẫu sau khi thu hái được sấy khô (40°C), xay nhỏ và bảo quản ở phòng chứa dược liệu đến khi nghiên cứu. Dung môi: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, aceton và methanol là các dung môi công nghiệp và được cất lại trước khi sử dụng. * Thiết bị, dụng cụ: - Sắc ký lớp mỏng (TLC): thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck); phát hiện vết chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. - Sắc ký cột (CC): tiến hành với chất hấp phụ là silica gel, pha đảo, diaion (HP-20). Silica gel có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (Đức) và pha đảo RP C-18 cỡ hạt 150 µm (Nhật Bản). Nhựa trao đổi ion loại HP-20 (Nhật Bản). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): đo trên máy Bruker AM500 (Đức). - Phổ khối lượng phân giải cao (HR- ESI-MS): đo trên máy Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS (Mỹ). 2. Phương pháp nghiên cứu. * Phân lập một số hợp chất saponin: - Bột lá của loài T. palmata (5 kg) được chiết siêu âm với methanol (3 lần x 8 lít ở 50oC, mỗi lần 1 giờ). Gom lại dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 530 g cặn chiết metanol. Lắc đều cặn chiết này với 3 lít nước cất và chiết phân bố lần lượt với n-hexan (3 x 3 lít), dicloromethan (3 x 3 lít) và ethyl acetat (3 x 3 lít), sau đó cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn n-hexan (TPH, 30 g), dicloromethan (TPD, 70 g), ethyl acetat (TPE, 60 g) và lớp nước (TPW, 370 g). Phân đoạn nước TPW được đưa lên cột diaion HP-20P để loại đường bằng nước, sau đó rửa giải bằng methanol trong nước có nồng độ tăng dần (25, 50, 75 và T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 25 100%, v/v) thu được 4 phân đoạn, TPW1- TPW4. - Phân đoạn TPW3 và TPW4 có sắc đồ TLC giống nhau được gộp lại và phân tách thô trên cột sắc ký silica gel, rửa giải với hệ dung môi gradient dicloromethan/methanol (100/1 # 1/1, v/v) thu được 6 phân đoạn TPW3A-TPW3F. Tiếp tục phân tách phân đoạn TPW3D trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải dicloromethan/ aceton/nước (1/4/0,4, v/v/v) thu được 12 phân đoạn TPW3D1-TPW3D12. Tiếp tục phân tách phân đoạn TPW3D2 trên cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải aceton/nước (1/1,5, v/v) thu được hợp chất 1 (100,3 mg) và hợp chất 2 (90,0 mg). Phân đoạn TPW3D4 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải bằng aceton/nước (1/1,4, v/v) và tinh chế thêm bằng cột silica gel rửa giải với dicloromethan/aceton/nước (1/4/0,4, v/v/v) thu được hợp chất 3 (140,0 mg). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Hợp chất 1. Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1 - 3. Hình 2: Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 1 và 2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 26 Bảng 1: Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR phần aglycon của hợp chất 1 - 3 và các chất tham khảo. STT 1 2 3 #,dδC a,bδC a,cδH (mult, J Hz) %,dδC a,bδC a,cδH (mult, J Hz) $,eδC a,bδC a,cδH (mult, J Hz) 1 47,3 47,3 0,84 (m) 2,01 (m) 39,2 39,6 0,99 (m) 1,63 (m) 38,7 39,7 0,99 (m) 1,62 (m) 2 66,9 68,0 3,78 (m) 26,5 26,5 1,75 (m) 1,90 (m) 25,8 26,6 1,77 (m) 1,89 (m) 3 88,4 88,3 3,44 (d, 9,5) 81,4 82,4 3,64 (m) 79,8 82,4 3,63 (m) 4 44,7 45,1 - 43,8 43,9 - 42,8 44,0 - 5 47,7 47,7 1,30 (m) 47,8 48,0 1,29 (m) 46,6 48,1 1,29 (m) 6 18,2 18,8 1,35 (m) 1,46 (m) 18,3 18,8 1,38 (m) 1,52(m) 17,6 18,8 1,39 (m) 1,50 (m) 7 33,2 33,5 1,30 (m) 1,62 (m) 33,0 33,4 1,29 (m) 1,64 (m) 32,7 33,4 1,28 (m) 1,64 (m) 8 40,8 40,9 - 39,9 40,4 - 39,2 40,5 - 9 48,2 48,7 1,60 (m) 48,4 48,9 1,65 (m) 47,8 49,2 1,66 (m) 10 37,8 38,5 - 37,1 37,6 - 36,5 37,6 - 11 23,9 24,5 1,96 (m) 24,0 24,5 1,91 (m) 23,4 24,5 1,92 (m) 12 126,2 126,9 5,24 (br s) 122,6 123,5 5,26 (br s) 120,2 123,5 5,26 (br s)f 13 138,4 139,2 - 145,3 145,2 - 146,2 145,0 - 14 42,6 43,3 - 42,4 42,9 - 42,2 43,0 - 15 28,7 29,2 1,08 (m) 1,93 (m) 28,6 28,8 1,10 (m) 1,80 (m) 28,1 28,9 1,10 (m) 16 24,7 25,2 1,74 (m) 2,06 (m) 24,0 24,0 1,61 (m) 2,02 (m) 22,5 24,1 1,65 (m) 2,00 (m) 17 48,4 49,3 - 46,9 47,6 - 47,4 47,3 - 18 53,4 54,1 2,22 (d, 11,5) 42,3 42,7 2,86 (br d, 10,5) 42,0 42,8 2,88 (br s) 19 39,2 40,3 1,38 (m) 46,8 47,2 1,16 (m) 1,71 (m) 46,0 47,3 1,14 (m) 1,71 (m) 20 39,4 40,2 0,98 (m) 31,1 31,6 - 31,2 31,6 - 21 30,8 31,7 1,32 (m) 1,50 (m) 34,4 34,9 1,22 (m) 1,40 (m) 33,5 35,0 1,22 (m) 1,40 (m) 22 36,8 37,4 1,62 (m) 1,73(m) 30,1 33,8 1,56 (m) 1,77 (m) 31,7 34,0 1,57 (m) 23 63,8 64,0 3,25 (d, 11,5) 3,68 (d, 11,5) 64,3 64,5 3,35 (d, 11,5) 3,58 (d, 11,5) 63,5 64,6 3,35 (d, 10,0) 3,57 (d, 10,0) T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 27 24 14,7 14,5 0,73 (s) 14,3 13,7 0,72 (s) 13,5 13,7 0,72 (s) 25 17,4 17,9 1,04 (s) 16,3 16,4 0,99 (s) 16,0 16,4 0,99 (s) 26 17,6 17,9 0,82 (s) 17,7 17,8 0,83 (s) 17,9 17,8 0,85 (s)f 27 23,8 24,1 1,11 (s) 26,4 26,5 1,19 (s) 26,1 26,5 1,20 (s) 28 176,2 177,8 - 181,1 181,9 - 181,2 ND - 29 17,8 17,7 0,88 (d, 6,5) 33,5 33,6 0,93 (s) 33,8 33,6 0,93 (s) 30 21,3 21,6 0,94* 24,0 24,0 0,96 (s) 24,2 24,0 0,96 (s) (a)đo trong CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz, d)đo trong Pyridine-d5, e)đo trong DMSO- d6, fpic tín hiệu có cường độ thấp chân rộng, NDtín hiệu không quan sát được do cường độ yếu #ilekudinosid C [3], %Hợp chất 2a [6], $davisianosid B [5], mult: độ bội tín hiệu, *)tín hiệu bị chồng chập). Bảng 2: Số liệu phổ 1H-,13C-NMR của phần đường của hợp chất 1 - 3 và các chất tham khảo. STT 1 2 3 #,dδC a,bδC a,cδH (mult, J Hz) %,dδC a,bδC a,cδH (mult, J Hz) $,eδC a,bδC a,cδH (mult, J Hz) Ara Ara Ara 1’ 106,6 106,2 4,28 (d, 7,5) 104,8 104,9 4,52 (d,5,5) 103,7 105,0 4,51 (d,5,0) 2’ 73,1 72,9 3,57 (dd, 7,5, 9,5) 75,6 76,9 3,67 (m) 74,5 76,8 3,68 (m) 3’ 74,9 74,5 3,51 (dd, 3,0, 9,5) 74,8 73,9 3,68 (m) 73,6 74,0 3,68 (m) 4’ 69,7 70,0 3,81 (m) 69,6 69,6 3,80 (m) 68,6 69,7 3,79 (br s) 5’ 67,8 67,8 3,50 (br d, 11,0) 3,61* 66,2 65,6 3,53 (dd, 3,5, 11,0) 3,86 (br d, 11,0) 65,4 65,7 3,52* 3,86* Glc Rham Rham 1” 95,7 95,6 5,34 (d, 8,5) 101,4 101,7 5,18 (br s) 100,3 101,7 5,20 (br s) 2” 74,1 73,8 3,31 (m) 71,6 71,0 4,26 (br s) 69,8 71,1 4,25 (br s) 3” 78,9 78,1 3,40 (m) 82,8 82,7 3,90 (m) 81,9 82,9 3,90 (dd, 3,0, 9,5) 4” 71,4 71,7 3,34 (m) 72,8 72,5 3,59 (m) 71,2 72,5 3,59 (m) 5” 79,2 78,4 3,34 (m) 69,7 70,1 3,93 (m) 68,6 70,1 3,94 (m) 6” 62,5 62,4 3,78* 3,66* 18,4 18,1 1,28 (d, 6,0) 18,3 18,1 1,28 (d, 6,0) Glc Glc Glc 1”’ 106,5 105,7 4,54 (d, 7,5) 104,6 105,6 4,55 (d, 8,0) 2”’ 75,6 75,3 3,33 (m) 68,3 75,5 3,37 (m) 3”’ 78,4 77,7 3,41 (dd, 8,5, 9,0) 75,1 76,4 3,51 (m) T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 28 4”’ 71,6 71,2 3,34 (m) 81,3 79,3 3,58 (m) 5”’ 78,3 77,7 3,34 (m) 77,1 76,7 3,40 (m) 6”’ 62,5 62,4 3,89* 3,71 (dd, 4,5, 11,5) 61,2 61,8 3,69* 3,85* Rham Rham 1”” 100,9 102,9 4,87 (br s) 2”” 71,0 72,4 3,87 (br s) 3”” 72,5 72,2 3,66 (m) 4”” 71,1 73,7 3,43 (dd, 9,5, 9,5) 5”” 68,6 70,7 3,99 (m) 6”” 18,2 19,8 1,29 (d, 6,0) (a)đo trong CD3OD, b)125 MHz, c)500 MHz, d)đo trong Pyridine-d5, e)đo trong DMSO- d6,, NDtín hiệu không quan sát được do cường độ yếu #ilekudinosid C [3], %Hợp chất 2 đã công bố [4], $davisianosid B [5], mult: độ bội tín hiệu,*)tín hiệu bị chồng chập). Hợp chất 1 phân lập được ở dạng chất bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử của 1 được xác định là C41H66O14, dựa trên phân tích phổ khối lượng phân giải cao (m/z 817,4161 [M+Cl]-, tính toán lý thuyết cho anion [C41H66O14Cl]- là 817,4147) và tín hiệu của 41 carbon trên phổ 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy tín hiệu proton của 6 nhóm methyl [δH 0,73, 0,82, 1,04 và 1,11 (mỗi tín hiệu 3H, singlet); 0,88 (3H, d, J = 6,5 Hz) và 0,94 (3H, tín hiệu bị chồng lấp)]; một proton olefin tại δH 5,24 (1H, br s); hai proton anomer tại δH 4,28 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,34 (1H, d, J = 8,5 Hz) gợi ý hợp chất này có 2 đơn vị đường. Các tín hiệu proton của phần đường, hình dạng tín hiệu proton của 6 nhóm methyl và sự xuất hiện một số lượng lớn các tín hiệu proton ở vùng trường cao (δH 0,84 ~ 2,01) cho phép dự đoán đây là một hợp chất saponin có cấu trúc khung aglycon dạng ursan. Tiếp theo, phân tích phổ 13C-NMR và DEPT của 1 nhận thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 41 nguyên tử carbon bao gồm: một nhóm carboxyl (δC 177,8) và 6 carbon khác không liên kết với hydro (C), 17 nhóm methin (CH), 11 nhóm methylen (CH2) và 6 nhóm methyl (CH3). Trong đó, aglycon khung ursan có chứa 30 carbon, tín hiệu của 11 carbon còn lại cho thấy chất 1 có hợp phần đường gồm 1 đơn vị đường hexose và 1 đơn vị đường pentose. Điều này cũng phù hợp với sự có mặt của 2 proton anomer quan sát được trên phổ proton như phân tích ở trên. Sự xuất hiện tín hiệu của 1 proton olefin và 2 carbon olefin (δC 126,9 và 139,2) trên phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton trong cấu trúc của 1. Vị trí các nhóm thế và quy kết chính xác các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 1 được thực hiện bằng phân tích phổ cộng hưởng T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 29 từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC. Các tương tác xa H-C quan trọng nhận được trên phổ HMBC của 1 được thể hiện ở hình 2. Trong đó, tương tác HMBC từ H-24 (δH 0,73) tới C-3 (δC 88,3)/C-4 δC 45,1)/C-5 (δC 47,7)/C-23 (δC 64,0) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-3 và C-23 cho phép xác định một liên kết C-O tại C-3 và một nhóm hydroxy tự do tại C-23. Tương tác HMBC từ H-27 (δH 1,11) tới C-8 (δC 40,9)/C-13 (δC 139,2)/C-14 (δC 43,3)/C-15 (δC 29,2) và tín hiệu carbon không liên kết với hydro ở vùng Csp2 của C-13 cho thấy vị trí liên kết đôi C=C tại C-12/C-13. Tín hiệu proton dạng douplet với hằng số J = 9,5 Hz của H-3 (δH 3,44) và giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-2 (δC 68.0) cũng gợi ý hai nhóm oxygen thế tại C-2 và C-3 chiếm vị trí tương đối trans-equatorial. Hai đơn vị đường trong hợp chất 1 được xác định là glucopyranosyl và arabinopyranosyl khi so sánh dữ liệu phổ 13C-NMR (δC 95,6, 73,8, 78,1, 71,7, 78,4, 62,4; 106,2, 72,9, 74,5, 70,0, 67,8) với số liệu phổ đã công bố [3]. Thêm vào đó, phân tử đường arabinopyranosyl gắn vào vị trí C-3 của aglycon được xác định nhờ tương tác HMBC giữa H-1δ (δH 4,28) với C-3 (δC 88,3) và giữa H-3 (δH 3,44) với C-1’ (δC 106,2); vị trí của phân tử đường glucopyranosyl còn lại được gắn vào vị trí C-28 của aglycon bởi tương tác HMBC giữa H-1” (δH 5,34) với C-28 (δC 177,8). Như vậy, cấu trúc hóa học của hợp chất 1 đã được thiết lập, đây là một hợp chất đã biết và có tên gọi là ilekudinosid C. Các số liệu phổ NMR của 1 hoàn toàn phù hợp với số liệu đã công bố [3]. Các sai khác nhỏ giữa số liệu phổ của 1 và hợp chất ilekudinosid C trong tài liệu tham khảo có thể do sự khác nhau về dung môi đo phổ NMR trong các nghiên cứu này. 2. Hợp chất 2. Hợp chất 2 có công thức phân tử là C47H76O17, được xác định bằng tín hiệu của píc ion giả phân tử quan sát được trên phổ khối lượng phân giải cao (m/z 911,5011 [M-H]-, tính toán lý thuyết cho anion [C47H75O17]- là 911,5010) cùng với tín hiệu của 47 nguyên tử carbon khi phân tích phổ 13C-NMR của 2. Giống như hợp chất 1, các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H-NMR của 2 cũng cho thấy đây là một hợp chất saponin. Tuy nhiên, sự xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm methyl đều có dạng singlet (δH 0,72, 0,83, 0,93, 0,96, 0,99 và 1,19; mỗi tín hiệu 3H) gợi ý cho thấy hợp chất 2 có aglycon thuộc dạng khung olean. Sự xuất hiện tín hiệu của 3 proton anomer [δH 4,52 (1H, d, J = 5,5 Hz), 4,54 (1H, d, J = 7,5 Hz) và 5,18 (1H, br s)] cho thấy ba đơn vị đường có mặt trong cấu trúc của 2. Mặt khác, tín hiệu dạng multiplet của H-3 (δH 3,64), tương tác COSY giữa H-3 và H-2 (δH 1,75 và 1,90), cùng với giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-2 (δC 26,5, xác định bằng phân tích phổ HSQC) cho thấy hợp chất 2 không có nhóm hydroxy thế tại C-2 như hợp chất 1. Thêm vào đó, giá trị độ chuyển dịch hóa học của carbon carboxyl (δC 181,9) và sự thiếu vắng tương tác HMBC từ một trong số các proton anomer tới carbon này cho thấy hợp chất 2 mang nhóm COOH tự do. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 30 Phân tích chi tiết các tương tác COSY và HSQC tín hiệu thuộc hợp phần đường cho phép gán các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của hợp phần đường (bảng 2 và hình 2). Đồng thời các số liệu phổ này cũng hoàn toàn phù hợp với số liệu tương ứng của một chuỗi trisaccharid (3-O-β-D-glucopyranosyl- (1
3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1
2)-α-L- rabinopyranosid) thường gặp trong các hợp chất có trong cây đu đủ rừng [2]. Vị trí của liên kết glycosid cũng lần lượt khẳng định bằng tương tác HMBC, bao gồm tương tác giữa glc H-1’”(δH 4,54) với rham C-3”(δC 82,7) và rham H-1”(δH 5,18) và ara C-2’(δC76,9). Đồng thời tương tác HMBC giữa proton anomer H-1’ (δH 4,52) và C-3 (δC 82,4) cho phép xác định liên kết giữa hợp phần đường và aglycon qua cầu nối O-glycosid tại C-3. Do đó, hợp chất 2 được xác định là hederagenin-3-O-â-D-glucopyranosyl- (1δ3)-α-L-rhamnopyranosyl-(1δ2)-α- L-arabinopyranosid, một olean saponin đã được các nhà khoa học Nhật Bản phân lập từ loài Aralia elata [4]. Mặc dù hợp chất 2 được công bố phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, tuy nhiên theo tìm hiểu của chúng tôi, dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất 2 chưa được công bố đầy đủ. Trong các công trình trước, hầu hết chỉ công bố số liệu 13C-NMR của hợp phần đường. Do đó, trong công trình này, chúng tôi thông báo một cách đầy đủ và chính xác dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất 2. Các số liệu 13C-NMR từng hợp phần (aglycon và đường) của 2 cũng được so sánh và hoàn toàn phù hợp với phần cấu trúc tương tự của các hợp chất đã được công bố (bảng 1 và bảng 2). 3. Hợp chất 3. Hợp chất 3 có dạng bột vô định hình màu trắng, công thức phân tử của 3 được xác định là C53H86O21, dựa trên píc ion giả phân tử m/z 1057,5588 [M-H]-(tính toán lý thuyết cho anion [C53H85O21]-, 1057,5589) quan sát được trên phổ khối lượng phân giải cao và phù hợp với phân tích phổ 13C-NMR. Phân tích phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 3 nhận thấy các số liệu phổ của 3 hoàn toàn tương tự với số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 2 trong cùng dung môi đo CD3OD, ngoại trừ có xuất hiện thêm các tín hiệu của một đơn vị đường rhamnose (bảng 1 và bảng 2). Mặc dù trong điều kiện đo phổ 13C-NMR của 3, tín hiệu của carbon carboxylic không đủ cường độ để quan sát rõ ràng. Tuy nhiên, sự phù hợp gần như hoàn toàn về số liệu phổ cả 1H và 13C-NMR của phần aglycon giữa 2 và 3 cho phép khẳng định chúng giống nhau ở cấu trúc aglycon, đồng thời điều này hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của 3 (C53H86O21) đã được chứng minh bằng phổ HRMS nêu trên và sự khác biệt một đơn vị C6H10O4 (rhamnosyl) trong công thức phân tử của 3 so với 2 (C47H76O17). Sự dịch chuyển về vùng trường thấp hơn tín hiệu C-4”’ (δC 79,3) ở 3 so với 2 (δC 71,2) và tương tác HMBC giữa rham H-1””(δH 4,87) và glc C-4”’ (δC 79,3) cho phép xác định liên kết glycosid của đơn vị đường rhamnose cuối mạch là O-glycosid (1””
4”’). Do đó, cấu trúc hóa học của 3 cũng được thiết lập, đây là một hợp chất đã biết có tên là davisianosid B, được phân lập trước đó từ loài Cephalaria davisiana [5]. Sự khác biệt nhỏ về số liệu phổ 13C-NMR của 3 (đo trong CD3OD) T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016 31 và davisianosid B ở tài liệu công bố (đo trong DMSO-d6) có thể do khác biệt về dung môi đo NMR giữa các nghiên cứu. Một số tín hiệu 13C-NMR có sự sai khác lớn (xảy ra do quy kết các giá trị phổ ở những vị trí carbon không tương đồng giữa hợp chất 3 và tài liệu công bố) chẳng hạn tại vị trí C-3 và C-4”’, đã được kiểm tra và khẳng định chính xác lại dựa trên phân tích phổ hai chiều HMBC của hợp chất 3. KẾT LUẬN Từ dịch chiết methanol của lá cây đu đủ rừng, chúng tôi đã phân lập được 3 hợp chất saponin thuộc hai khung aglycon khác nhau là ursan và olean. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định là ilekudinosid C (1) và hederagenin 3-O-â-D- glucopyranosyl-(1#3)-á-L-rhamnopyranosyl- (1#2)-á-L-arabinopyranosid (2) và davisianosid B (3). Nghiên cứu bước đầu làm sáng tỏ thành phần hóa học của cây đu đủ rừng, là cơ sở để đánh giá hoạt tính sinh học nhằm làm rõ công dụng của cây đu đủ rừng trong các bài thuốc cổ truyền dân tộc, hướng tới phát triển các nguồn hợp chất thiên nhiên có hoạt tính trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Văn Chi. Đu đủ rừng. Từ điển Cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2012, tập 1, tr.970-971. 2. Nunziatina DT, Giuseppina A, Aurora B, Aldo P, Cosimo P, Raffaella S, Pietro V. Antiproliferative triterpene saponins from Trevesia palmata. Journal of Natural Products. 2000, 63, pp.308-314. 3. Nishimura K, Miyase T, Noguchi H. Triterpenoid saponins from Ilex kudincha. Journal of Natural Products. 1999, 62, pp.1128-1133. 4. Saito S, Sumita S, Tamura N, Nagamura Y, Nishida K, Ito M, Ishiguro I. Saponins from the leaves of Aralia elata SEEM: Araliaceae. Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1990, 38, pp. 411-414. 5. Peyker K, Nazli BS, Suheyla K. Two novel saponins from Cephalaria davisiana (Dipsacaceae). Phytochemistry Letters. 2014, 10, pp.324–329. 6. Bang SC, Kim Y, Lee JH, Ahn BZ. Triterpenoid saponins from the roots of Pulsatilla koreana. Journal of Natural Products. 2005, 68, pp.268-272.