Phân lập một số hợp chất từ thân rễ cây ngải trắng curcuma aromatica salisb, zingiberaceae trồng tại An Giang

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 298 PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ THÂN RỄ CÂY NGẢI TRẮNG CURCUMA AROMATICA SALISB., ZINGIBERACEAE TRỒNG TẠI AN GIANG Võ Thanh Hóa***, Nguyễn Thị Tường Vy*, Huỳnh Thanh Tuấn**, Đỗ Đức Minh**, Lê Kiều Minh**, Nguyễn Đức Hạnh* TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Dược liệu Ngải trắng Curcuma aromatica được trồng và sử dụng như một vị thuốc nam phổ biến tại An Giang. Hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu nào công bố thành phần hóa học của dược liệu này trồng tại An Giang. Do đó, việc phân lập các hợp chất từ dược liệu Ngải trắng đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu thuốc và kiểm ngiệm dược liệu Ngải trắng trồng tại An Giang. Phương ph{p nghiên cứu: Dược liệu Ngải trắng được chiết bằng cồn 96%, cô thu hồi dung môi được cao. Từ cao cồn 96%, t{ch c{c ph}n đoạn đơn giản bằng phương ph{p chiết phân bố giữa nước v| c{c dung môi có độ phân cực khác nhau. Phân lập các hợp chất tinh khiết bằng phương ph{p sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột pha đảo. Cấu trúc các chất phân lập được x{c định bằng phổ NMR. Kết quả: Từ 1,5 kg dược liệu Ngải trắng, chiết xuất được 170 g cao cồn 96%. Bằng phương ph{p chiết phân bố thu được 62 g cao ph}n đoạn ether dầu v| 70 g cao ph}n đoạn ethyl acetat. Từ cao ph}n đoạn ether dầu, phân lập được 50 mg hợp chất germacron và 107 mg hợp chất curdion. Từ cao ph}n đoạn ethyl acetat phân lập được120 mg hợp chất zedoarondiol. Kết luận: Các hợp chất phân lập được là những hợp chất đã được nghiên cứu và công bố có tác dụng dược lý chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm(1-3). Do đó những hợp chất này phù hợp để lựa chọn làm chất điểm chỉ cho dược liệu Ngải trắng trồng tại An Giang. Từ khóa: Curuma aromatica, germacron, curdion, zedoarondiol, An Giang ABSTRACT ISOLATION OF COMPOUNDS FROM RHIZOME OF CURCUMA AROMATICA SALISB, ZINGIBERACEAE GROWN IN AN GIANG PROVINCE Vo Thanh Hoa, Nguyen Thi Tuong Vy, Huynh Thanh Tuan, Do Duc Minh, Le Kieu Minh, Nguyen Duc Hanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 296 - 306 Introduction - objectives: Ngai trang Curcuma aromatica is popularly used in the folk medicine in An Giang province. Until now there is no report on compounds isolated from C. aromatica grown in An Giang province. Hence, the aim of this study is to isolate and identify structures of compounds from C. aromatica rhizome. Methods: Dried C. aromatica rhizome was extracted by ethanol 96% to obtain the dried extract. The extract was further subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of compounds. Isolation of compounds from simple fractions was carried out by common and popular phytochemical methods. Structures of isolated compounds were deduced by means of NMR spectroscopy. * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh ** Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh ***Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đức Hạnh ĐT: 0913576748 Email: duchanh@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 299 Results: 170 g of dried ethanolic extract were obtained from 1.5 kg of dried C. aromatica rhizome. By liquid- liquid distribution, 70 g of petroleum ether extract and 62 g of ethyl acetate extract were obtained. From petroleum ether extract, 50 mg of germ crone and 107 mg of curdione were isolated. From ethyl acetate extract, 120 mg of zedoarondiol were isolated. Conclusions: Three major compounds of C. aromatica rhizome such as germ crone, curdione and zedoarondiol, were isolated and identified. These compounds were reported on pharmacological activities such as anti-cancer, anti-oxidant, anti-inflammation (1-3). The compounds could be used as markers for controlling the quality of C. aromatica grown in An Giang. Keywords: Curuma aromatica, germacrone, curdione, zedoarondiol ĐẶT VẤN ĐỀ Ngải trắng Curcuma aromatica, một loài thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) hiện nay mọc hoang và đƣợc trồng chủ yếu ở vùng Bảy Núi, thuộc tỉnh An Giang. Trong các bài thuốc dân gian, Ngải trắng đƣợc dùng để trị đau dạ d|y, đau bụng, viêm gan, làm lành vết thƣơng, kh{ng viêm v| phối hợp trong các bài thuốc trị ung thƣ. C}y thuốc n|y đƣợc tỉnh An Giang đƣa v|o danh sách những dƣợc liệu cần bảo tồn và nghiên cứu phát triển nhằm mang lại lợi ích kinh tế cho ngƣời d}n. Đề t|i đƣợc tiến hành với mục đích phân lập một số hợp chất chính góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và kiểm nghiệm dƣợc liệu Ngải trắng trồng tại An Giang. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PH[P NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Thân rễ của cây Ngải trắng thu hái tại tỉnh An Giang đã đƣợc định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen tại Trung tâm Y Sinh học phân tử, ĐH Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh. Phƣơng ph{p nghiên cứu Phân lập một số hợp chất từ thân rễ cây Ngải trắng Chiết xuất Thân rễ Ngải trắng khô đƣợc chiết bằng phƣơng ph{p ngấm kiệt với dung môi cồn 96%. Dịch chiết đƣợc cô thu hồi dung môi thu đƣợc cao cồn 96%. Cao cồn 96% đƣợc ph}n t{n v|o nƣớc và tiến hành lắc phân bố lần lƣợt với ether dầu hỏa (PE) (60 – 90oC) và ethyl acetat (EA). Cô thu hồi dung môi, thu đƣợc c{c cao ph}n đoạn PE và EA tƣơng ứng. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột pha thuận C{c cao ph}n đoạn đƣợc phân lập các chất bằng phƣơng ph{p sắc ký cột cổ điển, sử dụng silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck); hệ dung môi đã khảo sát bằng phƣơng ph{p sắc ký lớp mỏng (SKLM). Tiến hành khai triển sắc ký cột và theo dõi c{c ph}n đoạn bằng SKLM. Dựa vào kết quả SKLM để gom ph}n đoạn. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột pha đảo C{c cao ph}n đoạn đƣợc phân lập bằng phƣơng ph{p sắc ký cột pha đảo, sử dụng silica gel RP18 cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck); hệ dung môi methanol – nƣớc, tăng dần tỷ lệ methanol. Tiến hành khai triển sắc ký cột và theo dõi các phân đoạn bằng SKLM. Dựa vào kết quả SKLM để gom ph}n đoạn. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng Bằng phƣơng ph{p SKLM, c{c hợp chất đƣợc kiểm tra độ tinh khiết. Khai triển các hợp chất này với 3 hệ dung môi khác nhau. Phát hiện bằng UV 254 và 365 nm, thuốc thử H2SO4 10%/ cồn. X{c định cấu trúc của các hợp chất phân lập X{c định cấu trúc của các chất phân lập đƣợc bằng phƣơng ph{p phổ NMR. Phổ NMR đƣợc đo với c{c kĩ thuật 1-D (1H-, 13C-) (M{y đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Brüker AVANCE 500 - Mỹ). Từ các dữ liệu phổ ghi nhận đƣợc, kết hợp với các dữ liệu từ các tài liệu tham khảo, định Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 300 hƣớng, x{c định cấu trúc hóa học của các chất phân lập. KẾT QUẢ Phân lập Chiết xuất 1,5 kg dƣợc liệu khô, chiết ngấm kiệt bằng cồn 96%, thu hồi dung môi thu đƣợc 170 g cao cồn 96%. Từ 150 g cao cồn 96% lắc phân bố phân bố lần lƣợt với PE và EA thu đƣợc 62 g cao PE và 70 g cao EA. Phân lập các hợp chất trong cao EA bằng sắc ký cột pha thuận Từ 20 g cao EA, tiến hành sắc ký cột silica gel pha thuận với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat, với tỷ lệ tăng dần ethyl acetat. Thu đƣợc 5 ph}n đoạn, trong đó ph}n đoạn 3 (PĐ 3) tƣơng ứng với tỷ lệ dung môi ether dầu – ethyl acetat (6 : 4) cho 1 vết chính trên SKLM, cô thu hồi dung môi đƣợc 4,1 g PĐ 3. Tinh chế PĐ 3 bằng sắc ký cột pha đảo Từ 3 g PĐ 3, tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ dung môi methanol – nƣớc, với tỷ lệ tăng dần methanol. Thu đƣợc 3 ph}n đoạn, trong đó ph}n đoạn 3-1 tƣơng ứng với tỷ lệ dung môi methanol 40% cho 1 vết trên SKLM, cô thu hồi dung môi đƣợc 120 mg hợp chất CA1. Phân lập các hợp chất trong cao PE bằng sắc ký cột pha thuận Từ 10 g cao PE, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat, với tỷ lệ tăng dần ethyl acetat. Thu đƣợc 6 phân đoạn, trong đó ph}n đoạn 2 tƣơng ứng với hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat (9 : 1) và phân đoạn 4 tƣơng ứng với hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat (8 : 2) cho 1 vết trên SKLM, cô thu hồi dung môi, thu đƣợc 90 mg hợp chất CA2 và 107 mg hợp chất CA3 tƣơng ứng với từng ph}n đoạn. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel F254; Hệ dung môi: Hệ 1: Cloroform – Acid acetic (9 : 1); Hệ 2: n-Hexan – Ethyl acetat (4 : 6); Hệ 3: Ether dầu hỏa – Ethyl acetat (6 : 4). Phát hiện: Thuốc thử H2SO4 10%/ethanol. Cả 3 hợp chất CA1, CA2 và CA3 đều cho 1 vết trên SKLM ở điều kiện phân tích. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC phân tích Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC – 8A, đầu dò UV (Nhật). Cột: Discovery HS C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm). Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích bơm: 20 µl. Bước sóng phát hiện: 214 nm. Pha động: acetonitril – nƣớc, rửa giải gradient. Dung môi pha mẫu: Pha động. Các hợp chất CA1, CA2 v| CA3 đều cho 1 pic trên sắc ký đồ ở điều kiện phân tích. Tiến h|nh đo v| đối chiếu tài liệu, biện giải phổ của các hợp chất CA1, CA2 và CA3. X{c định cấu trúc của các hợp chất phân lập đƣợc Hợp chất CA1 Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CA1 đƣợc trình vày trong Hình 2, Hình 3 và Bảng 1. Từ phổ 1H- NMR cho thấy CA1 có chứa 4 nhóm methyl tại 1,19 ppm, 1,2 ppm, 1,8 ppm và 1,9 ppm. Từ phổ 13C – NMR cho thấy hợp chất có 15C ứng với 15 tín hiệu. Phổ 13C – NMR của hợp chất CA1 cho 1 tín hiệu ceton tại 202,9 ppm, ngoài ra còn xuất hiện tín hiệu của >C= (tại C7 và C11, tƣơng ứng với 134,6 ppm và142,1 ppm). Từ kết quả phổ NMR, so sánh với tài liệu tham khảo(4), kết luận hợp chất CA1 chính là zedoarondiol và công thức cấu tạo nhƣ sau: Hình 1: Công thức cấu tạo của zedoarondiol Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 301 Hình 2: Phổ 1H – NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất CA1 Hình 3: Phổ 13C – NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất CA1 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 302 Bảng 1: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR (CDCl3, 500/125 MHz) của CA1 với zedoarondiol (CDCl3, 90/22,5 MHz) theo tài liệu(4) Vị tr Zedoarondiol CA1 C (ppm) H (ppm, J/Hz) C (ppm) H (ppm, J/Hz) 1 55,9 55,9 2 22,9 22,9 3 28,5 28,5 4 79,9 79,9 5 52 52 6 39,7 39,7 7 134,6 134,6 8 202,9 202,9 9 59,8 2,60 d (13); 2,98 d (13) 59,8 2,59 d (13); 2,94 d (13) 10 72,7 72,7 11 142,1 142,1 12 21,9 1,84 s 1,94 s 21,9 1,83 s 1,94 s 13 22,2 22,2 14 22,7 1,18 s 1,20 s 22,7 1,18 s 1,20 s 15 20,6 20,6 Hợp chất CA2 Phổ 1H và 12C-NMR của hợp chất CA2 đƣợc trình vày trong Hình 6, Hình 7 và Bảng 2. Từ phổ 1H – NMR cho thấy CA2 có chứa 4 nhóm methyl tƣơng ứng tại 1,776 ppm, 1,725 ppm, 1,629 ppm và 1,441 ppm. Từ phổ 13C – NMR cho thấy hợp chất CA2 có 15C ứng với 15 tín hiệu. Từ phổ này cho thấy có 1 tín hiệu ceton tại 207,9 ppm, ngoài ra còn xuất hiện 4 tín hiệu của >C= (tại C4, C7,C10, C11 ứng với 126,6 ppm, 129,5 ppm, 134,6ppm và 137,2 ppm) và 2 tín hiệu -CH= (tại C1 và C5 ứng với 132,6 ppm và 125,3 ppm). Từ kết quả phổ NMR, so sánh với tài liệu tham khảo(5), kết luận hợp chất CV2 chính là germacron và công thức cấu tạo nhƣ sau: Hình 4: Công thức cấu tạo của germacron Hợp chất CA3 Phổ 1H và 12C-NMR của hợp chất CA3 đƣợc trình bày trong Hình 8, Hình 9 và Bảng 3. Từ phổ 1H- NMR cho thấy CA3 có chứa 3 nhóm methyl >C-CH3 tại 0,88 ppm, 0,95 ppm, 0,99 ppm; và chứa 1 nhóm methyl >C=C-CH3 tại 1,65 ppm. Từ phổ 13C – NMR cho thấy CA3 có 15C ứng với 15 tín hiệu, ngoài ra CA3 chứa 2 nhóm ceton với hai tín hiệu tƣơng ứng với C5 và C8 tại 214,4 ppm và 211,1 ppm. Bên cạnh đó CA3 còn chứa 1 tín hiệu >C= (ứng với C10 tại 129,9 ppm) và một -CH= (ứng với C1 tại 131,6 ppm). Từ kết quả phổ NMR, so sánh với tài liệu tham khảo(5), kết luận hợp chất CV3 chính là curdion và có công thức cấu tạo nhƣ sau: Hình 5: Công thức cấu tạo của curdion Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 303 Hình 6: Phổ 1H – NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất CA2 Hình 7: Phổ 13C – NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất CA2 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 304 Bảng 2: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR (CDCl3, 500/125 MHz) của CA2 với germacron (CDCl3, 400/100 MHz) theo tài liệu(5) Vị tr Germacron CA2 C (ppm) H (ppm, J/Hz) C (ppm) H (ppm, J/Hz) 1 132,6 4,99 brd (11,7) 132,8 4,97 brd (11,5) 2 24 2,06 - 2,40 m 24,3 2,06 - 2,38 m 3 38 2,06 - 2,40 m 39,3 2,06 - 2,38 m 4 126,6 126,9 5 125,3 4,71 brd (8,6) 125,6 4,70 brd (9) 6 29,2 2,86 brd (11,2); 2,94 m 29,4 2,85 brd (11,5); 2,94 m 7 129,5 129,3 8 207,9 208 9 55,8 2,94 m; 3,41 d (10,5) 56 2,94 m; 3,40 d (10,5) 10 134,6 135,1 11 137,2 137,5 12 22,3 1,78 s 22,5 1,77 s 13 19,9 1,73 s 20 1,71 s 14 15,5 1,43 s 15,7 1,43 s 15 16,7 1,63 s 16,9 1,62 s Bảng 3: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR (CDCl3, 500/125 MHz) của Cv6 với curdion (CDCl3, 400/100 MHz) theo tài liệu(5) Vị tr Curdion CA3 C (ppm) H (ppm, J/Hz) C (ppm) H (ppm, J/Hz) 1 131,5 5,17 brs 131,6 5,17 brs 2 26,4 2,09 - 2,14 m 26,4 2,07 - 2,16 m 3 33,4 1,58 m; 2,09 - 2,14 m 34 1,58 m; 2,07 - 2,16 m 4 46,7 2,34 m; 46,8 2,34 m 5 211,1 211,1 6 44,2 2,40 dd (16,6; 2); 2,69 m 44,2 2,40 dd (17; 2); 2,69 m 7 53,5 53,6 8 214,3 214,4 9 55,8 55,9 10 129,8 129,9 11 29,7 1,87 m 30 1,87 m 12 21,1 21,1 13 19,8 19,8 14 18,5 18,5 15 16,5 1,66 s 16,6 1,66 s Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 305 Hình 8: Phổ 1H – NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất CA3 Hình 9: Phổ 13C – NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất CA3 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 306 BÀN LUẬN Bằng các phƣơng pháp phân lập thƣờng quy v| đơn giản sử dụng trong phân lập hóa thực vật đã ph}n lập đƣợc các hợp chất với độ tinh khiết cao và hiệu suất cao. Đ}y có thể là cơ sở để xây dựng quy trình phân lập tối ƣu cho các chất chỉ điểm của dƣợc liệu Ngải trắng. KẾT LUẬN Đề t|i đã ph}n lập v| x{c định đƣợc 3 hợp chất từ thân rễ Ngải trắng Curcuma aromatic là zedoarondiol, germacron và curdion. Các hợp chất n|y đã đƣợc nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh có tác dụng chống ung thƣ, kh{ng viêm, chống oxy hóa(1-3). Do đó, có thể dùng các hợp chất này làm chất điểm chỉ để định tính, định lƣợng dƣợc liệu Ngải trắng trồng tại An Giang. CẢM ƠN Công trình nghiên cứu đƣợc tài trợ theo đề tài mã số 373.2017.04 cấp bởi Sở Khoa học – Công nghệ An Giang TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Al-Reza SM, Rahman A, Sattar MA, (2010), Essential oil composition and antioxidant activities of Curcuma aromatica Salisb. Food Chem Toxicol, 2 (1), 60-62. 2. Kumar A, Chomwal R, Kumar P. (2009), "Anti inflammatory and wound healing activity of Curcuma aromatica Salisb. extract and its formulation”, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research,1 (1), 304-310. 3. Liu B, GaoYQ (2014), “Germacrone inhibits the proliferation of glioma cells by promoting apoptosis and inducing cell cycle arrest.”, Mol Med Rep,10 (1046), 49-50. 4. Masanori K, Akira U, Kaoru U, Sadao S (1987), “Strucutres of Sesquiterpenes from Curcuma aromatica Salisb, Chem. Pharm. Bull, 35(1), 53-59. 5. Yang FQ, Li S.P, Chen Y, Lao SC (2005), “Identification and quantitation of eleven sesquiterpenes in three species of Curcuma rhizomes by pressurized liquid extraction and gas chromatography-mass spectrometry”, Journal of Pharmcateutical and Biomedical Analysis,39, 552-558. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018