Phân lập nấm bệnh neoscytalidium dimidiatum trên cây thanh long và nghiên cứu kiểm soát bằng vi sinh vật

Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(4):286-293 Open Access Full Text Article Bài Nghiên cứu 1Công ty TNHH Gia Tường 2Trường Đại học Văn Lang Liên hệ Nguyễn Như Nhứt, Công ty TNHH Gia Tường Email: nhunhutnguyen@yahoo.co.uk Lịch sử  Ngày nhận: 04-12-2018  Ngày chấp nhận: 7-10-2019  Ngày đăng: 31-12-2019 DOI : 10.32508/stdjns.v3i4.585 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM. Đây là bài báo công bố mở được phát hành theo các điều khoản của the Creative Commons Attribution 4.0 International license. Phân lập nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum trên cây Thanh long và nghiên cứu kiểm soát bằng vi sinh vật Nguyễn Như Nhứt1,*, Nguyễn Thị Ngọc Bích1, Nguyễn Thanh Trường1, Võ Thị Xuyến2 Use your smartphone to scan this QR code and download this article TÓM TẮT Trong những năm gần đây, nấm Neoscytalidium dimidiatum gây dịch bệnh đốm trắng nghiêm trọng trên cây Thanh long trong khi vẫn chưa có biện pháp kiểm soát hiệu quả. Trong nghiên cứu này, bằng cách phân lập trên môi trường thạch nước có bổ sung streptomycin, các kiểm tra hình thái, bệnh học in vitro, in vivo và sinh học phân tử bằng cách giải trình tự các gen ITS1 và ITS4 đã thu nhận được hai chủng N. dimidiatum NdGV và NdBT. Bằng kỹ thuật nuôi cấy kép trên môi trường thạch khoai tây cho thấy 100% chủng Trichoderma spp., 75% chủng Bacillus spp. và 20% chủng Streptomyces spp. có khả năng đối kháng với N. dimidiatum. Hiệu quả đối kháng trung bình với N. dimidiatum của các chủng Trichoderma spp. cao hơn Bacillus spp. và thấp nhất là Streptomyces spp. tương ứng là 56,8 %, 55,3% và 54,3%. Đặc biệt là 5 chủng Trichoderma sp. 8.3.5, 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19 và 8.3.20 có hiệu quả đối kháng trên 60%. Tiềm năng ứng dụng của 5 chủng Trichoderma này để kiểm soát bệnh do N. dimidiatum được củng cố thêm khi hiệu quả đối kháng của chúng tương đối ổn định trên môi trường thạch Thanh long trong khi tất cả các chủng Bacillus sp. và Streptomyces sp. bị mất khả năng đối kháng. Đáng chú ý là bốn trong năm chủng Trichoderma này có khả năng tương thích cao nên đã cho thấy cần có những nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng tiềm năng phối hợp của chúng trong việc tăng cường khả năng kiểm soát bệnh do nấm N. dimidiatum NdGV và NdBT trên cây Thanh long. Từ khoá: Thanh long, Neoscytalidium dimidiatum, Streptomyces, Bacillus, Trichoderma MỞĐẦU Cây Thanh long là loại cây ăn quả mà trong những năm gần đây có tiềm năng xuất khẩu và mang lại lợi ích kinh tế khá cao1. Thanh long là một trong những loại trái cây quan trọng không những ở cấp quốc gia mà lẫn quốc tế2. Tuy nhiên, trong nhữngnămgầnđây dịch hại là nguyên nhân làm giảm năng xuất và chất lượng quả, đặc biệt là bệnh đốm trắng do nấmNeoscy- talidium dimidiatum (thuộc họ Botryosphaeriaceae; bộ Botryosphaeriales; lớp nấm túi Ascomycetes) gây ra3. Loài nấmnày có khả năng lây lan nhanh và kháng với nhiều loại thuốc hóa học đặc trị nấm. Do đó, vi sinh vật được hy vọng là hướng tiếp cận tiềm năng để góp phần phòng trừ bệnh hại do nấm N.dimidiatum và nâng cao chất lượng quả Thanh long 4. Gần đây, một số nghiên cứu đã chứng minh nhiều vi sinh vật khác nhau như Bacillus spp.5, Streptomyces spp.6 và Trichoderma sp.4 có hoạt tính đối kháng với N. dimidiatum. Mặc dù vậy, các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở bước phân lập, định danh các vi sinh vật có khả năng đối kháng với N. dimidiatum và đánh giá hiệu quả đối kháng trong điều kiện in vitro. Thêm vào đó, các nghiên cứu chỉ thực hiện trên một số ít các chủng vi sinh vật đã phân lập được và chưa có các nghiên cứu đánh giá so sánh hiệu quả đối kháng giữa các vi sinh vật với nhau. Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá khả năng kiểm soát in vitro và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm bệnh đã phân lập được bằng nhiều chủng Bacillus, Streptomyces và Tri- choderma trong kiểm soát nấm N. dimidiatum. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chủng vi sinh vật Hai mươi chủng Trichoderma spp., hai mươi chủng Bacillus spp. và hai mươi chủng Streptomyces spp. được cung cấp bởi Chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương. Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy và bảo quản tương ứng trên các môi trường thạch nghiêng nước chiết khoai tây (PGA), cao thịt – peptone và Gause. Mẫu Thanh long in vitro và in vivo Các mẫuThanh long bị bệnh đốm trắng được thu tại các vườn trồng ở Hàm Thuận Nam (Bình Thuận) và Gò Vấp (Tp. Hồ Chí Minh) được dùng để phân lập nấm bệnh N.dimidiatum. Các mẫu đoạn cànhThanh long in vitro (5 – 10 cm) và cây Thanh long in vivo Trích dẫn bài báo này: Như Nhứt N, Ngọc Bích N T, Thanh Trường N, Xuyến V T. Phân lập nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum trên cây Thanh long và nghiên cứu kiểm soát bằng vi sinh vật. Sci. Tech. Dev. J. - Nat. Sci.; 3(4):286-293. 286 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(4):286-293 (mang cành non dài 40 – 50 cm) không bị bệnh được dùng để kiểm tra bệnh học tương ứng in vitro và in vivo. Phương pháp Phân lập nấmNeoscytalidium dimidiatum Nấm bệnh N.dimidiatum được phân lập từ các mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng theo phương pháp của Thongkham và Soytong2,7. Sau 2 - 3 ngày đặt mẫu bệnh (0,5 - 1 cm) trên môi trường thạch nước (wa- ter agar) có bổ sung streptomycin sulfate 50 mM, tách sợi nấm mọc lên trên mẫu và lan ra môi trường để làm thuần. Các chủng nấm thu được được kiểm tra đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường PGA và khuẩn ty dưới kính hiển vi theoThongkham, Soy- tong2, Yi và cộng sự1. Kiểm tra bệnh học in vitro và in vivo được thực hiện bằng cách dùng que cấy hoặc kim tiêm tạo vết thương và bôi một ít sinh khối của chủng nấm tương ứng trên các đoạn cànhThanh long (đã được khử trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 5 giây trước khi rửa lại bằng nước vô trùng và để khô) hoặc cành non trên cây trong nhà lưới 8. Triệu chứng bệnh được ghi nhận theo thời gian sau khi gây nhiễm. Đồng thời, các chủng nấm cũng được gởi đi phân tích trình tự của các gen ITS1 và ITS49 ở Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM). Xác địnhhiệu quảđối kháng của các chủng vi sinh vật với nấmbệnh Kỹ thuật nuôi cấy kép trênmôi trường PGA được ứng dụng để xác định hiệu quả đối kháng in vitro của các chủng vi sinh vật với nấm bệnh. Hiệu quả đối kháng của các chủngTrichoderma được xác định bằng cách cấy điểm theo kiểu đối xứng với nấm bệnh qua tâm đĩa petri và các điểm cấy cách mép đĩa khoảng 1,5 cm10. Với Streptomyces và Bacillus, cấy sinh khối Bacillus sp. (hoặc Streptomyces) thành 2 vệt dài 3 cm, đối xứng với điểm cấy nấm bệnh ở tâm đĩa petri, vệt cấy cách mép đĩa 1,5 cm11. Đĩa đối chứng là đĩa chỉ cấy nấm bệnhmà không có Trichoderma, Bacillus hay Streptomyces. Các đĩa sau khi cấy được ủ trong tối đến khi nấm bệnh trên đĩa đối chứng phát triển đến mép đĩa. Cách tính hiệu quả đối kháng của các chủng vi sinh vật với nấm bệnh Ferreira và cộng sự (1991) 10: H (%) = ((A – B)/A) x 100 Trong đó: H: Hiệu quả ức chế (%); A: Đường kính nấm bệnh trên đĩa đối chứng (mm); B: Đường kính nấm bệnh trên đĩa đối kháng (mm). Đánhgiá tiềmnăngứngdụngtrêncâyThanh long Các chủng vi sinh vật có hiệu quả đối kháng cao được đánh giá tiềm năng kiểm soát nấm bệnh N.dimidiatum trên câyThanh long bằng cách xác định hiệu quả đối kháng in vitro trên môi trường thạch Thanh long (chứa 20 g agar trong 1 lít nước chiết sau khi đun sôi 30 phút 200 g cành Thanh long). Các chủng có khả năng đối kháng trên môi trường thạch Thanh long tiếp tục được xác định khả năng tương thích theo Ilham và cộng sự 10 để đánh giá tiềm năng ứng dụng phối hợp trong kiểm soát N. dimidiatum. Xử lý số liệu Số liệu thu được từ kết quả các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phầnmềmSPSS version 20.0 theo phép thử Duncan, p = 0,05 và được trình bày dưới dạng số trung bình của 3 lần lặp lại. KẾT QUẢ Phân lập nấm bệnh N. dimidiatum Từ các mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng thu được từHàmThuậnNamvàGòVấp (Hình 1a và b) đã phân lập được 2 dòng nấm trên môi trường thạch nước có bổ sung streptomycine sulfate 50 mM (Hình 1c và d). Trong đó, dòng nấm NdBT được phân lập từ mẫu bệnh thu ở Bình Thuận và NdGV từ mẫu bệnh thu được ở Gò Vấp. Các đặc điểm hình thái khuẩn lạc của hai dòng nấm NdBT và NdGV (Hình 1e và f) tương tự với các báo cáo trước đây1,2,7. Dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X, hai dòng NdBT và NdGV có cơ quan sinh dưỡng dạng sợi đa bào có vách ngăn và phân nhánh phức tạp (Hình 1g và h). Sợi nấm sinh sản có dạng chuỗi mang bào tử hay còn gọi là bào tử đốt. Các bào tử có hình tròn hoặc bầu dục. Kiểm tra bệnh học trên các đoạn cành Thanh long in vitro cho thấy các mẫu đối chứng không được gây nhiễm với hai dòng nấm NdBT và NdGV vào vết thương đều không xuất hiện các triệu chứng của bệnh đốm trắng và có hiện tượng vết thương lành lại (Hình 2). Đối với các mẫu được gây nhiễm với nấm vào vết thương, vết nhiễm lan rộng, chuyển sang màu xám đen, vùng xung quanh mô có màu vàng (biểu hiện hoại tử) và lan rộng ra các vùng lân cận theo thời gian tương tự như triệu chứng được mô tả bởi Mohd và cộng sự8. Các kết quả thu được cũng tương tự trên cây Thanh long in vivo (Hình 3). Hai dòng nấmNdBT và NdGV có khả năng gây bệnh trở lại trên cànhThanh long in vivo với các triệu chứng giống với mẫu Thanh long in vitro. Ngoài ra, sau 9 ngày gây nhiễm, trên cành Thanh long xuất hiện các đốm trắng tương tự như 287 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(4):286-293 Hình 1: Kết quả phân lập nấm bệnh N. dimidiatum. a và b: mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng ở Hàm Thuận Nam và Gò Vấp; c và d: sợi nấm bệnh phát triển xung quanh mẫu bệnh trên môi trường thạch nước (mũi tênmàu đen); e và f: khuẩn lạc nấmbệnh NdBT và NdGV trênmôi trường PGA sau 3 ngày nuôi cấy; g và h: hình thái khuẩn ty nấm bệnh NdBT và NdGV dưới kính hiển vi quang học (X40, mũi tên màu đỏ chỉ vị trí phân nhánh, mũi tên nét đứt chỉ vị trí vách ngăn); thanh ngang = 1 cm. Hình 2: Triệu chứng bệnh do dòng nấm NdBT (trái) và NdGV (phải) gây ra trên mô Thanh long in vitro. (a), (b) và (c): Sau 3, 6 và 9 ngày gây nhiễm; Đối chứng sau 9 ngày tạo vết thương và không gây nhiễm. mẫu được dùng để phân lập ban đầu. Dựa vào nguồn gốc mẫu phân lập, các đặc điểm hình thái và kiểm tra bệnh học đã cho thấy hai dòng nấm thu được là hai chủng thuộc loài N. dimidiatum. Kết quả giải trình tự các đoạn gen ITS1 và ITS4 của hai chủng NdBT và NdGV này có độ tương đồng cao so với trình tự các đoạn gen tương ứng của N. dimidiatum đã được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen NCBI. Điều này giúp một lần nữa khẳng định hai chủng nấm bệnh NdBT và NdGV thuộc loài N. dimidiatum và không mất khả năng gây bệnh sau phân lập. Sàng lọc chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với các chủng nấmbệnh in vitro Sàng lọc chủng vi sinh có khả năng đối kháng với hai chủng nấm bệnh Hình 3: Triệu chứng do nấm NdBT (trên, trái) và NdGV (trên, phải) gây ra trên Thanh long in vivo. Mẫu đối chứng (dưới) chỉ tạo vết thương và không gây nhiễm; (a), (b) và (c): Sau 3, 6 và 9 ngày gây nhiễm. Trong số 20 chủng Streptomyces spp. chỉ có bốn chủng Streptomyces sp. 9.0.1, 9.0.6, 9.0.9 và 9.0.16 có hiệu quả đối kháng với hai chủng NdBT và NdGV (Hình 4). Trong khi đó, có đến 14 và 15 chủng trong số 20 chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng tương ứng với chủng nấm bệnh NdGV và NdBT. Với Trichoderma spp., tất cả 20 chủng được khảo sát đều có khả năng đối kháng với cả 2 chủng nấm bệnh. Trong số các chủng có khả năng đối kháng với nấm bệnh, hai chủng Streptomyces sp. (gồm 9.0.1 và 9.0.9), ba chủng Bacillus sp. (gồm 5.3.44, 5.3.54 và 5.3.68) và năm chủng Trichoderma sp. (gồm 8.3.5, 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19 và 8.3.20) (Hình 5) cho hiệu quả đối kháng tốt với cả hai chủng nấmNdBTvàNdGV (theomức phân hạng của Nwankiti và Gwa12 được chọn lọc để tiếp tục nghiên cứu. Tiềm năng ứng dụng các chủng vi sinh vật đối kháng kiểm soát nấm bệnhN. Dimidita- tum trên Thanh long Hiệu quả đối kháng của các chủng vi sinh vật chọn lọc với hai chủng nấm bệnh trên môi trường thạch Thanh long Trên môi trường trường thạchThanh long, các chủng Bacillus sp. và Streptomyces sp. được chọn lọc đã mất khả năng đối kháng với hai chủng nấm bệnh NdBT và NdGV (Hình 6). Ngược lại, trên môi trường này, các chủng Trichoderma sp. chọn lọc vẫn thể hiện được khả năng đối kháng với hai chủng nấm bệnh (Hình 7 và 8). Ngoại trừ chủng Trichoderma sp. 8.3.5 có hiệu quả đối kháng tăng lên trên môi trường thạch Thanh long so với môi trường thạch khoai tây, hiệu quả đối kháng của bốn chủng Trichoderma sp. chọn 288 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(4):286-293 Hình 4: Hiệu quả đối kháng của các chủng Strep- tomyces spp., Bacillus spp. và Trichoderma spp. đối với NdBT (trái) và NdGV (phải) trên môi trường PGA sau 3 ngày nuôi cấy. Hình5: KhảnăngđốikhángcủacácchủngTricho- derma sp. có hiệu quả đối kháng cao với chủng nấm N. dimidiatum NdBT trên môi trường PGA sau 3 ngày nuôi cấy. lọc còn lại đều có xu hướng giảm từ mức tốt trên môi trường thạch khoai tây xuống mức trung bình trên môi trường thạchThanh long (Bảng 1). Hình 6: Hiện tượng mất hoạt tính đối kháng chủng Bacillus sp. 5.3.44 (trái) và Streptomyces sp. 9.0.9 (phải) với nấm bệnh NdBT trên môi trường thạch Thanh long. Khả năng tương thích của các chủng Trichoderma sp. chọn lọc Bốn trong năm chủng Trichoderma sp. được chọn lọc khi được nuôi cấy đồng thời có khả năng tương thích với nhau một phần hay hoàn toàn, ngoại trừ các tổ hợp từ chủng 8.3.5 (gồm các tổ hợp các chủng 8.3.5 – 8.3.7, 8.3.5 – 8.3.14, 8.3.5 – 8.3.19 và 8.3.5 – 8.3.20) có hiện tượng ức chế từ xa (Bảng 2 Hình 9). Hình 7: Hiệu quả đối kháng của năm chủng Tri- choderma sp. được chọn lọcđối vớiNdBT (trái) và NdGV (phải) trên môi trường thạch Thanh long sau 3 ngày cấy. Hình 8: Khả năng đối kháng của năm chủng Tri- choderma chọn lọcvớinấmbệnhtrênmôi trường thạch Thanh long sau 3 ngày nuôi cấy. Bảng 1: So sánh hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma sp. được chọn lọc trênmôi trường PGA vàmôi trường thạch Thanh long Chủng Trichoderma sp. H (%) trên môi trường PGA H (%) trên môi trường MTTL 8.3.5 63,02b 69,44a 8.3.7 62,59a 52,72b 8.3.14 59,94a 53,30b 8.3.19 62,28a 54,94b 8.3.20 61,36a 52,47b Trong cùng một dòng, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa p = 0,05. PGA : thạch khoai tây ; MTTL: thạchThanh long. Hình 9: Khả năng tương thích của một số tổ hợp chủng Trichoderma sp. (a) Mặt trước (trái) và mặt sau (phải) của tổ hợp chủng Trichoderma sp. 8.3.7 và 8.3.19 tương thích một phần; (b) Mặt trước (trái) và mặt sau (phải) của tổ hợp chủng Trichoderma sp. 8.3.19 và 8.3.20 tương thích toàn phần; (c) Mặt trước (trái) và mặt sau (phải) của tổ hợp chủng Tri- choderma sp. 8.3.5 và 8.3.20 ức chế từ xa. 289 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(4):286-293 Bảng 2: Khả năng tương thíchcủa các chủng Trichoderma sp. được chọn lọc Chủng Trichoderma sp. 8.3.5 8.3.7 8.3.14 8.3.19 8.3.20 8.3.5 + + − – − – − – − – 8.3.7 − – + + + + + + + 8.3.14 − – + + + + + + 8.3.19 − – + + + + + + 8.3.20 − – + + + + + Quy ước ức chế theo Ilham và cộng sự (2013) 8 : ++: tương thích hoàn toàn; +: tương thích không hoàn toàn; − – − : thay thế; − – : ức chế từ xa; − : ức chế tại nơi tiếp xúc. THẢO LUẬN Mặc dù bệnh đốm trắng doN. dimidiatum trênThanh long đã xuất hiện từ nhiều năm qua ở nhiều nước trên thế giới như Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan..., tuy nhiên, cho đến nay, chỉ có một số lượng ít các nghiên cứu phân lập và nhận diện tác nhân gây bệnh này như báo cáo của Mohd và cộng sự 8, Thongkham, Soytong2, Yi và cộng sự1. Trong nghiên cứu này, 2 chủng nấm N. dimidiatum NdBT và NdGV đã được phân lập từ các mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng thu được từ Hàm Thuận Nam và Gò Vấp và nhận diện dựa trên trình tự gen ITS1 và ITS4. Cả 2 chủng nấm này đều có hình thái tương tự như mô tả của Thongkhamvà Soytong, Yi và cộng sự 1,2, có khả năng gây bệnh trên cànhThanh long in vitro và in vivo với các triệu chứng tương tự như báo cáo của Mohd và cộng sự8. Việc phân lập được N. dimidiatum đã giúp chủ động nguồn nấm cho các nghiên cứu các biện pháp kiểm soát bệnh do chúng gây ra. Trước đây, các nghiên cứu của Luis và cộng sự 5, Lu- ong và cộng sự6, Wan và cộng sự4 đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của Bacillus, Trichoderma và Strepto- myces trong kiểm soát nấm bệnh N. dimidiatum in vitro. Trong nghiên cứu này, 20 chủng Trichoderma spp., 20 chủng Bacillus spp. và 20 chủng Strepto- myces spp. đã được khảo sát hiệu quả đối kháng in vitro với hai chủng nấm bệnh N. dimidiatum NbBT và NdGV. Tuy nhiên, kết quả cho thấy chỉ có 20% chủng thuộc chi Streptomyces có khả năng đối kháng. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng đối kháng là 75%, cao hơn nhiều so với Strep- tomyces. Trong khi đó, tất cả 20 chủng (100%) thuộc chi Trichoderma đều có khả năng đối kháng. Hiệu quả đối kháng trung bình của Trichoderma spp. cao hơn so với Bacillus spp. và Streptomyces spp (tương ứng là 56,8 %, 55,3% và 54,3%). Sự khác nhau trong khả năng đối kháng giữa các chủng vi sinh vật không cùng một chi và giữa các chủng trong cùng một chi được cho là do khả năng tiết ra các loại kháng sinh, các enzyme thủy phân vách nấm bệnh và khả năng tăng trưởng để cạnh tranh không gian sống và cạnh tranh dinh dưỡng khác nhau giữa các chủng13. Kết quả này cho thấy ngoài khả năng tiết ra các hợp chất kháng sinh hay các enzyme như Bacillus và Streptomyces, các chủng Trichoderma còn có ưu thế phát triển hệ sợi nhanh giúp chúng tăng cường hiệu quả ức chế các nấm bệnh nhờ vào khả năng cạnh tranh không gian sống và dinh dưỡng. Ngoài ra, sự tiếp xúc trực tiếp của hệ sợi cũng có lẽ đã giúp Trichoderma tăng cường khả năng đối kháng thông qua khả năng ký sinh vào hệ sợi nấm N. dimidiatum12. Tiềm năng ứng dụng vào thực tế được nghiên cứu bằng cách nuôi cấy kép các chủng có hiệu quả đối kháng cao với nấm bệnh trên môi trường thạch chứa nước chiết từ cànhThanh long. Trên môi trường này, các chủng vi sinh vật chọn lọc và nấm bệnh vẫn phát triển, tuy nhiên, kết quả quan sát cho thấy Tricho- derma và nấm bệnh có hệ khuẩn ty với các sợi rất mãnh và mọc sát mặt thạch. Điều này có thể do trong nước chiết Thanh long có thành phần dinh dưỡng thấp hơn so với nước chiết khoai tây đã làm hạn chế sự tăng trưởng của các chủng vi sinh vật nói chung. Ngoài ra, có thể trong nước chiếtThanh long cũng có chứa hợp chất gây ức chế sự phát triển cảTrichoderma và hai chủng nấm bệnh NdBT và NdGV. Đáng chú ý hơn, khi được nuôi cấy trên môi trường thạch nước chiếtThanh long, khả năng đối kháng với nấm bệnh của các chủng Bacillus sp. và Streptomyces sp. chọn lọc bị mất hoàn toàn trong khi hiệu quả đối kháng của các chủng Trichoderma sp. không thay đổi đáng kể. Khả năng đối kháng nấm bệnh của Bacillus và Streptomyces chủ yếu dựa trên khả năng sinh kháng sinh5,6. Hiện tượng mất khả năng đối kháng có thể là do các chủng Bacillus sp. và Streptomyces sp. bị mất khả năng tiết kháng sinh khi được nuôi cấy trên môi trường thạch nước chiếtThanh long. Trong khi đó, do có sự tiếp xúc trực tiếp của hệ sợi, các chủng Tricho- derma sp. có thể đã ký sinh trên nấm bệnh 12. Khả 290 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(4):286-293 năng ký sinh trên nấm bệnh của Trichoderma nhờ chúng tiết các enzyme có khả năng phân hủy vách tế bào4 để sử dụng các chất dinh dưỡng bên trong nấm bệnh, qua đó đã giữ được khả năng đối kháng của chúng với nấm bệnh. Các kết quả đã cho thấy 5 chủng Trichoderma được chọn lọc có tiềmnăng ứng dụng vào thực tế hơn so với các chủng Bacillus và Streptomyces được nghiên cứu. Tuy nhiên, các kết quả khảo sát khả năng tương thích cho thấy chủngTrichoderma sp. 8.3.5 là chủng có hiệu quả đối kháng cao nhất lại không có khả năng tương thích với các chủng còn lại. Điều này là phù hợp vì chủng 8.3.5 có hoạt tính đối kháng mạnh nhất (trong đó có khả năng chủng 8.3.5 đã tổng hợp những hợp chất kháng sinhmạnhhơn) nêndẫnđếnức chế những chủng còn lại. Tuy nhiên, khó có thể xác định chính xác tương thích giữa các loài nếu chỉ dựa vào biểu hiện bên ngoài khuẩn lạc. Vì các chủngTrichoderma sp. có những đặc điểm hình thái gần giống nhau như màu sắc, hình dạng khuẩn ty và bào tử... Do đó, các đánh giá ở mức tương thích hoàn toàn và tương thích một phần chỉ mang tính chất tương đối và cần nghiên cứu sâu hơn. KẾT LUẬN Đã phân lập được hai chủng nấm N. dimidiatum NdBT và NdGV từ mẫu Thanh long bị bệnh đốm trắng ở Hàm Thuận Nam (Bình Thuận) và Gò Vấp (Thành phố Hồ Chí Minh). Tỷ lệ chủng có khả năng đối kháng với N. dimidiatum trong số 20 chủng Tri- choderma spp., 20 chủng Bacillus spp. và 20 chủng Streptomyces spp. được khảo sát tương ứng 100%, 75% và 20%. Trichoderma spp. có hiệu quá đối kháng trung bình cao nhất, lần lượt đến Bacillus spp. và Streptomyces spp. Các kết quả thực nghiệm đã cho thấy năm chủng Trichoderma sp. (gồm 8.3.5, 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19 và 8.3.20) có khả năng đối kháng tốt với hai chủng nấm N. dimidiatum NdBT và NdGV (hơn 60%). Đặc biệt, cả năm chủng chọn lọc vẫn giữ được hoạt tính đối kháng trênmôi trường thạch nước chiếtThanh long đã cho thấy tiềm năng ứng dụng các chủng này để kiểm soát bệnh đốm trắng do nấm N. dimidiatum trên cây Thanh long ngoài đồng ruộng. Ngoài ra, khả năng tương thích giữa các chủngTricho- derma sp. 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19 và 8.3.20 cũng cho thấy tiềm năng được sử dụng phối hợp với nhau để tăng cường khả năng kiểm soát bệnh do nấm N. dimidia- tum. DANHMỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CT : Môi trường thạch cao - thịt pepton ITS : Internal Transcribed Spacer MTTL : Môi trường thạch nước chiết Thanh long NdBT : Chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum NdBT NdGV : Chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum NdGV PGA : Môi trường thạch nước chiết khoai tây XUNGĐỘT LỢI ÍCH Bài báo được dựa trên các kết quả nghiên cứu thực nghiệm hoàn toàn trung thực và được nhóm tác giả thống nhất đồng ý công bố mà không có bất kỳ tác động xung đột lợi ích nào. ĐÓNGGÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ Nguyễn Như Nhứt: tư vấn, thực nghiệm và thu thập số liệu, tổng hợp số liệu; viết, trình bài và chỉnh sửa bài báo Nguyễn Thị Ngọc Bích, Nguyễn Thanh Trường: thực nghiệm và thu thập số liệu VõThị Xuyến : tư vấn TÀI LIỆU THAMKHẢO 1. Yi RH, Lin QL, Mo J, Wu F, Chen J. Fruit internal brown rot caused by Neoscytalidium dimidiatum on pitahaya in Guang- dong province China. Australasian Plant Disease Notes. 2015;10(13):1–4. 2. Thongkham D, Soytong K. Isolation, identification, and pathogenicity test from Neoscytalidium dimidiatum causing stem canker of dragon fruit. International Journal of Agricul- tural Technology. 2016;12(7.2):2187–2190. 3. Bakhshizadeh M, Hashemian HR, Najafzadeh MJ, Dolatabadi S, Zarrinfar H. First report of rhinosinusitis caused by Neoscy- talidium dimidiatum in Iran. Journal of Medical Microbiology. 2014;63:1017–1019. 4. Wan Z, Wan R, Shah M, Kalsom U, Mohd P, Hun G. Identifica- tion of Trichoderma harzianum T3.13 and its interaction with NeoscytalidiumdimidiatumU1, a pathogenic fungus isolated from dragon fruit (Hylocereus polyrhizus) in Malaysia. Inter- national Journal of Agriculture and Environmental Research. 2017;3(3):3205–3228. 5. Luis G, Tomas RG, Mirella RB, Csar J, Francisco H, Roberto G. Antagonistic potential of bacteria and marine yeasts for the control of phytopathogenic fungi. Revista Mexicana de Cien- cias Agrícolas. 2018;20:4311–4321. 6. Luong HT, Nguyen K, Vu TN, Ha TT, Tong HV, Hua TS, et al. Study on the possibility of usingmicroorganisms as biological agents to control fungal pathogens Neoscytalidium dimidia- tum causing disease of brown spots on the dragon fruit. Jour- nal of Vietnamese Environment. 2016;8(1):41–44. 7. Masratul HM, Baharuddin S, Latiffah Z. Identification and molecular characterizations of Neoscytalidium dimidia- tum causing stem canker of red-fleshed dragon fruit (Hylo- cereus polyrhizus) in Malaysia. Journal of Phytopathology. 2013;161:841–849. 8. Mohd MH, Salleh B, Zakaria L. Identification and molec- ular characterizations of Neoscytalidium dimidiatum causing stem canker of red-fleshed dragon fruit (Hylo- cereus polyrhizus) in Malaysia. Journal of Phytopathology. 2014;161:841–849. 9. Le BF, Vaillant F, Pitahaya IE. Pitahaya (Hylocereus spp.): A new fruit crop, a market with a future. Fruits. 2006;61:237–250. 10. IlhamM, Amer MS, AssawahM, Draz SM. Vegetative compati- bility and strain improvement of some Egyptian Trichoderma isolates. Life Science Journal. 2013;10(3):187–197. 291 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 3(4):286-293 11. Andhare AP, Subramanian B. Compatibility of Azospirillum brasilense and Pseudomonas fluorescens in growth promo- tion of groundnut (Arachis hypogea L.). Anais da Academia Brasileira de Ciências. 2017;89(2):1027–1040. 12. Nwankiti AO, Gwa VI. Evaluation of antagonistic effect of Trichoderma harzianum against Fusarium oxysporum causal agent of white yam (Dioscorearotundata poir) tuber rot. Trends in Technical & Scientific Research. 2018;1(1):001–007. 13. Lân DN, Nguyễn QD, Pham TV. Vi sinh vật học. NXB Giáo dục Việt Nam; 2010. 292 Science & Technology Development Journal – Natural Sciences, 3(4):286-293 Open Access Full Text Article Research Article 1Giatuong Company Ltd. 2Van Lang University Correspondence Nguyen Nhu Nhut, Giatuong Company Ltd. Email: nhunhutnguyen@yahoo.co.uk History  Received: 04-12-2018  Accepted: 7-10-2019  Published: 31-12-2019 DOI : 0.32508/stdjns.v3i4.585 Copyright © VNU-HCM Press. This is an open- access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license. Isolate Neoscytalidium dimidiatum fungal pathogens from pytaya (Hylocereus undatus) and research controlling bymicroorganisms Nguyen Nhu Nhut1,*, Nguyen Thi Ngoc Bich1, Nguyen Thanh Truong1, Vo Thi Xuyen2 Use your smartphone to scan this QR code and download this article ABSTRACT In recent years, Neoscytalidiumdimidiatum has caused severe white spot disease in Pytaya, while no effective controls have been taken. In this study, two strains of N. dimidiatum NdGV and NdBT were obtained by isolation on water agar medium containing streptomycin, morphological tests, in vitro and in vivo pathogenical tests, and molecular biology tests by sequencing the genes ITS1 and ITS4. By using dual culture technique on potato-glucose agar medium, 100% of Trichoderma spp., 75% of Bacillus spp. and 20% of Streptomyces spp. were able to antagonize N. dimidiatum. The mean antagonistic effect with N. dimidiatum of Trichoderma spp. was higher than Bacillus spp. and the lowest was Streptomyces spp. 56.8%, 55.3% and 54.3% respectively. Especially 5 strains Trichoderma sp. 8.3.5, 8.3.7, 8.3.14, 8.3.19, and 8.3.20 had antagonistic effects of over 60%. The application poten- tial of the 5 selected Trichoderma strains to control N. dimidiatum disease was further strengthened when their antagonistic effect was relatively stable on Pitaya juice agar medium while all Bacillus sp. and Streptomyces sp. were lost the ability to antagonize. It was noteworthy that four of the five strains of Trichoderma sp. were highly compatible, suggesting further studies are needed to apply their combined potency in enhancing the control of N. dimidiatumNdBT and NdGV on Pitaya. Key words: Bacillus, Neoscytalidium dimidiatum, Pitaya, Streptomyces, Trichoderma Cite this article : Nhu Nhut N, Thi Ngoc Bich N, Thanh Truong N, Thi Xuyen V. Isolate Neoscytalidium dimidiatum fungal pathogens from pytaya (Hylocereus undatus) and research controlling by mi- croorganisms. Sci. Tech. Dev. J. - Nat. Sci.; 3(4):286-293. 293