Early Mortality Syndrome (EMS) also named Acute Hepatopancreatic Necrosis
Disease (AHPND) should be considered as a dangerous shrimp disease that has affected
shrimp farms in Southeast Asia. It was detected in shrimp farms in southern China as first
record in 2009 and afterward in Vietnam, Thailand and Malaysia. Lactic acid bacteria and
Bacillus isolated from some samples of various fermented vegetables, seafood
gastrointestinal tract and pond water were supposed to have capability to antagonize Vibrio
parahaemolyticus causing the EMS. 47 strains of lactic acid bacteria and 133 strains of
Bacillus were isolated and tested for antibacterial assays with the broth-dilution method and
the agar well diffusion method. The results showed that 11 out of 180 strains could inhibit
the Vibrio. The Bacillus sp. BV1 strain showed the highest antibacterial activity
(antibacterial activity of 85.6%, bacteriocin activity of 4222.820 AU/mL). This strain was
selected for the antagonistic experiment to Vibrio parahaemolyticus on white leg shrimp.
Survival rates were significantly improved to 85% and 90% (for the treatment with 104 and
106 CFU/mL of Bacillus sp. BV1, respectively), which were much higher than untreated
control after 9 days of challenge.
11 trang |
Chia sẻ: huongthu9 | Lượt xem: 463 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Tạp chí Khoa học công nghệ và Thực phẩm 15 (1) (2018) 46-56
46
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN
KHÁNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
GÂY BỆNH TRÊN TÔM
Phạm Minh Tuấn*, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM
*Email: pmtuan@cntp.edu.vn
Ngày nhận bài: 16/6/2017; Ngày chấp nhận đăng: 18/5/2018
TÓM TẮT
Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) hay hoại tử gan tụy cấp (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) được xem là một bệnh nguy hiểm trên tôm đã
ảnh hưởng đến nhiều trang trại nuôi tôm trong khu vực Đông Nam Á. Nó được phát hiện ở
miền nam Trung Quốc, lần đầu tiên được báo cáo vào năm 2009 và sau đó ở các nước khác
như Việt Nam, Thái Lan và Malaysia. Việc phân lập vi khuẩn lactic và Bacillus từ các nguồn
mẫu rau cải muối chua, ruột động vật thủy sản và mẫu nước thu từ tự nhiên được đánh giá có
khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. Khi khảo sát khả năng
đối kháng của 47 chủng vi khuẩn lactic và 133 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp
pha loãng canh trường và khuếch tán trên đĩa thạch, kết quả phân lập và sàng lọc thu được
11/180 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Chủng Bacillus sp. BV1 với khả năng đối
kháng mạnh nhất (tỷ lệ kháng 85,6%, hoạt tính bacteriocin là 4222,820 AU/mL) được tuyển
chọn vào thử nghiệm xác định khả năng đối kháng trên tôm thẻ chân trắng. Tỷ lệ sống sót
của tôm ở nghiệm thức bổ sung Bacillus sp. BV1 với mật độ 104 và 106 CFU/mL lần lượt đạt
85% và 90% so với nghiệm thức đối chứng trong 9 ngày thử nghiệm.
Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Bacillus, bacteriocin, Vibrio parahaemolyticus, EMS/AHPND
1. MỞ ĐẦU
Mỗi năm ngành công nghiệp tôm tổn thất hơn 1 tỷ USD do ảnh hưởng của Hội chứng
hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND) ở tôm, một bệnh mới xuất hiện bị gây ra chủ yếu bởi vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus [1]. Ở Việt Nam, dịch bệnh này đã được phát hiện từ năm
2010, nhưng thiệt hại lớn do EMS chỉ được báo cáo kể từ tháng 3 năm 2011 ở Đồng bằng
sông Cửu Long. Nó ảnh hưởng đến khu vực sản xuất tôm của nhiều tỉnh trong vùng như Sóc
Trăng, Bạc Liêu và Trà Vinh, với diện tích thiệt hại ước tính khoảng 40.000 ha [2].
Việc điều trị bằng kháng sinh và hóa chất có thể tiêu diệt phần lớn các vi khuẩn có lợi trong
nước ao nuôi tôm, chứ không chỉ các vi khuẩn gây bệnh. Bên cạnh đó, dư lượng kháng sinh và
hóa chất còn lại gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe người sử dụng [1]. Trong
nuôi trồng thủy sản, việc sử dụng các chủng vi khuẩn lactic và Bacillus spp. có khả năng tạo
ra kháng sinh sinh học (bacteriocin - một loại protein do vi sinh vật sinh ra dùng để ức chế
các vi sinh vật khác) được đánh giá là một giải pháp mới, có thể ứng dụng để kiểm soát các
bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra [3-5]. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu phân lập,
tuyển chọn, đánh giá khả năng kiểm soát của các chủng vi sinh vật đối với vi khuẩn gây bệnh
trên tôm [3, 6-9]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về đối kháng đối tượng gây bệnh chết
sớm trêm tôm theo cơ chế tạo ra bacteriocin. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này được thực hiện
nhằm phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin ức chế Vibrio
Tạp chí Khoa học công nghệ và Thực phẩm 15 (1) (2018) 46-56
46
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN
KHÁNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
GÂY BỆNH TRÊN TÔM
Phạm Minh Tuấn*, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM
*Email: pmtuan@cntp.edu.vn
Ngày nhận bài: 16/6/2017; Ngày chấp nhận đăng: 18/5/2018
TÓM TẮT
Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) hay hoại tử gan tụy cấp (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) được xem là một bệnh nguy hiểm trên tôm đã
ảnh hưởng đến nhiều trang trại nuôi tôm trong khu vực Đông Nam Á. Nó được phát hiện ở
miền nam Trung Quốc, lần đầu tiên được báo cáo vào năm 2009 và sau đó ở các nước khác
như Việt Nam, Thái Lan và Malaysia. Việc phân lập vi khuẩn lactic và Bacillus từ các nguồn
mẫu rau cải muối chua, ruột động vật thủy sản và mẫu nước thu từ tự nhiên được đánh giá có
khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. Khi khảo sát khả năng
đối kháng của 47 chủng vi khuẩn lactic và 133 chủng vi khuẩn Bacillus bằng phương pháp
pha loãng canh trường và khuếch tán trên đĩa thạch, kết quả phân lập và sàng lọc thu được
11/180 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Chủng Bacillus sp. BV1 với khả năng đối
kháng mạnh nhất (tỷ lệ kháng 85,6%, hoạt tính bacteriocin là 4222,820 AU/mL) được tuyển
chọn vào thử nghiệm xác định khả năng đối kháng trên tôm thẻ chân trắng. Tỷ lệ sống sót
của tôm ở nghiệm thức bổ sung Bacillus sp. BV1 với mật độ 104 và 106 CFU/mL lần lượt đạt
85% và 90% so với nghiệm thức đối chứng trong 9 ngày thử nghiệm.
Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Bacillus, bacteriocin, Vibrio parahaemolyticus, EMS/AHPND
1. MỞ ĐẦU
Mỗi năm ngành công nghiệp tôm tổn thất hơn 1 tỷ USD do ảnh hưởng của Hội chứng
hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND) ở tôm, một bệnh mới xuất hiện bị gây ra chủ yếu bởi vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus [1]. Ở Việt Nam, dịch bệnh này đã được phát hiện từ năm
2010, nhưng thiệt hại lớn do EMS chỉ được báo cáo kể từ tháng 3 năm 2011 ở Đồng bằng
sông Cửu Long. Nó ảnh hưởng đến khu vực sản xuất tôm của nhiều tỉnh trong vùng như Sóc
Trăng, Bạc Liêu và Trà Vinh, với diện tích thiệt hại ước tính khoảng 40.000 ha [2].
Việc điều trị bằng kháng sinh và hóa chất có thể tiêu diệt phần lớn các vi khuẩn có lợi trong
nước ao nuôi tôm, chứ không chỉ các vi khuẩn gây bệnh. Bên cạnh đó, dư lượng kháng sinh và
hóa chất còn lại gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe người sử dụng [1]. Trong
nuôi trồng thủy sản, việc sử dụng các chủng vi khuẩn lactic và Bacillus spp. có khả năng tạo
ra kháng sinh sinh học (bacteriocin - một loại protein do vi sinh vật sinh ra dùng để ức chế
các vi sinh vật khác) được đánh giá là một giải pháp mới, có thể ứng dụng để kiểm soát các
bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra [3-5]. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu phân lập,
tuyển chọn, đánh giá khả năng kiểm soát của các chủng vi sinh vật đối với vi khuẩn gây bệnh
trên tôm [3, 6-9]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về đối kháng đối tượng gây bệnh chết
sớm trêm tôm theo cơ chế tạo ra bacteriocin. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này được thực hiện
nhằm phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin ức chế Vibrio
Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus
47
parahaemolyticus, hướng tới sản xuất chế phẩm sinh học phòng và trị bệnh EMS cho tôm,
góp phần xây dựng ngành nuôi trồng thủy sản bền vững.
2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus được phân lập từ các sản phẩm rau cải
muối chua, ruột thủy sản và mẫu nước thu từ tự nhiên.
Các chủng đã được định danh gồm 6 chủng vi khuẩn lactic và 68 chủng vi khuẩn
Bacillus spp. được cung cấp bởi công ty cổ phần Công nghệ sinh học Tiên Phong (Lô 23
đường Tân Tạo, KCN Tân Tạo, Q.Bình Tân, Tp.HCM).
Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 strain O3:K6 phân lập từ tôm
bệnh AHPND đã được định danh và xác định có độc tính, cung cấp từ công ty cổ phần Công
nghệ sinh học Tiên Phong.
2.2. Phân lập vi khuẩn lactic và Bacillus
Từ các nguồn mẫu đã chọn, tiến hành đồng nhất mẫu (1 g hoặc 1 mL mẫu + 10 mL
nước muối sinh lý 0,9%) và pha loãng thập phân đến nồng độ 10-9 bằng nước muối sinh lý
0,9%. Hút 0,1 mL dịch mẫu ở nồng độ 10-7, 10-8, 10-9 hoặc 0,1 mL nước (sông, ao nuôi) ở
nồng độ 10-2, 10-3, 10-4 cho vào đĩa petri chứa sẵn môi trường De Man Rogosa and Sharpe
Agar (MRSA) đối với vi khuẩn lactic và môi trường Nutrient Agar (NA) đối với vi khuẩn
Bacillus [10, 11]. Ủ trong tủ ấm ở 37 ºC trong 48 giờ đối với vi khuẩn lactic và 24 giờ đối
với vi khuẩn Bacillus. Mỗi nồng độ pha loãng tiến hành lặp lại 3 lần. Kiểm tra hình thái
khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus [12, 13].
Sau khi kiểm tra hình thái, một số thử nghiệm được thực hiện để xác định sơ bộ các
chủng vi khuẩn lactic và Bacillus như: nhuộm Gram, xác định sự hình thành bào tử, thử
nghiệm catalase, thử nghiệm oxidase, khảo sát khả năng di động, khả năng sinh acid lactic
phân giải CaCO3 [14-18].
2.3. Khảo sát khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus
Tiến hành tăng sinh vi khuẩn lactic trong môi trường MRS trong 48 giờ, tăng sinh
vi khuẩn Bacillus ở môi trường Nutrient Broth (NB) trong 24 giờ. Sau đó ly tâm ở tốc độ
11000 vòng/phút trong 15 phút để tách cặn khuẩn. Dịch sau ly tâm được lọc qua màng lọc
0,2 µm trong điều kiện vô trùng để loại bỏ tế bào còn sót lại [19]. Điều chỉnh pH của dịch vi
khuẩn lactic bằng dung dịch NaOH 1N đến pH 6,5 [10].
Hút 1 mL dịch vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (mật độ khoảng 1010 CFU/mL) cho
vào môi trường NB (có bổ sung 1,5% NaCl), ủ ở nhiệt độ 37 ºC trong 24 giờ để tăng sinh.
2.3.1. Phương pháp pha loãng canh trường (Broth-Dilution Method)
Hút 100 µL dịch sau lọc và trung hòa pH cho vào mỗi ống thử đối kháng, sau đó cho vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus vào ống sao cho mật độ là 107 CFU/mL [20]. Mẫu đối chứng ()
không bổ sung vi khuẩn. Mẫu đối chứng (+) không bổ sung dịch sau lọc và trung hòa pH. Ủ
ở 37 ºC qua đêm rồi quan sát kết quả. Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng cách đo
mật độ quang ở bước sóng 600 nm. Khi tỷ lệ đối kháng lớn hơn hoặc bằng 50% thì được
xem là ức chế tích cực [21]. Tỷ lệ đối kháng được tính theo công thức:
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
Tỷ lệ đối kháng = OD600, ĐC(+) − OD600, ĐK
OD600, ĐC(+)
×100 (%)
Trong đó:
OD600, ĐC(+): mật độ quang ở bước sóng 600 nm của ống đối chứng dương
OD600, ĐK: mật độ quang ở bước sóng 600 nm của ống đối kháng
2.3.2. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Agar Well Diffusion)
Đục lỗ với đường kính 6 mm trên bề mặt đĩa thạch. Hút 0,1 mL canh trường vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus trải đều lên bề mặt thạch NA 1,5% NaCl. Hút 100 µL dịch sau lọc
và trung hòa pH cho vào mỗi lỗ. Ủ đĩa ở 37 ºC qua đêm rồi quan sát kết quả. Khả năng
kháng khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khuẩn. Nếu đường kính vòng
kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6 mm thì được xem là có khả năng ức chế [22].
dkk = D di
Trong đó:
dkk: đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ (mm)
D: đường kính vòng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) (mm)
di: đường kính lỗ (mm)
2.3.3. Xác định hoạt tính bacteriocin
Tiến hành thí nghiệm như phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (mục 2.3.2). Một đơn
vị hoạt tính của bacteriocin (AU) được định nghĩa là 1 đơn vị diện tích của vùng ức chế
2(mm ) mà 1 mL dịch thử nghiệm tạo ra [23]. Công thức tính:
Lz LsAU/mL =
V
Trong đó: Lz: diện tích vòng kháng khuẩn (mm2); Ls: diện tích lỗ (mm2); V: thể tích
mẫu (mL)
2.4. Xác định cơ chế đối kháng
Để xác định bản chất của yếu tố kháng khuẩn do chủng đối kháng sinh ra, canh trường
nuôi cấy của chủng vi khuẩn đối kháng được xử lý như trên: ly tâm và lọc để tách tế bào, trung
hòa pH về 6,5 (mục 2.3). Tiếp theo đó dịch sau lọc và trung hòa pH được xử lý với proteinase
K (Promega, Madison, WI, USA): 5 mL dịch + 1 mL proteinase K ở nồng độ 1 mg/mL, ủ ở
37 ºC trong 2 giờ, sau đó đun nóng ở 100 ºC trong 3 phút để biến tính enzyme [24]. Mẫu được
kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp pha loãng canh trường và khuếch tán trên
đĩa thạch.
2.5. Khả năng đối kháng của vi khuẩn tuyển chọn thử nghiệm trên tôm
Thử nghiệm đối kháng bổ sung Vibrio parahaemolyticus ở mật độ 108 CFU/mL nước nuôi
tôm và chủng vi khuẩn được tuyển chọn (BV1) ở hai mật độ tương ứng 104 và 106 CFU/mL
nước nuôi tôm cho mỗi nghiệm thức [25, 26]. Mẫu đối chứng () không bổ sung vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus. Mẫu đối chứng (+) bổ sung vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mật
8độ 10 CFU/mL nước nuôi tôm.
Tôm khỏe mạnh 12 ngày tuổi được cung cấp bởi công ty cổ phần CNSH Tiên Phong và
các thí nghiệm được tiến hành tại cùng một địa điểm. Khối lượng tôm thí nghiệm dao động
48
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
48
Tỷ lệ đối kháng = OD600, ĐC(+) − OD600, ĐK
OD600, ĐC(+)
×100 (%)
Trong đó:
OD600, ĐC(+): mật độ quang ở bước sóng 600 nm của ống đối chứng dương
OD600, ĐK: mật độ quang ở bước sóng 600 nm của ống đối kháng
2.3.2. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (Agar Well Diffusion)
Đục lỗ với đường kính 6 mm trên bề mặt đĩa thạch. Hút 0,1 mL canh trường vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus trải đều lên bề mặt thạch NA 1,5% NaCl. Hút 100 µL dịch sau lọc
và trung hòa pH cho vào mỗi lỗ. Ủ đĩa ở 37 ºC qua đêm rồi quan sát kết quả. Khả năng
kháng khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khuẩn. Nếu đường kính vòng
kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6 mm thì được xem là có khả năng ức chế [22].
dkk= D di
Trong đó:
dkk: đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ (mm)
D: đường kính vòng ức chế (bao gồm đường kính lỗ) (mm)
di: đường kính lỗ (mm)
2.3.3. Xác định hoạt tính bacteriocin
Tiến hành thí nghiệm như phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (mục 2.3.2). Một đơn
vị hoạt tính của bacteriocin (AU) được định nghĩa là 1 đơn vị diện tích của vùng ức chế
(mm2) mà 1 mL dịch thử nghiệm tạo ra [23]. Công thức tính:
AU/mL = Lz Ls
V
Trong đó: Lz: diện tích vòng kháng khuẩn (mm2); Ls: diện tích lỗ (mm2); V: thể tích
mẫu (mL)
2.4. Xác định cơ chế đối kháng
Để xác định bản chất của yếu tố kháng khuẩn do chủng đối kháng sinh ra, canh trường
nuôi cấy của chủng vi khuẩn đối kháng được xử lý như trên: ly tâm và lọc để tách tế bào, trung
hòa pH về 6,5 (mục 2.3). Tiếp theo đó dịch sau lọc và trung hòa pH được xử lý với proteinase
K (Promega, Madison, WI, USA): 5 mL dịch + 1 mL proteinase K ở nồng độ 1 mg/mL, ủ ở
37 ºC trong 2 giờ, sau đó đun nóng ở 100 ºC trong 3 phút để biến tính enzyme [24]. Mẫu được
kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp pha loãng canh trường và khuếch tán trên
đĩa thạch.
2.5. Khả năng đối kháng của vi khuẩn tuyển chọn thử nghiệm trên tôm
Thử nghiệm đối kháng bổ sung Vibrio parahaemolyticus ở mật độ 108 CFU/mL nước nuôi
tôm và chủng vi khuẩn được tuyển chọn (BV1) ở hai mật độ tương ứng 104 và 106 CFU/mL
nước nuôi tôm cho mỗi nghiệm thức [25, 26]. Mẫu đối chứng () không bổ sung vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus. Mẫu đối chứng (+) bổ sung vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mật
độ 108 CFU/mL nước nuôi tôm.
Tôm khỏe mạnh 12 ngày tuổi được cung cấp bởi công ty cổ phần CNSH Tiên Phong và
các thí nghiệm được tiến hành tại cùng một địa điểm. Khối lượng tôm thí nghiệm dao động
Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus
49
trong khoảng 0,005 – 0,010 g/con, có thể được xem như không có sự sai khác về kích thước
giữa các nhóm tôm. Điều kiện chăm sóc quản lý tôm trong các bể là như nhau trong thời
gian thí nghiệm. Phân bố ngẫu nhiên 160 con trong 8 bể (20 con/bể) chứa 5 lít nước biển có
độ mặn ở khoảng 15‰. Nuôi tôm thích nghi với điều kiện sống 2 ngày trước khi tiến hành
thí nghiệm.
Các thông số hóa lý của nước nuôi tôm được đo bằng bộ kit SERA (NO2 Test Kit–
Germany, NH4/NH3 Test Kit–Germany, kH Test Kit–Germany), sử dụng máy quang phổ so
màu (Spectro-V11D, MRC, Israel) ở bước sóng 548 nm (NO2-), 640 nm (NH4+).
Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần. Kiểm tra 2 ngày/lần trong thời gian thử nghiệm. Theo
dõi các chỉ tiêu môi trường, vi sinh và tỷ lệ sống sót.
Tỷ lệ sống sót = Số lượng lúc sau
Số lượng ban đầu
×100 (%) [27]
2.6. Phân tích thống kê
Các số liệu thu thập được tính toán và thống kê mô tả bằng Microsoft Excel 2010. Số
liệu được so sánh thống kê ANOVA nhiều nhân tố sử dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa
(p < 0,05). Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng Statgraphics Centurion XVI.II.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn lactic và Bacillus
Từ hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn lactic điển hình theo mô tả của Kandler và Weiss như
tròn, trắng, bờ đều đã quan sát đại thể và lựa chọn được 47 chủng từ 9 nguồn mẫu nuôi cấy trên
môi trường MRS [12]. Trong đó, các chủng phân lập từ rau cải muối chua (5/47), từ ruột thủy
sản chiếm nhiều hơn (42/47). Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa cho thấy 41 dòng vi
khuẩn Gram dương, có khả năng sinh acid lactic, catalase (), không di động, pH dịch nuôi
cấy trung bình 3,69-4,52.
Từ hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn Bacillus như rìa nhăn, không đều, nhẵn
bóng hoặc khô mịn, màu từ trắng trong đến vàng nhạt [13]. Quan sát đại thể và tuyển chọn
70 chủng từ 5 nguồn mẫu phân lập trên môi trường NA. Trong đó, các chủng từ sản phẩm
ruột thủy sản (48/70) và các chủng từ mẫu nước thu từ tự nhiên (22/70). Sau khi kiểm tra các
đặc tính sinh hóa, tuyển chọn được 65 chủng vi khuẩn có hình thái giống với Bacillus, là
những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn hoặc dài, có bào tử ngắn hơn tế bào sinh
dưỡng [28].
3.2. Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio parahaemolyticus
Trong 47 chủng vi khuẩn lactic (41 chủng phân lập và 6 chủng được cung cấp từ Công
ty cổ phần CNSH Tiên Phong), qua khảo sát chỉ có 2 chủng SU31 và SU41 thể hiện hoạt
tính kháng đối với Vibrio parahaemolyticus sau 3 lần lặp thí nghiệm bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch và pha loãng canh trường. Cụ thể, chủng vi khuẩn lactic SU31
được phân lập từ ruột tôm sú có tính kháng khuẩn mạnh với tỷ lệ kháng 63,7%, hoạt tính
kháng khuẩn là 2487,090 AU/mL. Đặc tính kháng khuẩn của 2 chủng vi khuẩn có nguồn gốc
từ ruột tôm sú này (SU31 và SU41) được trình bày trong Bảng 1. Vi khuẩn lactic thể hiện
được khả năng đối kháng là do chúng có thể sinh ra các chất có tính kháng khuẩn như acid
lactic, CO2, H2O2, diacetyl và đặc biệt là bacteriocin [29]. Ảnh hưởng của acid lactic đã được
loại bỏ khi các thí nghiệm đối kháng đều được thực hiện với canh trường đã trung hòa pH.
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
50
Vì vậy, để xác định yếu tố kháng khuẩn có phải là bacteriocin hay không, canh trường sau loại
bỏ tế bào và trung hòa pH sẽ được xử lý với enzyme proteinase K trước khi thử đối kháng.
A B
Hình 1. Kết quả đối kháng của một số chủng vi khuẩn phân lập được
(A.Vi khuẩn lactic; B.Vi khuẩn Bacillus) đối với Vibrio parahaemolyticus.
Kiểm tra tính kháng khuẩn với Vibrio parahaemolyticus của 133 chủng vi khuẩn Bacillus
(65 chủng phân lập và 68 chủng đã định danh), có 9 chủng (CARE2, BT32, BSU11, BSU21,
BSU22, BSU51, BSU63, BA21, BV1) thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio parahaemolyticus
sau 3 lần lặp thí nghiệm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và pha loãng canh
trường. Trong đó, BA21 và BV1 có đặc tính kháng khuẩn vượt trội. Khả năng kháng khuẩn
của các chủng được trình bày trong Bảng 2. Chủng vi khuẩn BV1 phân lập từ nước sông có
tính kháng khuẩn mạnh nhất với tỷ lệ kháng 85,6%, hoạt tính bacteriocin là 4222,820 AU/mL.
Bên cạnh đó, chủng BA21 phân lập từ nước ao nuôi tôm cũng thể hiện tỷ lệ kháng cao 77,1%,
7 chủng còn lại biểu hiện tính kháng khuẩn ở mức thấp hơn 34,5– 58,8%.
Bảng 1. Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của vi khuẩn lactic
Tên chủng Nguồn gốc
Đối kháng lỏng
Kết quả đo OD600nm
Đối kháng trên đĩa thạch
Tỷ lệ kháng (%) Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Hoạt tính bacteriocin
(AU/mL)
SU31 Phân lập từ ruột tôm sú 64,29 2,06 12,67 1,50 2487,09 420,72
a
SU41 Phân lập từ ruột tôm sú 46,43 3,57 7,33 0,50 1115,25 70,69
b
a, b: thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Ở nghiên cứu này, những chủng vi khuẩn phân lập từ nước sông và nước ao nuôi tôm
có tính kháng Vibrio parahaemolyticus mạnh hơn các chủng phân lập từ các nguồn khác.
Mẫu nước thu từ tự nhiên là nguồn nước hỗn hợp của nước ngọt và nước mặn. Vì thế, sự
khác biệt lớn về độ mặn được cho rằng các loài vi khuẩn phát triển mạnh trong nguồn nước
đó có thể chịu được sự biến động lớn về độ mặn cũng như sản sinh các hợp chất giúp chống
lại các vi khuẩn khác và thích nghi với môi trường sống. Các kết quả của nghiên cứu về khả
năng kháng khuẩn hiện nay đã chỉ ra rằng, các phân lập từ nguồn mẫu tự nhiên có thể tìm ra
các hợp chất kháng khuẩn đa dạng [30].
Gần đây, những kết quả tương tự đã chứng minh hợp chất thứ cấp sinh ra từ Bacillus
spp. không mất hoạt tính với những thay đổi về độ mặn và nhiệt độ của môi trường [31].
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
50
Vì vậy, để xác định yếu tố kháng khuẩn có phải là bacteriocin hay không, canh trường sau loại
bỏ tế bào và trung hòa pH sẽ được xử lý với enzyme proteinase K trước khi thử đối kháng.
A B
Hình 1. Kết quả đối kháng của một số chủng vi khuẩn phân lập được
(A.Vi khuẩn lactic; B.Vi khuẩn Bacillus) đối với Vibrio parahaemolyticus.
Kiểm tra tính kháng khuẩn với Vibrio parahaemolyticus của 133 chủng vi khuẩn Bacillus
(65 chủng phân lập và 68 chủng đã định danh), có 9 chủng (CARE2, BT32, BSU11, BSU21,
BSU22, BSU51, BSU63, BA21, BV1) thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio parahaemolyticus
sau 3 lần lặp thí nghiệm bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và pha loãng canh
trường. Trong đó, BA21 và BV1 có đặc tính kháng khuẩn vượt trội. Khả năng kháng khuẩn
của các chủng được trình bày trong Bảng 2. Chủng vi khuẩn BV1 phân lập từ nước sông có
tính kháng khuẩn mạnh nhất với tỷ lệ kháng 85,6%, hoạt tính bacteriocin là 4222,820 AU/mL.
Bên cạnh đó, chủng BA21 phân lập từ nước ao nuôi tôm cũng thể hiện tỷ lệ kháng cao 77,1%,
7 chủng còn lại biểu hiện tính kháng khuẩn ở mức thấp hơn 34,5– 58,8%.
Bảng 1. Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của vi khuẩn lactic
Tên chủng Nguồn gốc
Đối kháng lỏng
Kết quả đo OD600nm
Đối kháng trên đĩa thạch
Tỷ lệ kháng (%) Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Hoạt tính bacteriocin
(AU/mL)
SU31 Phân lập từ ruột tôm sú 64,29 2,06 12,67 1,50 2487,09 420,72
a
SU41 Phân lập từ ruột tôm sú 46,43 3,57 7,33 0,50 1115,25 70,69
b
a, b: thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Ở nghiên cứu này, những chủng vi khuẩn phân lập từ nước sông và nước ao nuôi tôm
có tính kháng Vibrio parahaemolyticus mạnh hơn các chủng phân lập từ các nguồn khác.
Mẫu nước thu từ tự nhiên là nguồn nước hỗn hợp của nước ngọt và nước mặn. Vì thế, sự
khác biệt lớn về độ mặn được cho rằng các loài vi khuẩn phát triển mạnh trong nguồn nước
đó có thể chịu được sự biến động lớn về độ mặn cũng như sản sinh các hợp chất giúp chống
lại các vi khuẩn khác và thích nghi với môi trường sống. Các kết quả của nghiên cứu về khả
năng kháng khuẩn hiện nay đã chỉ ra rằng, các phân lập từ nguồn mẫu tự nhiên có thể tìm ra
các hợp chất kháng khuẩn đa dạng [30].
Gần đây, những kết quả tương tự đã chứng minh hợp chất thứ cấp sinh ra từ Bacillus
spp. không mất hoạt tính với những thay đổi về độ mặn và nhiệt độ của môi trường [31].
Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus
51
Nghiên cứu này cũng cho thấy các sản phẩm trao đổi chất của Bacillus pumilus có khả năng
ức chế sự phát triển của Vibrio parahaemolyticus.
Bảng 2. Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của vi khuẩn Bacillus
Tên chủng Nguồn gốc
Đối kháng lỏng
Kết quả đo OD600nm
Đối kháng trên đĩa thạch
Tỷ lệ kháng (%) Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Hoạt tính bacteriocin
(AU/mL)
CARE2 Công ty Tiên Phong 34,64 1,25 6,67 1,20 1000,07 247,72c
BT32 Phân lập từ ruột tôm thẻ 49,05 2,27 7,33 0,33 1115,27 70,69c
BSU11 Phân lập từ ruột tôm sú 58,10 1,04 11,67 0,33 2170,32 91,63bc
BSU21 Phân lập từ ruột tôm sú 52,26 2,37 10,33 0,33 1814,27 86,39bc
BSU22 Phân lập từ ruột tôm sú 49,52 0,66 9,67 0,33 1646,72 81,16bc
BSU51 Phân lập từ ruột tôm sú 33,57 1,64 11,00 0,58 1992,29 154,20bc
BSU63 Phân lập từ ruột tôm sú 53,21 1,76 11,00 0,58 1992,29 154,20bc
BA21 Phân lập từ nước ao tôm 76,78 4,39 14,00 2,65 2968,81 862,12ab
BV1 Phân lập từ nước sông 85,24 0,31 17,67 2,60 4222,82 959,09a
a, b, c: thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05)
Tại những thời điểm khác nhau của quá trình sinh trưởng, vi khuẩn lactic và Bacillus có
thể tiết ra chất kháng khuẩn với hàm lượng khác nhau. Vì vậy, kích thước vòng kháng khuẩn
với V. parahaemolyticus đo được cũng khác nhau khi thu dịch ly tâm ở những thời điểm
khác nhau. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ số chủng có khả năng kháng V. parahaemolyticus với
cơ chế tạo ra hợp chất tương tự bacteriocin là 6,11% (11/180 chủng). Trong số các chủng
kháng Vibrio spp., tỷ lệ xuất hiện chủng Bacillus cao hơn so với vi khuẩn lactic (9/2).
3.3. Xác định cơ chế đối kháng
Sau khi xử lý bằng enzyme proteinase K, dịch lọc của 11 chủng vi khuẩn thử nghiệm
không còn hoạt tính đối kháng với Vibrio parahaemolyticus. Điều này cho thấy yếu tố kháng
khuẩn của các chủng có bản chất là protein. Kết quả này tương đồng với nhiều nghiên cứu
trong những năm gần đây trên các chủng Vibrio mediterranei 1, Enterococcus faecalis,
Pediococcus acidilactici HW01 [32-34]. Các nghiên cứu này đều phát hiện các hợp chất
kháng khuẩn là protein và xác định các hợp chất dạng này là bacteriocin. Trong nghiên cứu
này, 11 chủng vi khuẩn thử nghiệm thể hiện đối kháng với Vibrio parahaemolyticus có thể
theo cơ chế tạo ra các hợp chất tương tự như bacteriocin.
Thời gian gần đây đã có một số nghiên cứu về ứng dụng bacteriocin kiểm soát tác nhân
gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Các bacteriocin sản xuất từ Lactobacillus plantarum 89
và Pediococcus pentosaceus có khả năng ức chế 42-54% vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
gây bệnh trên cá [35]. Trên đối tượng tôm sú (Penaeus monodon), chủng Bacillus subtilis
BT23 tạo ra hợp chất kháng khuẩn, có tác dụng tốt trong việc chống lại sự tăng trưởng của vi
khuẩn gây bệnh Vibrio harveyi, giúp cho tỷ lệ chết của tôm giảm 90% [26]. Bacillus pumilus
B3.10.2B, một chủng có khả năng tạo bacteriocin, khi bổ sung vào thức ăn có khả năng cải
thiện tỷ lệ sống của tôm hùm bông (Panulirus ornatus) cảm nhiễm bởi vi khuẩn gây bệnh
Vibrio owensii [36]. Hai et al. phân lập được 2 chủng thuộc các loài Pseudomonas
aeruginosa và Pseudomonas synxantha có khả năng sinh hợp chất tương tự bacteriocin và ức
chế được 15 loài Vibrio gây bệnh trên tôm (thẻ) gân (Penaeus latisulcatus) từ các chế phẩm
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
52
0
2
4
6
8
10
12
Ngày bắt
đầu cảm
nhiễm
2 4 6 8 Ngày kết
thúc
Lo
g
CF
U
/m
L
Thời gian (ngày)
(-)
(+)
10^4
10^6
sinh học [37]. Sử dụng bacteriocin và vi khuẩn tạo bacteriocin là một giải pháp rất triển vọng
để phòng chống các bệnh trên vật nuôi thủy sản do vi khuẩn gây nên [38].
3.4. Khả năng đối kháng của vi khuẩn tuyển chọn thử nghiệm trên tôm
3.4.1. Chỉ tiêu môi trường
Nước trong các bể thí nghiệm có pH dao động trong khoảng 7,8-8,2, là khoảng phù hợp
cho tôm [39]. Trong thời gian thí nghiệm, hàm lượng nitrite (NO2) tăng từ 0,5 mg/L đến
3,5 mg/L, hàm lượng ammonia (NH3) tăng từ 0,8 mg/L đến 6,0 mg/L. Các yếu tố môi trường
có sự biến động do không thay nước trong thời gian thí nghiệm. Tuy nhiên, điều này ảnh
hưởng không nhiều đến tăng trưởng và sống sót của tôm trong thời gian thí nghiệm. Độ kiềm
ở các nghiệm thức dao động trong khoảng 130-180 mg/L. Chỉ tiêu oxy hòa tan chủ yếu phụ
thuộc vào quá trình sục khí và dao động trong khoảng 4,7-7,2 mg/L.
3.4.2. Chỉ tiêu vi sinh
Sự biến động mật độ vi khuẩn Vibrio spp. trung bình ở các bể đối chứng (+) có khuynh
hướng tăng dần từ 1,3 × 109 CFU/mL đến 3,2 × 1010 CFU/mL trong 9 ngày (Hình 3). Ở bể khảo
sát bổ sung Bacillus sp. BV1 với mật độ 104 CFU/mL, mật độ Vibrio spp. tăng từ 1,2 × 107 CFU/mL
lên 6,8 × 108 CFU/mL trong 6 ngày đầu nhưng sau đó giảm dần còn 2,2 × 107 CFU/mL ở ngày
kết thúc thí nghiệm. Điều này có thể là do mật độ vi khuẩn Bacillus sp. BV1 tăng lên đến
một mức đủ lớn có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
(Hình 2). Ở bể khảo sát bổ sung Bacillus sp. BV1 với mật độ 106 CFU/mL, mật độ
Vibrio spp. giảm từ 4,4 × 106 CFU/mL xuống còn 1,2 × 104 CFU/mL, cho thấy tác dụng ức
chế mạnh mẽ của vi khuẩn Bacillus sp. BV1.
Hình 2. Mật độ vi khuẩn Bacillus sp. BV1 Hình 3. Mật độ vi khuẩn Vibrio spp.
Kết quả này cho thấy có mối liên quan của việc bổ sung vi khuẩn Bacillus sp. BV1 đến
sự giảm mật độ vi khuẩn Vibrio spp. trong các bể thử nghiệm. Điều này phù hợp với kết quả
nghiên cứu của Moriarty: khi sử dụng probiotics chứa một chủng thuộc loài Bacillus subtilis
tỷ lệ sống của tôm sú tăng, hạn chế được mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. trong nước và
bùn đáy ao [40].
3.4.3. Tỷ lệ sống sót của tôm sau 9 ngày thử nghiệm
Tỷ lệ sống của tôm ở những nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn Bacillus sp. BV1 cao hơn
với nghiệm thức đối chứng (Hình 4). Sau 5 ngày đầu thí nghiệm, tỷ lệ sống của tôm không
có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Tuy nhiên, đến ngày thứ 6 thì tỷ lệ sống của tôm ở
nghiệm thức đối chứng (+) giảm xuống còn 85%. Tỷ lệ sống cuối cùng của tôm sau 9 ngày
cảm nhiễm ở nghiệm thức đối chứng (+) là 0%, các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn Bacillus
sp. BV1 với mật độ 104 CFU/mL và 106 CFU/mL có tỷ lệ sống cuối cùng của tôm lần lượt là
85% và 90%.
0
2
4
6
8
10
12
Ngày bắt
đầu cảm
nhiễm
2 4 6 8 Ngày kết
thúc
Lo
g
CF
U
/m
L
Thời gian (ngày)
(-)
(+)
10^4
10^6
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
52
0
2
4
6
8
10
12
Ngày bắt
đầu cảm
nhiễm
2 4 6 8 Ngày kết
thúc
Lo
g
CF
U
/m
L
Thời gian (ngày)
(-)
(+)
10^4
10^6
sinh học [37]. Sử dụng bacteriocin và vi khuẩn tạo bacteriocin là một giải pháp rất triển vọng
để phòng chống các bệnh trên vật nuôi thủy sản do vi khuẩn gây nên [38].
3.4. Khả năng đối kháng của vi khuẩn tuyển chọn thử nghiệm trên tôm
3.4.1. Chỉ tiêu môi trường
Nước trong các bể thí nghiệm có pH dao động trong khoảng 7,8-8,2, là khoảng phù hợp
cho tôm [39]. Trong thời gian thí nghiệm, hàm lượng nitrite (NO2) tăng từ 0,5 mg/L đến
3,5 mg/L, hàm lượng ammonia (NH3) tăng từ 0,8 mg/L đến 6,0 mg/L. Các yếu tố môi trường
có sự biến động do không thay nước trong thời gian thí nghiệm. Tuy nhiên, điều này ảnh
hưởng không nhiều đến tăng trưởng và sống sót của tôm trong thời gian thí nghiệm. Độ kiềm
ở các nghiệm thức dao động trong khoảng 130-180 mg/L. Chỉ tiêu oxy hòa tan chủ yếu phụ
thuộc vào quá trình sục khí và dao động trong khoảng 4,7-7,2 mg/L.
3.4.2. Chỉ tiêu vi sinh
Sự biến động mật độ vi khuẩn Vibrio spp. trung bình ở các bể đối chứng (+) có khuynh
hướng tăng dần từ 1,3 × 109 CFU/mL đến 3,2 × 1010 CFU/mL trong 9 ngày (Hình 3). Ở bể khảo
sát bổ sung Bacillus sp. BV1 với mật độ 104 CFU/mL, mật độ Vibrio spp. tăng từ 1,2 × 107 CFU/mL
lên 6,8 × 108 CFU/mL trong 6 ngày đầu nhưng sau đó giảm dần còn 2,2 × 107 CFU/mL ở ngày
kết thúc thí nghiệm. Điều này có thể là do mật độ vi khuẩn Bacillus sp. BV1 tăng lên đến
một mức đủ lớn có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
(Hình 2). Ở bể khảo sát bổ sung Bacillus sp. BV1 với mật độ 106 CFU/mL, mật độ
Vibrio spp. giảm từ 4,4 × 106 CFU/mL xuống còn 1,2 × 104 CFU/mL, cho thấy tác dụng ức
chế mạnh mẽ của vi khuẩn Bacillus sp. BV1.
Hình 2. Mật độ vi khuẩn Bacillus sp. BV1 Hình 3. Mật độ vi khuẩn Vibrio spp.
Kết quả này cho thấy có mối liên quan của việc bổ sung vi khuẩn Bacillus sp. BV1 đến
sự giảm mật độ vi khuẩn Vibrio spp. trong các bể thử nghiệm. Điều này phù hợp với kết quả
nghiên cứu của Moriarty: khi sử dụng probiotics chứa một chủng thuộc loài Bacillus subtilis
tỷ lệ sống của tôm sú tăng, hạn chế được mầm bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. trong nước và
bùn đáy ao [40].
3.4.3. Tỷ lệ sống sót của tôm sau 9 ngày thử nghiệm
Tỷ lệ sống của tôm ở những nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn Bacillus sp. BV1 cao hơn
với nghiệm thức đối chứng (Hình 4). Sau 5 ngày đầu thí nghiệm, tỷ lệ sống của tôm không
có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Tuy nhiên, đến ngày thứ 6 thì tỷ lệ sống của tôm ở
nghiệm thức đối chứng (+) giảm xuống còn 85%. Tỷ lệ sống cuối cùng của tôm sau 9 ngày
cảm nhiễm ở nghiệm thức đối chứng (+) là 0%, các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn Bacillus
sp. BV1 với mật độ 104 CFU/mL và 106 CFU/mL có tỷ lệ sống cuối cùng của tôm lần lượt là
85% và 90%.
0
2
4
6
8
10
12
Ngày bắt
đầu cảm
nhiễm
2 4 6 8 Ngày kết
thúc
Lo
g
CF
U
/m
L
Thời gian (ngày)
(-)
(+)
10^4
10^6
Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus
53
Hình 4. Tỷ lệ sống sót của tôm sau 9 ngày thử nghiệm
Nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ sống của tôm ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn cao
hơn đối chứng có thể do Bacillus sp. BV1 đã ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây
bệnh chết sớm trên tôm, giúp tăng tỷ lệ sống cho tôm, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi như
giúp cải thiện môi trường sống bằng cách phân hủy hết thức ăn thừa, giúp tôm tiêu hóa tốt,
phân tán khí độc, gia tăng miễn dịch, Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của
Balcazar và Rojas, trong đó Bacillus subtilis UTM 126 có khả năng ức chế ba chủng Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi [11].
4. KẾT LUẬN
Sàng lọc khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của 180 chủng vi
khuẩn, kết quả thu được 2 chủng vi khuẩn lactic (SU31, SU41) và 9 chủng vi khuẩn Bacillus
(CARE2, BT32, BSU11, BSU21, BSU22, BSU51, BSU63, BA21, BV1) thể hiện tính chất
đối kháng thông qua cơ chế sinh hợp chất bacteriocin. Trong đó, chủng vi khuẩn thể hiện
hoạt tính đối kháng tốt nhất là BV1 phân lập từ nước sông (tỷ lệ kháng 85,6%, hoạt tính
bacteriocin 4222,820 AU/mL). Tỷ lệ sống sót của tôm ở nghiệm thức bổ sung Bacillus sp.
BV1 với mật độ 104 CFU/mL đạt 85% so với nghiệm thức đối chứng. Ở nghiệm thức bổ
sung Bacillus sp. BV1 với mật độ 106 CFU/mL tỷ lệ sống sót đạt 90% trong 9 ngày thử
nghiệm. Chủng BV1 thể hiện tiềm năng có thể phát triển thành chế phẩm sinh học dùng để
kiểm soát bệnh EMS/AHPND trên tôm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Newman S. G. - AHPND inferences based on behavior of Vibrio bacteria, The
Global Aquaculture Advocate 16 (6) (2013) 34-36.
2. Lyon A., Mooney A. and Grossel, G. - Using AquaticHealth.net to Detect Emerging
Trends in Aquatic Animal Health, Agriculture 3 (2013) 299-309.
3. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên. - Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio
trong nước nuôi tôm của Bacillus subtilis HY1 và Lactococcus lactic CC4K, Tạp chí
Công nghệ Sinh học 5 (3) (2007) 383-390.
4. Newaj-Fyzul A., Al-Harbi A. H., Austin B. – Review: Developments in the use of
probiotics for disease control in aquaculture, Aquaculture 431 (2014) 1-11.
100 100 100 100 100 100 100 100 100
85
67,5
27,5
0
90 87,5 85 85
90 90
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8 9
T
ỷ
l
ệ
số
n
g
s
ó
t
(%
)
Thời gian (ngày)
ĐC(-)
ĐC(+)
10^4
10^6
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
54
5. Kumar V., Roy S., Meena D. K., Sarkar U. K. - Application of probiotics in shrimp
aquaculture: importance, mechanisms of action, and methods of administration.
Reviews in Fisheries Science & Aquaculture 24 (4) (2016) 342-368.
6. Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Sương Ngọc, Hồ Diễm Thơ. - So sánh khả năng cải
thiện chất lượng nước và ức chế Vibrio của xạ khuẩn Streptomyces parvulus và vi
khuẩn Bacillus subtilis chọn lọc trong hệ thống nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus
vannamei), Tạp chí khoa học Trường đại học Cần Thơ 47 (2016) 87-95.
7. Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định, Phạm Thị Hiếu. - Nghiên cứu
chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây
bệnh trên tôm, Tạp chí khoa học Nông nghiệp Việt nam 14 (11) (2016) 1809-1816.
8. Nguyễn Thị Chính, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Văn Duy. - Tuyển chọn một số chủng
vi khuẩn chịu muối mật, chịu axít và đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây
bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng (Litopanaeus vannamei), Tạp chí Khoa học -
Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang 4 (2016) 35-41.
9. Nguyễn Thị Bích Đào, Trần Quang Khánh Vân, Nguyễn Văn Khanh, Nguyễn Quang
Linh. - Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ức chế vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh tôm chết sớm ở tỉnh Thừa Thiên Huế, Tạp chí khoa học
(Đại học Huế) 100 (1) (2015) 15-28.
10. Mahrous H., Mohamed A., Abd El-Mongy M., El-Batal A. I., Hamza H. A. - Study
bacteriocin production and optimization using new isolates of Lactobacillus spp.
isolated from some dairy products under different culture conditions, Food and
Nutrition Sciences 4 (3) (2013) 342-356.
11. Balcázar J. L., Rojas-Luna T. - Inhibitory activity of probiotic Bacillus subtilis UTM
126 against Vibrio species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp
(Litopenaeus vannamei), Current Microbiology 55 (5) (2007) 409-412.
12. Kandler O., Weiss N. - Genus Lactobacillus Beijerink 1901, 212 AL, In: Bergey’s
manual of systematic bacteriology, vol. 2, Ed. P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E.
Sharpe, and J. G. Holt, Baltimore: Williams and Wilkins (1986) 1209-1234.
13. Gordon R. E., Haynes W. C., Pang C. H. - The genus Bacillus, Agricultural
handbook No. 427, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C. (1973) 4-5.
14. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương. - Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB
Đại học Quốc gia TP.HCM (2006) 45-48.
15. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. - Thí nghiệm vi sinh vật
học, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM (2003) 38-49.
16. Trần Linh Thước. - Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ
phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội (2013) 71-101.
17. Verón, Herná E., Di Risio, H. D., Isla María Inés, Torres S. - Isolation and selection
of potential probiotic lactic acid bacteria from Opuntia ficus-indica fruits that grow
in Northwest Argentina, LWT - Food Science and Technology 84 (2017) 231–240.
18. Parada J. L., Caron C. R., Medeiros A. B. P., and Soccol C. R. - Bacteriocins from
lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives, Brazilian
Archives Of Biology And Technology 50 (3) (2007) 521-542.
19. Daba H., Pandian S., Gosselin J. F, Simard R. E., Huang J., and Lacroix C. -
Detection and activity of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides,
Applied and Environmental Microbiology 57 (12) (1991) 3450-3455.
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
54
5. Kumar V., Roy S., Meena D. K., Sarkar U. K. - Application of probiotics in shrimp
aquaculture: importance, mechanisms of action, and methods of administration.
Reviews in Fisheries Science & Aquaculture 24 (4) (2016) 342-368.
6. Phạm Thị Tuyết Ngân, Trần Sương Ngọc, Hồ Diễm Thơ. - So sánh khả năng cải
thiện chất lượng nước và ức chế Vibrio của xạ khuẩn Streptomyces parvulus và vi
khuẩn Bacillus subtilis chọn lọc trong hệ thống nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus
vannamei), Tạp chí khoa học Trường đại học Cần Thơ 47 (2016) 87-95.
7. Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định, Phạm Thị Hiếu. - Nghiên cứu
chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây
bệnh trên tôm, Tạp chí khoa học Nông nghiệp Việt nam 14 (11) (2016) 1809-1816.
8. Nguyễn Thị Chính, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Văn Duy. - Tuyển chọn một số chủng
vi khuẩn chịu muối mật, chịu axít và đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây
bệnh chết sớm ở tôm thẻ chân trắng (Litopanaeus vannamei), Tạp chí Khoa học -
Công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang 4 (2016) 35-41.
9. Nguyễn Thị Bích Đào, Trần Quang Khánh Vân, Nguyễn Văn Khanh, Nguyễn Quang
Linh. - Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus ức chế vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh tôm chết sớm ở tỉnh Thừa Thiên Huế, Tạp chí khoa học
(Đại học Huế) 100 (1) (2015) 15-28.
10. Mahrous H., Mohamed A., Abd El-Mongy M., El-Batal A. I., Hamza H. A. - Study
bacteriocin production and optimization using new isolates of Lactobacillus spp.
isolated from some dairy products under different culture conditions, Food and
Nutrition Sciences 4 (3) (2013) 342-356.
11. Balcázar J. L., Rojas-Luna T. - Inhibitory activity of probiotic Bacillus subtilis UTM
126 against Vibrio species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp
(Litopenaeus vannamei), Current Microbiology 55 (5) (2007) 409-412.
12. Kandler O., Weiss N. - Genus Lactobacillus Beijerink 1901, 212 AL, In: Bergey’s
manual of systematic bacteriology, vol. 2, Ed. P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E.
Sharpe, and J. G. Holt, Baltimore: Williams and Wilkins (1986) 1209-1234.
13. Gordon R. E., Haynes W. C., Pang C. H. - The genus Bacillus, Agricultural
handbook No. 427, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C. (1973) 4-5.
14. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương. - Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB
Đại học Quốc gia TP.HCM (2006) 45-48.
15. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết. - Thí nghiệm vi sinh vật
học, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM (2003) 38-49.
16. Trần Linh Thước. - Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ
phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội (2013) 71-101.
17. Verón, Herná E., Di Risio, H. D., Isla María Inés, Torres S. - Isolation and selection
of potential probiotic lactic acid bacteria from Opuntia ficus-indica fruits that grow
in Northwest Argentina, LWT - Food Science and Technology 84 (2017) 231–240.
18. Parada J. L., Caron C. R., Medeiros A. B. P., and Soccol C. R. - Bacteriocins from
lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives, Brazilian
Archives Of Biology And Technology 50 (3) (2007) 521-542.
19. Daba H., Pandian S., Gosselin J. F, Simard R. E., Huang J., and Lacroix C. -
Detection and activity of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides,
Applied and Environmental Microbiology 57 (12) (1991) 3450-3455.
Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus
55
20. Hor Y. Y., Liong M. T. - Use of extracellular extracts of lactic acid bacteria and
bifidobacteria for the inhibition of dermatological pathogen Staphylococcus
aureus, Dermatologica Sinica 32 (3) (2014) 141- 147.
21. Chavasirikunton V., Vatanyoopaisarn S. and Phalakornkule C. - Bacteriocin-like
activity from Weissella confusa and Pediococcus acidilactici isolated from traditional
Thai fermented sausages, Journal of Culture Collection 5 (2006-2007) 64-72.
22. Cheikhyoussef A., Pogori N., and Zhang H. - Study of the inhibition effects of
Bifidobacterium supernatants towards growth of Bacillus cereus and Escherichia
coli, International Journal of Dairy Science 2 (2) (2007) 116-125.
23. Usmiati, S. and Marwati, T. - Selection and optimation of process of bacteriocin
production from Lactobacillus sp., Indonesian Journal of Agriculture 2 (2) (2009)
82-92.
24. Marwa A., Saad H. M. et al. - Effect of pH, heat treatments and proteinase K
enzyme on the activity of Lactobacillus acidophilus bacteriocin, Benha Veterinary
Medical Journal 28 (1) (2015) 210-215.
25. Selvin J., Manilal A., Sujith S., Kiran G. S. & Lipton A. P. - Efficacy of marine
green alga Ulva fasciata extract on the management of shrimp bacterial diseases,
Latin American Journal Aquatic Research 39 (2) (2011) 197-204.
26. Vaseeharan B. and Ramasamy P. - Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus
subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus
monodon, Letters in Applied Microbiology 36 (2) (2003) 83-87.
27. Kongnum K. and Hongpattarakere T. - Effect of Lactobacillus plantarum isolated
from digestive tract of wild shrimp on growth and survival of white shrimp
(Litopenaeus vannamei) challenged with Vibrio harveyi, Fish & Shellfish
Immunology 32 (2012) 170-177.
28. Abriouel H., Franz C. M., Ben Omar N., Gálvez A. - Diversity and applications of
Bacillus bacteriocins, FEMS Microbiological Reviews 35 (1) (2011) 201-232.
29. Ouwehand A. C., Vesterlund S., Paltta J., Lauková A., Karp M. - Rapid screening
method for the detection of antimicrobial substances, Journal of Microbiological
Methods 57 (1) (2004) 23-31.
30. Ghosh S., Ringo E., Selvam A.D.G, Rahiman K. M. M., Sathyan N., John N. and
Hatha A. A. M. - Gut associated lactic acid bacteria isolated from the estuarine fish
Mugil cephalus: Molecular diversity and antibacterial activities against pathogens,
International Journal of Aquaculture 4 (1) (2014) 1-11.
31. Liu Y., He L. and Chen W. - Production and partial characterization of bacteriocin-
like peptides by Bacillus licheniformis ZJU12, Microbiological Research 161 (4)
(2006) 321-326.
32. Carraturo A., Raieta K., Ottaviani D. and Russo G. L. - Inhibition of Vibrio
parahaemolyticus by a bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) produced by
Vibrio mediterranei 1, Journal of Applied Microbiology 101 (1) (2006) 234-241.
33. Hwanhlem N., Ivanova T., Biscola V., Choiset Y., Haertlé T. - Bacteriocin
producing Enterococcus faecalis isolated from chicken gastrointestinal tract
originating from Phitsanulok, Thailand: Isolation, screening, safety evaluation and
probiotic properties, Food Control 78 (2017) 187-195.
Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn, Trần Anh Thư
56
34. Ahn H., Kim J., Kim W. J. - Isolation and characterization of bacteriocin-producing
Pediococcus acidilactici HW01 from malt and its potential to control beer spoilage
lactic acid bacteria, Food Control 80 (2017) 59-66.
35. Panchayuthapani D., Abraham T. J. and Jeyachandran P. - Inhibition of fish bacterial
flora by bacteriocin of lactic acid bacteria, Fishery Technology 32 (2) (1995) 118-121.
36. Van Duy Nguyen, Thu Thuy Pham, Thi Hai Thanh Nguyen, Thi Thanh Xuan
Nguyen, Lone Hoj - Screening of marine bacteria with bacteriocin-like activities and
probiotic potential for ornate spiny lobster (Panulirus ornatus) juveniles, Fish &
Shellfish Immunology 40 (1) (2014) 49-60.
37. Ngo Van Hai, Fotedar R. and Buller N. - Selection of probiotics by various
inhibition test methods for use in the culture of western king prawns, Panaeus
latisulcatus (Kishinouye), Aquaculture 272 (1-4) (2007) 231-239.
38. Sahoo T. K., Jena P. K., Patel A. K. and Seshadri S. - Bacteriocins and their
applications for the treatment of bacterial diseases in aquaculture: a review,
Aquaculture Research 47 (4) (2016) 1013-1027.
39. Chanratchakool P. - Problems in Penaeus monodon culture in low salinity areas,
Aquaculture Centres in Asia-Pacific 8 (1) (2003) 55-56.
40. Moriarty D. J. W - Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds,
Aquaculture 164 (1998) 351-358.
ABSTRACT
ISOLATION AND SCREENING OF BACTERIOCIN PRODUCING BACTERIA
INHIBITING SHRIMP PATHOGENIC VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS
Pham Minh Tuan*, Nguyen Thi Hong Phan, Tran Anh Thu
Ho Chi Minh University of Food Industry
*Email: pmtuan@cntp.edu.vn
Early Mortality Syndrome (EMS) also named Acute Hepatopancreatic Necrosis
Disease (AHPND) should be considered as a dangerous shrimp disease that has affected
shrimp farms in Southeast Asia. It was detected in shrimp farms in southern China as first
record in 2009 and afterward in Vietnam, Thailand and Malaysia. Lactic acid bacteria and
Bacillus isolated from some samples of various fermented vegetables, seafood
gastrointestinal tract and pond water were supposed to have capability to antagonize Vibrio
parahaemolyticus causing the EMS. 47 strains of lactic acid bacteria and 133 strains of
Bacillus were isolated and tested for antibacterial assays with the broth-dilution method and
the agar well diffusion method. The results showed that 11 out of 180 strains could inhibit
the Vibrio. The Bacillus sp. BV1 strain showed the highest antibacterial activity
(antibacterial activity of 85.6%, bacteriocin activity of 4222.820 AU/mL). This strain was
selected for the antagonistic experiment to Vibrio parahaemolyticus on white leg shrimp.
Survival rates were significantly improved to 85% and 90% (for the treatment with 104 and
106 CFU/mL of Bacillus sp. BV1, respectively), which were much higher than untreated
control after 9 days of challenge.
Keywords: Lactic acid bacteria, Bacillus, bacteriocin, Vibrio parahaemolyticus, EMS/AHPND.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- phan_lap_tuyen_chon_vi_khuan_sinh_bacteriocin_khang_vibrio_p.pdf