Phân lập và đánh giá khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật chịu mặn phân lập từ đất trên quần đảo Trường Sa

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 389 PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PHOSPHATE KHÓ TAN CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHỊU MẶN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRÊN QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA Vũ Duy Nhàn1, Vũ Văn Dũng1*, Nguyễn Thị Nhàn1, Trần Thị Nguyệt1, Lê Đức Anh1, Nguyễn Huy Hoàng2, Đỗ Hữu Nghị3, Lê Thị Yến4, Nguyễn Thị Lý5 Tóm tắt: Từ 26 chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng phân giải phosphate khó tan được phân lập từ 46 mẫu đất trên quần đảo Trường Sa đã lựa chọn được chủng D3 2.3 có khả năng phân giải phosphate mạnh nhất ứng dụng sản xuất phân hữu cơ vi sinh chịu mặn. Đánh giá ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, thời gian, nồng độ muối với các thành phần môi trường khác nhau như nguồn carbon và nitơ đến khả năng sinh trưởng và phân giải phosphate của chủng D3 2.3. Kết quả cho thấy, nồng độ muối thích hợp cho sự sinh trưởng là 0-5%, nhiệt độ thích hợp là 340C, pH thích hợp 6.5-7. Nguồn cacbon thích hợp phân giải phosphate là sucrose và glucose, nguồn nitơ thích hợp phân giải phosphate là cao nấm men và NH4NO3. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự 16S rRNA cho thấy, các chủng D3 2.3 có tỷ lệ tương đồng 100% với loài Bacillus endophyticus Từ khóa: Vi sinh vật; Phân giải phosphate; Chịu mặn; Nguồn carbon; Nguồn nitơ; Đất Trường Sa. 1. MỞ ĐẦU Phốt pho (P) là một trong những nguyên tố thiết yếu cho sự phát triển và tăng trưởng của cây trồng. Trong tự nhiên, dạng phosphate hòa tan cho cây trồng hấp thu trong đất bị hạn chế do nó tồn tại chủ yếu là trong các muối phosphate không hòa tan của sắt, nhôm và canxi trong đất. Trong quá trình canh tác khi bón phân lân cho cây trồng, một lượng lớn phosphate (70 đến 90%) được giữu lại và được cố định bằng cation như Ca2+ trong đất đá vôi hoặc đất bình thường để tạo thành canxi phosphate hay với Al3+ và Fe3+ trong đất chua để tạo thành nhôm phosphate (AlPO) và phosphate sắt (FePO) không tan [1]. Trong đất vùng rễ cây, nhiều vi sinh vật có khả năng hòa tan phosphate khó tan trong đất thông qua quá trình hòa tan và khoáng hóa. Nhóm vi sinh vật này làm tăng tính khả dụng sinh học của phosphate không tan để thực vật sử dụng. Các vi sinh vật đất chịu mặn cũng thể hiện khả năng hòa tan phosphate không hòa tan tạo điều kiện cho sự phát triển của nông nghiệp khu vực trên đất nhiễm mặn và kiềm [2]. Các vi sinh vật hòa tan phosphate là nhóm các vi sinh vật có lợi có khả năng thủy phân các hợp chất phospho hữu cơ và vô cơ khó tan. Cơ chế chính của quá trình hòa tan phosphate trong đất là làm giảm độ pH của đất nhờ sự sản xuất axit hữu cơ hoặc giải phóng các proton. Các axit hữu cơ và vô cơ được sản xuất bởi vi sinh vật hòa tan phosphate khó tan bằng cách chelat hoá với các cation và cạnh tranh vị trí hấp phụ trong đất với phosphate [3]. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, đánh giá khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật chịu mặn phân lập từ đất trên quần đảo Trường Sa từ đó lựa chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính cao nhất để sản xuất phân hữu cơ vi sinh. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - 46 mẫu đất trên quần đảo Trường Sa. - Môi trường NBRIP. 2.2. Phương pháp phân lập vi si sinh vật phân giải phosphate khó tan Theo mô tả của Teng và cộng sự (2019) [4] lấy 10 g đất pha với 90ml nước muối sinh Hóa học – Sinh học – Môi trường V. D. Nhàn, , N. T. Lý, “Phân lập và đánh giá khả năng trên quần đảo Trường Sa.” 390 4 4 4 lý đến nồng độ pha loãng đến 10-5. Hút 0.1ml dịch pha loãng ở các nồng độ trên cấy trải trên môi trường đĩa petri NBRIP agar. Đem các mẫu đi nuôi cấy trong tủ ấm ở 300C. Sau 2-5 ngày, lựa chọn các khuẩn lạc xung quanh có vòng phân giải lân. Tiến hành làm sạch các chủng vi khuẩn thu được và bảo quản trong lạnh sâu -800C và 4 0C để sử dụng làm các thì nghiệm tiếp theo. 2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate Chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi lỏng lắc trong môi trường NBRIP lỏng, tốc độ 200 vòng/phút. Sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả năng sinh trưởng, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm 10.000 vòng/phút, trong 10 phút, ở 4ºC. Hàm lượng PO43- giải phóng vào môi trường được xác định theo phương pháp Xanh molybdate [5]. 2.4. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường lỏng NBRIP lỏng có bổ sung các nồng độ muối NaCl (w/v): 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7%, 9%, 10%, 12% và 15%. Nuôi cấy dịch vi khuẩn trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 30°C, sau 5 ngày tiến hành đếm khuẩn lạc trên môi trường NBRIP agar để xác định khả năng sinh trưởng và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4ºC, thu dịch nổi để kiểm tra hàm lượng PO43- được giải phóng vào môi trường bằng phương pháp Xanh molipdate. 2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường muối lên khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi lỏng lắc trong môi trường NBRIP lỏng, tốc độ 200 vòng/phút, tại các giá trị pH (5, 6, 7, 8, 9) và nhiệt độ 25, 27, 30, 34, 37 và 40ºC. Sau 5 ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả năng sinh trưởng, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm 10.000 vòng/phút, trong 10 phút, ở 4ºC. Hàm lượng PO43- giải phóng vào môi trường được xác định theo phương pháp Xanh molybdate 2.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon Nguồn carbon là glucose, fructose, maltose, lactose, saccarose, dextrin được bổ sung vào môi trường NBRIP lỏng. Sau 5 ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả năng sinh trưởng, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm 10.000 vòng/phút, trong 10 phút, ở 4ºC. Hàm lượng PO43- giải phóng vào môi trường được xác định theo phương pháp Xanh molybdate. 2.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nguồn nitơ là (NH4)2SO4, NaNO3, NH4NO3, pepton, yeast extract, meat extract. Sau 5 ngày tiến hành đếm khuẩn lạc để xác định khả năng sinh trưởng, dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm 10.000 vòng/phút, trong 10 phút, ở 4ºC. Hàm lượng PO43-giải phóng vào môi trường được xác định theo phương pháp Xanh molybdate. 2.8. Định danh chủng vi sinh vật DNA tổng số của vi khuẩn được tách chiết bằng kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Gen 16S rRNA được khuếch đại và giải trình tự bằng cặp mồi phổ thông 27F và 1492R Những trình tự 16S rRNA hoàn chỉnh này được so sánh với các trình tự 16S rRNA đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu GeneBank để xác định tỷ lệ tương đồng. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn phân giải phosphate Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường NBRIP dịch pha loãng, các mẫu đất trên quần đảo Trường Sa đã lựa chọn được 55 khuẩn lạc có vòng phân giải phosphate với bán kính vòng Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 391 phân giải lớn nhất 13,2mm. Chúng tôi đã lựa chọn 26 chủng có vòng phân giải lớn hơn 5mm để tiến hành xác định hàm lượng PO43- giải phóng vào môi trường được xác định theo phương pháp Xanh molybdate. Kết quả được thể hiện trong hình 2. Trong 26 chủng vi khuẩn phân giải phosphate, hai chủng STT3 5.2 và D3 2.3 có hoạt tính đạt hiệu quả cao nhất lần lượt là 309.37 ± 5.58 mg/l và 342.06 ± 6.92 mg/l sau 5 ngày nuôi cấy, cao hơn so với các chủng còn lại. Vi sinh vật vùng rễ được báo cáo là có khả năng phân giải phosphate. Baliah và cs., (2016) [6] đã tuyển chọn được Bacillus megaterium, P. putida có khả năng phân giải phosphate cao. Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2017) [7] đã phân lập được chủng CF9 từ đất trồng cà phê khu vực Tây Nguyên có khả năng chịu mặn đến nồng độ muối 10%, hoạt tính phân giải phosphate cao nhất khi nồng độ muối 1% là 145,965mg/l. Do chủng D3 2.3 có hoạt tính phân giải phosphate cao nên chúng tôi chọn để ứng dụng sản xuất phân hữu cơ vi sinh và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hình 1. Hình ảnh sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải phosphate khó tan, hình ảnh khuẩn lạc và tế bào chủng D2.3.2. Hình 2. Khả năng phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật phân lập. 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate cuả chủng D3 2.3 Vi sinh vật sinh trưởng đến một giai đoạn nhất định sẽ bị suy vong, do vậy, việc tìm ra thời điểm mật độ vi sinh vật đạt cực đại có ý nghĩa quan trọng để xác định thời điểm thu sinh khối tế bào. Kết quả hình 3 cho thấy, chủng D3 2.3 sinh trưởng cực đại ở thời điểm 3 ngày nuôi cấy nhưng lượng PO43- giải phóng ra môi trương đạt bắt đầu từ ngày thứ 2 và đạt cực đại sau 4 ngày nuôi cấy. 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate của chủng D3 2.3 Nồng độ NaCl tác động đến áp suất thẩm thấu của môi trường cũng như tế bào vi sinh vật, nên ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh trưởng. Kết quả cho thấy, mật độ tế bào và nồng độ PO3- giải phóng giảm khi nồng độ NaCl tăng (hình 4). Chủng D3 2.3 có khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate nồng độ muối từ 0-5%. ở nồng độ 5-10% chủng sinh trưởng chậm, lớn hơn 10% thì gần như không phát triển. Srinivasan và cộng sự (2012) [8] đã phân lập được 23 chủng vi khuẩn và 35 chủng nấm có khả năng phân giải phosphate trong đó, Aerococcus sp.PSBCRG1-1, Pseudomonas aeruginosa PSBI3-1, Aspergillus terreus PSFCRG2-1 có khả năng sinh trưởng và phân giải phosphate ở nồng độ NaCl đến 2M. Hóa học – Sinh học – Môi trường V. D. Nhàn, , N. T. Lý, “Phân lập và đánh giá khả năng trên quần đảo Trường Sa.” 392 4 Hình 3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate của chủng D3 2.3. Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate của chủng D3 2.3. Hình 5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường muối lên khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate. 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhiệt độ quá nóng hoặc quá lạnh làm dừng quá trình trao đổi chất nên vi sinh vật ngừng phát triển hoặc bị chết. Chủng D3 2.3 có khả năng sinh trưởng trong dải nhiệt độ nghiên cứu từ 25-450C, nhiệt độ thích hợp là 340C, ở nhiệt độ này khả năng sinh trưởng và phân hủy phosphate là mạnh nhất. Khi tăng nhiệt độ cao hơn 34ºC, khả năng sinh trưởng giảm, khả năng sinh tổng hợp các axit hữu cơ giảm nên giảm khả năng phân giải phosphate giảm. 3.5. Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng và phát triển của chủng D3 2.3 cho thấy, chủng có khả năng sinh trưởng và phân giải phosphate trong dải pH 5-8. Tại các giá trị pH 6,5 và 7 khả năng sinh trưởng và phân giải phosphate là cao nhất (hình 5). Nghiên cứu về ảnh hưởng của pH lên khả năng phân giải phosphate tác giả Mujahid và cs (2015) cũng chỉ ra rằng, pH 5-7 rất thích hợp với các chủng vi khuẩn có khả năng hòa tan phosphate, khả năng này giảm khi pH thấp hơn 5 hoặc cao hơn 8 [9]. 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Chủng D3 2.3 được đánh giá khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate sau 4 ngày nuôi trong môi trường NBRIP lỏng với nguồn carbon khác nhau. Kết quả (hình 7) cho thấy, chúng đều sử dụng được các nguồn carbon và nitơ nghiên cứu và có khả năng phân giải phosphate. Hàm lượng PO43- (mg/l) được giải phóng bởi chủng D3 2.3 dao động trong khoảng 150 đến 350 mg/l, mật độ tế bào từ (1.5-4.8)*108cfu/ml. Nguồn carbon thích hợp với chủng D3 2.3 là glucose và sucrose. Nguồn cacbon là lactose và maltose thì khả năng phân giải phosphate là kém nhất. Khi đánh giá ảnh hưởng của các nguồn carbon tới khả năng phân giải phosphate của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất, Mujahid và cs., (2015) [9] nhận thấy, glucose và fructose là nguồn carbon thích hợp nhất với các chủng này. Baliah và cs., (2016) lại kết luận rằng, các chủng vi khuẩn phân giải phosphate phân lập từ đất có khả năng sử dụng maltose và lactose, trong khi surose là nguồn carbon không thích hợp [6]. Nguyễn Thu Hương và cs., (2018) báo cáo rằng, chủng vi khuẩn hòa tan phosphate P. aeruginosa thích hợp với nguồn cacbon là glucose và fructose [10]. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 393 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Sau 4 ngày trong môi trường NBRIP có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau kết quả cho thấy, chủng D3 2.3 khả năng sinh trưởng và phân giải phosphate ở tất cả các nguồn nitơ khảo sát. Hàm lượng phosphate được giải phóng bởi chủng D3 2.3 dao động trong khoảng 150 đến 350 mg/l, mật độ tế bào từ (0.9-3.6)*108cfu/ml. Nguồn nitơ vô cơ cho mật độ tế bào và lượng phosphate giải phóng thấp hơn nguồn nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp với cao nấm men, nguồn nitơ vô cơ là NH4NO3. Mujahid và cs., (2015) [6] cho rằng, (NH4)2SO4, NH4NO3 là nguồn nitơ thích hợp với chủng vi sinh vật phân giải phosphate còn Baliah và cs., (2016) [6] kết luận nguồn nitơ vô cơ thích hợp gồm NH4Cl, NH4NO3, KNO3. Nguyễn Thu Hương và cs. (2018) nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng phân giải phosphat của chủng P. aeruginosa HD3 kết quả nguồn nitơ thích hợp và cao nấm men và (NH4)2SO4, NH4NO3 [10]. Hình 6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ khả năng sinh trưởng và hòa tan phosphate. 3.8. Định danh chủng vi khuẩn D3 2.3 Kết quả trình tự 16S rRNA hoàn chỉnh của chủng D3 2.3 được so sánh với các trình tự 16S rRNA đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu GenBank để xác định tỷ lệ tương đồng. Kết quả cho thấy, chủng D3 2.3 có tỉ lệ tương đồng 100% với loài Bacillus endophyticus. 4. KẾT LUẬN Từ các mẫu đất vùng rễ cây thu thập trên quần đảo Trường Sa đã lựa chọn được 26 chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng phân giải phosphate khó tan trong đó đã tuyển chọn được D3 2.3 có khả năng phân giải phosphate mạnh nhất. Kết quả phân tích đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA đã xác định cả hai chủng thuộc loài là Bacillus endophyticus D3 2.3. Chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, thời gian nuôi, nồng độ muối với các thành phần môi trường khác nhau như nguồn carbon và nitơ đến khả năng sinh phân giải phosphate của chủng B.endophyticus D3 2.3. Kết quả là nồng độ muối thích hợp cho sự sinh trưởng là 0-3%. Nhiệt độ thích hợp là 340C, pH thích hợp 6.5-7. Nguồn cacbon thích hợp phân giải phosphate là sucrose và glucose nguồn nitơ thích hợp phân giải phosphate là cao nấm men và NH4NO3. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này thực hiện dưới sự tài trợ về kinh phí từ đề tài cấp Quốc gia do Bộ Khoa học và Công nghệ quản lý, mã số 11/19-C-ĐTĐL.CN.CNN. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Satyaprakash M., Nikitha T., Reddi E. U. B., Sadhana B., and Vani S. S., “A review on phosphorous and phosphate solubilising bacteria and their role in plant nutrition,” International Journal of Current Microbiology and Applied Scences, vol. 6, 2017, pp. 2133–2144. Hóa học – Sinh học – Môi trường V. D. Nhàn, , N. T. Lý, “Phân lập và đánh giá khả năng trên quần đảo Trường Sa.” 394 [2]. Sharma S. B., Sayyed R. Z., Trivedi M. H., and Gobi T. A.,“Phosphate solubilizing microbes: sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils,” SpringerPlus, vol. 2, 2013, pp. 587 [3]. David P., Raj R. S., Linda R., Rhema S. B., “Molecular characterization of phosphate solubilizing bacteria (PSB) and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) from pristine soils”. Int. J. Innov. Sci. Eng. Technol., 2014, pp. 317–324 [4]. Teng, Z., Chen, Z., Zhang, Q. et al., “Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from rhizosphere soils of the Yeyahu Wetland in Beijing, China”, Environ Sci Pollut Res 26, 2019, pp.33976–33987. [5]. Murphy J., and Riley J.P., “A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters”, Department of Oceanography, The University Liverpool, 1996, pp.31-36 [6]. BaliahT., et al., “Isolation, identification and characterization of phosphate solubilizing bacteria from different crop soils of Srivilliputtur Taluk, Virudhunagar District, Tamil Nadu”. Tropical Ecology, 57(3), 2016, pp.465- 474 [7]. Nguyễn Thị Thanh Mai và cs., “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân, kali khó tan từ đất trồng cà phê tại khu vực Tây Nguyên”, Tạp chí khoa học Công nghệ Việt Nam, 60(5), 2018, Tr. 34-38. [8]. Srinivasan R, Yandigeri MS, Kashyap S, Alagawadi AR., “Effect of salt on survival and P-solubilization potential of phosphate solubilizing microorganisms from salt affected soils”, Saudi J Biol Sci. 19(4), 2012, pp.427-434. [9]. Mujahid T.Y. et al., “Effects of different physical and chemical parameters on phosphate solubilization activity of plant growth promoting bacteria isolated from indigenous soil”, Journal of Pharmacy and Nutrition Sciences, Vol.5, 2015, pp.64-70. [10]. Nguyễn Thu Hương, Trần Thị Thúy Hà, Nguyễn Văn Giang, “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân giải phosphate khó tan từ đất vùng rễ lúa ở tỉnh Hải Dương”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 60(8), 2018, Tr. 8-15. ABSTRACT ISOLATION AND EVALUATION OF PHOSPHATE SOLUBILISING HALOPHILIC BACTERIA FROM SPRATLY ISLANDS SOILS 26 bacterial strains with phosphate solubilising activity were isolated from soil samples from the Spratly Islands soil. The salt tolerance D3 2.3 strain exhibited the highest phosphate solubilising activity was selected to use for organic fertilizer production. We investigated the effect of salt concentrations, pH, time of culture, carbon and nitrogen sources on the growth and solubilization of phosphate. The result showed that the strain exhibited highest phosphate solubilising activity when it was cultured in a NBRIP medium with glucose and sucrose as carbon sources and yeast extract or NH4NO3 as nitrogen sources at 34ºC, pH 6.5-7. The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences showed that strain D3 2.3 belong to the genus Bacillus, of which it shared 100% identity with Bacillus endophyticus. Keywords: Bacteria; Phosphate solubilising; Halophilic; Carbon source; Nitrogen source; Spratly islands soils. Nhận bài ngày 01 tháng 8 năm 2020 Hoàn thiện ngày 05 tháng 10 năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 10 năm 2020 Địa chỉ: 1Viện Hóa học- Vật liệu, Viện KH-CN quân sự; 2Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN; 3Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ VN; 4Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội; 5Học viện Nông nghiệp Việt Nam. *Email: vandungbio46@yahoo.com.