Phân lập và nghiên cứu đa dạng di truyền nấm curvularia lunata gây bệnh lem lép hạt löa

Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 45 PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NẤM Curvularia lunata GÂY BỆNH LEM LÉP HẠT LÖA Isolation and Genetic Diversity Evaluation of Curvularia lunata Causing Black Kernel Disease in Rice Nguyễn Quốc Trung, Bùi Thị Xuân, Nguyễn Ngọc Hòa Khoa Công Nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ngày nhận bài: 20.3.2019 Ngày chấp nhận: 15.5.2019 Abstract Discolouration or black kernel disease is one of the most common diseases affecting seed quality and yield in rice production. Black kernel is caused by several pathogens, among them Curvularia lunata (C. lunata) is the most usual and most dangerous one. This study aimed to isolate C. lunata from samples collected from 3 provinces: Lao Cai, Thai Nguyen and Soc Trang. Seventeen isolates of C. lunata were isolated based on mophorlogy of colony and structure of spore under microscope. Genetic diversity was analyzed using 19 RAPD markers inwhich 6 markers showed high polymorphic with PIC value ranged from 0.71 (OPA11) to 0.89 (OPA3). Phylogenetic tree was constructed by NTSYS pc2.1 software. Five groups were devided with genetic homologous value 0.74. Group 1, 2 and 5 were geographical origin from Lao Cai, Thai Nguyen-Lao Cai and Soc Trang, responsibly. Group 3 and 4 were from both Thai Nguyen and Lao Cai. Keywords: Curvularia lunata, black kernel, genetic diversity, RAPD marker 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong ngành sản xuất lúa gạo, bệnh lem lép hạt là một loại bệnh rất phổ biến gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng hạt giống và năng suất. Bệnh này do một số loại vi khuẩn và nấm gây ra như: Pseudomonas glumae, Alternaria padwickii, Bipolaris oryzae, Fusarium sp, Curvularia lunata, Trong đó, Curvularia lunata (C. lunata) là tác nhân quan trọng nhất, gây tổn thất đáng kể đến chất lượng và năng suất lúa (Sumanagala và cs. 2008). Bệnh thường gây hại vào giai đoạn lúa trỗ bông đến chín sữa. Nếu gặp điều kiện thuận lợi với mưa kéo dài và độ ẩm cao, bệnh sẽ gây tỷ lệ lép, lửng cao. Ở cây lúa bị bệnh lem lép hạt trên vỏ trấu có những đốm nhỏ màu sậm biến đổi từ màu nâu đến màu đen, khi bị bệnh nặng tạo thành những mảng nâu đen trùm lên cả vỏ trấu. Hậu quả là chất lượng hạt gạo kém do bị biến màu hoặc bị lép. Theo Kamaluddeen và cs. 2013, triệu chứng bệnh do C. lunata gây ra xuất hiện trước tiên trên lá. Các đốm màu nâu hình elip xuất hiện và to dần ra trên lá. Sau đó, các đốm xuất hiện trên bẹ lá. Dần dần, bệnh lan ra đến hạt. Vỏ trấu chuyển màu và bị nhiễm nặng, hạt thóc sẽ chuyển màu đen. Một số công bố bước đầu đã phân lập thành công và nghiên cứu đa dạng di truyền như: Goh và cs. 1998 đã sử dụng trình tự bảo thủ giữa gen tổng hợp 28S rRNA, 5.8S rRNA và vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) để đánh giá đa dạng di truyền của Bipolaris, Cercospora, Corynespora, Curvularia, Drechslera, Exserohilum và Helminthosporium. Ahmad và cs. 2006 đã sử dụng RAPD (random amplified polymorphic DNA) để đánh giá đa dạng di truyền các quần thể C. lunata phân lập từ lúa mì và lúa Hiện nay, ở Việt Nam các đề tài nghiên cứu về phân lập, đánh giá đa dạng di truyền các tác nhân gây bệnh lem lép hạt còn chưa được quan tâm. Đề tài nghiên cứu này nhằm cung cấp thêm các thông tin về đặc điểm hình thái, sự đa dạng di truyền của nấm C. lutana phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật cũng như chọn tạo giống kháng bệnh. Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 46 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các isolate nấm C. lunata được phân lập từ các mẫu lá nhiễm bệnh. Mẫu bệnh được thu thập bắt đầu từ giai đoạn cây lúa đẻ nhánh. Dựa trên triệu chứng bệnh mô tả theo Kamaluddeen và cs. 2013: lá nhiễm bệnh được thu thập và ghi đầy đủ thông tin (thời gian, địa điểm thu thập, mẫu giống lúa) trên túi thu thập. Địa điểm thu thập gồm 2 tỉnh Bắc Bộ là Lào Cai và Thái Nguyên; 1 tỉnh miền Đông Nam Bộ là Sóc Trăng. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Các isolate nấm được phân lập theo phương pháp IRRI, 1997 (Không thấy tài liệu tham khảo) . Mẫu bệnh được cắt ra từng mảnh nhỏ khoảng 2-3 mm. Sau khi khử trùng bề mặt bằng 0.5% dung dịch Natri hypoclorit trong 1 phút và rửa lại 3 lần bằng nước cất khử trùng. Nấm bệnh được nuôi cấy trong môi trường PDA (1 lít môi trường: 4g potato extract, 20g D-glucose, 15g agar, pH 6,5-7) ở 28ºC trong 3 ngày. Sau đó dùng que cấy vô trùng quệt nhẹ lên bề mặt mô bệnh chuyển sang bề mặt môi trường PDA mới. Để nấm phát triển sau khoảng 4-5 ngày tiến hành lấy bào tử của nấm đưa lên kính hiển vi quan sát xác định bào tử. Cấy chuyển nhiều lần để làm thuần. Các isolate nấm được lưu giữ trong môi trường thạch nghiêng cho việc sử dụng ngắn hạn và giữ giống lâu dài trong glycerol 30% ở -30ºC. 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Tách chiết DNA: theo qui trình của Dellaporta và cs. 1983. DNA tách chiết được kiểm tra chất lượng bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Đánh giá đa hình bằng chỉ thị RAPD: 19 mồi RAPD được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên C. lunata (bảng 1). Bảng 1. 19 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền STT Tên mồi Trình tự 5’- 3’ Tài liệu tham khảo 1 OPA-01 CAGGCCCTTC Weikert-oliveira và Resende, 2002 2 OPA-03 AGTCAGCCAC 3 OPA-07 GGTGACGCAG 4 OPA-11 CAATCGCCGT Caligiorne và cs. 1999 5 OPA-13 CAGCACCCAC 6 OPG-06 GTGCCTAACC 7 OPG-14 GGATGAGACC 8 OPE-14 TGCGGCTGAG 9 PAP2 TACAACGAGG Séré và cs. 2007 10 PAP3 TGGATTGGTC 11 OPE-14 TGCGGCTGAG 12 OPG-05 CTGAGACGGA 13 OPQ-04 GACGGCTATC 14 OPD-08 GGCAGGCAAG 15 OPA-17 GACCGCTTGC 16 OPB-10 CTGCTGGGAC 17 OPB17 AGGGAACGAG 18 OPB-04 GGACTGGAGT Reza và cs. 2010 19 OPB-06 TGCTCTGCCC Điều kiện PCR: biến tính ở 94ºC trong 3 phút, 40 chu kì tiếp theo 94ºC trong 1 phút, 31ºC trong 1 phút, 72ºC trong 2 phút và 72ºC trong 15 phút ở chu kì cuối, bảo quản ở 15ºC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 4% và quan sát trên máy đọc gel. Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 47 Dựa trên kết quả điện di sản phẩm PCR, các băng trên gel được xác định và quy ước (0) không có băng và (1) có băng. Hệ số tương đồng di truyền Jaccard trong NTSYSpc phiên bản 2.1 được sử dụng để phân tích đánh giá mối liên hệ về mặt di truyền giữa các isolate C. lunata (Rohlf, 2000). Các băng sản phẩm PCR được dùng để phân tích độ tương đồng và vẽ sơ đồ hình cây về mức độ tương đồng di truyền. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả phân lập các isolate nấm Từ các mẫu lá bệnh thu thập tại Lào Cai, Thái Nguyên, Sóc Trăng, 17 isolate nấm đã được phân lập và tuyển chọn dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình dạng bào tử theo mô tả của Kamaluddeen và cs. 2013 (bảng 2) để tiến hành thí nghiệm. Khuẩn lạc của tất cả các isolate đều có màu xám đen đặc trưng, khác nhau ở màu sắc và sự xuất hiện của các sợi nấm bông trên bề mặt. Bảng 2. Danh sách 17 isolate phân lập từ 3 địa điểm thu thập (2013) STT Kí hiệu Địa điểm thu thập STT Kí hiệu Địa điểm thu thập 1 KU 1-1 Sóc Trăng 10 ADBL 10-16-1 Thái Nguyên 2 KU 1-2 Sóc Trăng 11 ADBL 10-18-1 Thái Nguyên 3 KU 4-2 Sóc Trăng 12 ADBL 10-28-1 Thái Nguyên 4 KU 9-1 Sóc Trăng 13 ADBL 10-28-2 Thái Nguyên 5 KU 9-4 Sóc Trăng 14 573 Thái Nguyên 6 KU 10-2 Sóc Trăng 15 574 Thái Nguyên 7 KU 10-3 Sóc Trăng 16 LC 25 Lào Cai 8 KU 12-1 Sóc Trăng 17 Pi-1 (séng cù) Lào Cai 9 KU 12-2 Sóc Trăng Bào tử mang đặc điểm đặc trưng của chi Curvularia, bào tử hơi cong ở tế bào thứ ba tính từ cuống bào tử, thường ba vách ngăn, bào tử màu nâu đậm, vách ngăn được quan sát rõ ràng dưới kính hiển vi. Qua so sánh hình thái bào tử của các isolate với các mô tả đã công bố của Kamaluddeen và cs. 2013 và trên website có thể kết luận sơ bộ 17 isolate phân lập được thuộc chi Curvularia loài Curvularia lunata. Hình 1. Hình ảnh bào tử của isolate nấm phân lập Curvularia spp. Hình a: 10-18-1, b: KU 9-4, c: ADBL 10-18-1, d: ADBL 10-28-2 và mô tả bào tử theo www.mycobank.org 3.2 Đánh giá đa dạng di truyền Với 19 mồi RAPD được sử dụng cho nghiên cứu, kết quả cho thấy có 6 trong 19 mồi cho đa hình giữa các isolate nghiên cứu. Các băng điện di có kích thước từ 150 – 1600bp. Trong phân tích đa dạng di truyền, chúng tôi coi mỗi băng DNA sản phẩm trên bản điện di với một kích thước nhất định là một alen. Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 48 Bảng 3. Số lƣợng băng đa hình và hệ số PIC của các mồi STT Tên mồi Tổng số alen Số alen đa hình Hệ số PIC 1 OPA03 12 11 0.89 2 OPB 06 10 8 0.75 3 OPA 07 8 5 0.80 4 OPA 11 7 6 0.71 5 OPA 13 9 7 0.85 6 OPB 10 7 6 0.75 Tổng 53 43 Trung bình 8.8 7.2 0.79 Chú thích: chỉ số PIC (Polymorphism Information Content) là hệ số đa dạng từng locus gene được tính theo công thức PIC = 1-∑Pi 2 , trong đó P là tần xuất xuất hiện của alen thứ (i). Qua kết quả tính toán cho thấy mồi OPA 03 có hệ số PIC cao nhất với 11/12 alen đa hình, hệ số PIC thấp nhất 0,71 thuộc về mồi OPA 11 với 6/7 alen đa hình. Hệ số PIC trung bình của 6 mồi RAPD đạt 0,79. Nhằm đánh giá mối quan hệ di truyền của 17 isolate, sơ đồ hình cây về mức độ tương đồng di truyền trên 6 mồi RAPD được xây dựng dựa theo hệ số tương đồng di truyền Jaccard. Thông qua hình ảnh điện di số liệu được phân tích và tổng hợp cho việc lập cây đa dạng bằng phần mềm NTSYSpc2.1. Hình 2. Ảnh điện di sản phẩm PCR với 6 mồi RAPD. + Hình a, b, c, d, e, f tương ứng với mồi OPA03, OPA11, OPA13, OPA07, OPB06, OPB10. + Các mẫu từ M đến 17 lần lượt là DNA ladder 100bp, pi1, LC25, 573, 574, ADBL10-16, ADBL10-18, ADBL 10-28-1, ADBL 10-28-2, KU 1-1, KU 1-2, KU 4-2, KU 9-1, KU 9-4, KU 10-2, KU 10-3, KU 12-1. KU 12-2. Kết quả nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 5/2019 49 Dựa trên kết quả phân tích cây đa dạng di truyền, chúng tôi phân chia 17 isolate được chia thành năm nhóm ở mức độ tương đồng 0,74. Trong đó nhóm 1 (gồm pi1), nhóm 2 (gồm lc25, 574, ADBL 10-18, 573) và nhóm 5 (KU 10-3) đặc trưng cho vùng địa lý thu thập mẫu lần lượt từ Lào Cai, Thái Nguyên-Lào Cai và Sóc Trăng. Hai nhóm 3 (ADBL10-16, KU9- 1) và 4 (ADBL10-28-1, ADBL10-28-2, KU1-1, KU1-2, KU4-2, KU9-4, KU10-2, KU12-1 và KU12-2) có nguồn gốc ở cả Thái Nguyên và Sóc Trăng, sự tương đồng di truyền của các isolate thu thập từ 2 địa điểm cách xa nhau ở nhóm 3 và 4 cần được phân tích thêm ở mức phân tử để có thể giải thích về nguồn gốc các isolate này. Hình 3. Cây đa dạng di truyền dựa trên kết quả phân tích chỉ thị RAPD 4. KẾT LUẬN Tiến hành thu thập mẫu trong vụ Mùa 2013, chúng tôi đã phân lập thành công 17 isolate nấm Curvularia lutana gây bệnh lem lép hạt từ Lào Cai, Thái Nguyên và Sóc Trăng, đồng thời đã phân các isolate thành 5 nhóm dựa theo đa dạng di truyền phân tích bằng chỉ thị RAPD. Bệnh lem lép hạt là phổ biến, phân bố cả ở miền Bắc và miền Nam. Nguồn bệnh này là cơ sở rất hữu ích cho công tác bảo vệ thực vật, đánh giá độc tính nấm gây hại ở từng vùng sản xuất và là công cụ trong công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh lem lép hạt. Để có đầy đủ thông tin về tình hình bệnh lem lép hạt trên cả nước cũng như đa dạng di truyền, phân nhóm isolate nấm Curvularia lunata cần có những nghiên cứu trên quy mô toàn quốc và trong nhiều năm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahmad, I., Iram, S., Cullum, J., Ahmad, I., & Al, E. T., 2006. Genetic variability and aggressiveness in Curvularia lunata associated with rice-wheat cropping areas of pakistan, 38(2), 475–485. 2. Caligiorne, R.B., Resende, M.A., Paiva, E. & Azevedo, V., 1999. Use of RAPD (random amplified polymorphic DNA) to analyse genetic diversity of dematiaceous fungal pathogens. Canadian Journal of Microbiology 45:408-412. 3. Dellaporta SL, Wood J, and Hicks JB.,1983. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep 1: 19-21 4. Goh, T.K., Hyde, K.D. and Lee, D.K.L., 1998. Generic distinction in the Helminthosporium - complex based on restriction analysis of the nuclear ribosomal RNA gene. Fungal Diversity. 1: 85-107 5. IRRI. (1997). Laboratory manual. In: A workshop on gene cloning, transformation and molecular analysis of transgenic rice. Plant Breeding, Genetics, and Biochemistry division, IRRI. 6. Kamaluddeen; Sobita Simon; Lal, A. A., 2013. A new blight disease of rice caused by Curvularia lunata from Uttar Pradesh. International Journal of Agricultural Science and Research (IJASR) 3 (5) 13-15. 7. Reza, M., Motlagh, S., & Anvari, M., 2010. Genetic variation in a population of Bipolaris oryzae based on RAPD-PCR in north of Iran, 9(36), 5800–5804. 8. Rohlf FJ, 2000. NTSYS-pc number taxonomy and multivariate analysis system version 2.1. Setauket, NY, USA, Exeter Publish-ing. 9. Séré, Y., Onasanya, A., Afolabi, A., Mignouna, H. D., & Akator, K., 2007. Genetic diversity of the blast fungus, Magnaporthe grisea ( Hebert ) Barr , in Burkina Faso, 6(22), 2568–2577. 10. Sumangala K., Patil M.B., Nargund V.B. and Ramegowda G., 2008. Evaluation of fungicides, botanicals and bio-agents against Curvularia lunata, a causal agent of grain discoloration in rice, Journal of Plant Dis. Sci., 3(2), 159-164. 11. Weikert-oliveira, R. C. B., Resende, M. A. D. E., 2002. Genetic variation among pathogens causing “ Helminthosporium ” diseases of rice , maize and wheat, 27(6), 639–643. Phản biện: TS. Nguyễn Huy Chung