Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 22 PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ DÂY RỐN Lê Thị Bích Phượng*; Đỗ Minh Trung**; Lê Văn Đông** Đỗ Quyết**; Đồng Khắc Hưng** TÓM TẮT Mục tiêu: phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn. Đối tượng và phương pháp: mẫu dây rốn (n = 5) thu nhận tại Khoa Sản, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh, được xử lý cắt thành những mảnh mô nhỏ kích thước khoảng 2 mm2 và nuôi cấy trong môi trường chuyên biệt để phân lập tế bào. Tế bào sau khi phân lập nuôi cấy tăng sinh được kiểm tra tính gốc thông qua các chỉ tiêu như khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy, biểu hiện các dấu ấn bề mặt cho dòng tế bào gốc trung mô trong giai đoạn nuôi cấy. Đánh giá tính an toàn của quá trình phân lập qua kết quả kiểm tra nhiễm sắc thể đồ, nội độc tố và mycoplasma. Kết quả: phân lập và nuôi cấy được tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn, tế bào thu nhận được có khả năng bám dính vào bề mặt bình nuôi cấy, tế bào có dạng thuôn dài, giống với nguyên bào sợi, biểu hiện dương tính với các dấu ấn CD44, CD73, CD90 (> 95%) và âm tính với các dấu ấn CD14, CD45, HLADR (< 5%). Kết quả đánh giá tính an toàn của mẫu tế bào MSC phân lập được, kết quả âm tính với nội độc tố và mycoplasma. Kết luận: đã phân lập và nuôi cấy được tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn, tế bào đạt các tiêu chí của tế bào gốc trung mô từ mô dây rốn và đảm bảo tính an toàn để ứng dụng trong điều trị lâm sàng. * Từ khóa: Tế bào gốc trung mô; Mô dây rốn; Phân lập tế bào gốc trung mô. Isolation and Culture of Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord Tissues Summary Objectives: To isolate and culture umbilical cord tissue mesenchymal stem cells. Subjects and method: Using human umbilical cords (n = 5) for isolated mesenchymal stem cells were collected from the Obstetrics Department, Vanhanh General Hospital. After harvested, cords were segmented into small pieces about 2 mm2 in size, cultured in a specialized medium for isolation of mesenchymal stem cells. These stem cells were tested stemness based on criteria such as their ability to stick on the surface of culture flasks, expression of surface markers of mesenchymal stem cell lines during the culturing period. Safety evaluation was investigated by examining karyotype, and the presence of endotoxin, mycoplasma. Results: Umbilical cord - mesenchymal stem cells samples were successfully solated and cultured. The obtained cells have ability to attach to the surface of culture flasks and having fibroblast-like shape. * Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/03/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/05/2018 Ngày bài báo được đăng: 25/06/2018 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 23 These cells were positive with markers: CD44, CD73, CD90 (> 95%) and negative with marker CD14, CD45, HLADR and passed the safety test with endotoxicity and mycoplasma. Conclusions: We were successful in isolation, expansion of umbilical cord - mesenchymal stem cells. The cell population met the criteria of UC-MSC and ensure safety for use in treatment. * Keywords: Mesenchymal stem cell; Umbilical cord tissue; Isolation of mesenchymal stem cells. ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc trung mô (TBGTM) là một nguồn tế bào gốc được sử dụng phổ biến trong liệu pháp tế bào và liệu pháp gen [1]. Tương tự các kiểu tế bào gốc khác, TBGTM là nhóm tế bào gốc đa tiềm năng, có khả năng tự làm mới cao. TBGTM có thể biệt hóa in vitro hay in vivo thành cả hai dòng tế bào thuộc và không thuộc trung mô. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, dây rốn người là nguồn giàu TBGTM [2]. So với các nguồn khác, mẫu dây rốn có các ưu điểm: thu nhận mẫu dây rốn tương đối dễ dàng, không gặp phải các rào cản về vấn đề đạo đức y khoa như trường hợp thu nhận tế bào gốc phôi; không gây xâm lấn, không ảnh hưởng tới cả sản phụ và trẻ sơ sinh; số lượng tế bào nhiều hơn và đặc điểm tự làm mới cũng nhanh hơn [2, 3] và có thể sử dụng cả nguồn dây rốn sẵn có từ việc lưu trữ tại các ngân hàng tế bào gốc. Với những đặc tính ưu việt như trên, cùng tính sinh miễn dịch thấp, biểu hiện thấp HLA lớp I và không biểu hiện HLA lớp II nên TBGTM là một giải pháp hữu hiệu cho liệu pháp điều trị ghép tế bào gốc đồng loài [4]. TBGTM ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các thử nghiệm lâm sàng điều trị bệnh về miễn dịch và thoái hóa như bệnh mô ghép chống túc chủ (Graft versus host disease - GVHD), bệnh Crohn, bệnh tiểu đường, suy thận, bệnh lý thần kinh như chấn thương tủy sống... [5, 6] và gần đây là trong nghiên cứu về liệu pháp gen đích trong điều trị ung thư [7]. Kết quả thử nghiệm khả quan về tính an toàn và hiệu quả của liệu pháp điều trị, đặc biệt không ghi nhận tác dụng phụ lâu dài hay hình thành khối u hoặc loại thải tế bào trong quá trình điều trị thử nghiệm [8]. Với những kết quả đã được thử nghiệm cùng với nhu cầu điều trị hiện nay, TBGTM từ mô dây rốn thật sự là một giải pháp an toàn, tiện lợi, kịp thời cho bệnh nhân (BN) mắc bệnh hiểm nghèo và không đủ điều kiện thu nhận tế bào tự thân cho lộ trình điều trị bằng tế bào gốc. Đảm bảo tiết kiệm thời gian và giảm thiểu nguy cơ gây xâm lấn tới sức khỏe, tinh thần BN trong thời gian điều trị. Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu đã: Tiến hành phân lập và nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô dây rốn tại Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh nhằm tạo nguồn tế bào phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 24 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. Mẫu dây rốn (n = 5) sử dụng cho phân lập nuôi cấy TBGTM được thu nhận trong điều kiện vô trùng tại Khoa Sản, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh, thỏa mãn các điều kiện: sản phụ < 30 tuổi, sinh con đủ tháng; kết quả xét nghiệm âm tính với HIV, HAV, HBV, HCV và giang mai; dây rốn trơn, nhẵn, hồng. Dây rốn sau khi thu nhận được đặt trong dung dịch nước muối vô trùng (natri clorid 0,9%), bảo quản ở điều kiện nhiệt độ khoảng 40C và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, thời gian lưu mẫu tối đa không quá 72 giờ. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Nuôi cấy mô dây rốn phân lập tế bào gốc: Mẫu mô được phân lập theo quy trình chuyển giao từ Viện Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên: tiến hành giải xoắn dây rốn, cắt tại những chỗ xoắn thành từng đoạn ngắn, xẻ dọc mỗi đoạn ngắn, mở trải ra thành tấm, cạo lớp màng phía trên, loại bỏ sạch mạch máu, cắt mẫu mô thành các mảnh nhỏ có kích thước nhỏ khoảng 2 mm2. Rửa mẫu mô trong nước muối sinh lý vô trùng từ 2 - 3 lần, trải vào bình nuôi (flasks 75 cm2). Bổ sung vào bình nuôi 8 ml môi trường MSC Cult Clinic completed (RegenmedLab, Việt Nam), lắc nhẹ cho mẫu mô dàn đều mà không cụm lại với nhau. Nuôi cấy ở nhiệt độ 37ºC, 5% C02. Theo dõi khả năng bám dính của mẫu mô sau 24 giờ và 72 giờ trải mẫu. Thay môi trường 3 ngày/lần. Đến khi tế bào xuất hiện, mọc dày bao quanh mảnh mô, tiến hành tách tế bào và chuyển qua các bình nuôi mới để nuôi và tiếp tục nuôi cấy mẫu mô trong bình nuôi chứa môi trường MSC Cult Clinic completed mới. * Nuôi cấy TBGTM: Nuôi TBGTM trong môi trường MSC Cult, thay môi trường 3 ngày/lần và tiến hành cấy chuyền khi tế bào bám dính, tăng sinh mật độ đạt khoảng 70 - 80% diện tích bề mặt bình nuôi cấy. Tách tế bào bằng enzym Detachment (RegenmedLab, Việt Nam), ly tâm ở tốc độ 2.500 vòng/ 5 phút. Tiến hành cấy chuyển tế bào với tỷ lệ 1:2 hoặc 1:3, cấy chuyển TBGTM tới lần cấy chuyển thứ 4. * Đánh giá chất lượng quần thể tế bào phân lập: Tế bào được nuôi cấy và phân lập theo quy trình tại Phòng Thí nghiệm Tế bào gốc, Đơn vị Tế bào gốc Vạn Hạnh. Chuyển mẫu kiểm tra, đánh giá chất lượng độc lập tại Viện Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. * Xác định các dấu ấn của TBGTM: Xác định dấu ấn của tế bào gốc thông qua các kháng nguyên bề mặt tế bào, ở lần cấy chuyển thứ 4 (P4), tế bào được tách ra và nhuộm với panel kháng thể đơn clon kháng CD44, CD73, CD90, CD14, CD45, HLADR. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật flowcytometry trên hệ thống FACS Calibur (Becton Dickinson). T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 25 * Kiểm tra nhiễm sắc thể đồ: Tế bào được nuôi cấy và làm ngừng phân bào tại pha metaphase bằng colcicin. Sau đó, nhuộm với thuốc nhuộm Giemsa và trải tế bào trên lame kính. Quan sát và chụp hình nhiễm sắc thể (NST), sắp xếp các bộ NST sử dụng phần mềm metasystem. NST đồ thực hiện trên lần cấy chuyển thứ 5, khi mật độ tế bào đạt gần 80%, tiến hành thay môi trường mới và bắt đầu kiểm tra NST. Nhuộm G-banding. Nhúng lần lượt mẫu lame trong trypsin 37ºC, PBS lạnh trong 10 giây, thuốc nhuộm Giemsa trong 4 phút. Để mẫu lame 2 phút ở nhiệt độ phòng và dùng bình tia rửa phần thuốc nhuộm thừa. Xử lý tiêu bản bằng hệ thống IKAROS. * Kiểm tra nội độc tố bằng chế phẩm LAL: Nội độc tố (endotoxin) được kiểm tra bằng kỹ thuật tạo gel với Limulus Amebocyte Lysate - LAL (Lonza) theo quy trình của FDA (Mỹ). Trộn đều chế phẩm LAL với mẫu tế bào cần kiểm tra. Sau thời gian ủ 60 phút, cẩn thận lấy từng ống mẫu thử, ghi lại phản ứng trong mỗi ống. Mẫu dương tính với nội độc tố sẽ tạo gel, còn mẫu âm tính thì không. * Kiểm tra mycoplasma: Kiểm tra mycoplasma bằng phương pháp đánh giá hoạt tính enzym đặc hiệu của mycoplasma sử dụng bộ kít MycoAlert mycoplasma detection, kít chứa các cơ chất và chất giải phóng enzym ra khỏi mycoplasma. Những cơ chất sẽ tác động enzym, chuyển ADP thành ATP. Dựa vào đo ATP thông qua kết quả đo mật độ quang với máy Luminometter có thể xác định sự hiện diện hay vắng mặt của mycoplasma. Sau khi đặt các vật liệu thí nghiệm về nhiệt độ phòng, ly tâm 2 ml dịch nuôi tế bào ở 1.500 vòng/5 phút. Chuyển 100 µl dịch huyền phù trong vào cuvetter máy Luminometter, thêm 100 µl dung dịch MycoAlert reagent vào mỗi ống, đợi 5 phút, đọc kết quả Reading A bằng máy Luminometter. Thêm 100 µl MycoAlert substrate vào mỗi mẫu, đợi 10 phút, đọc kết quả Reading B. Xác định sự tồn tại của mycoplasma qua tỷ số Reading B/Reading A như sau: + Nếu B/A < 0,9: kết quả âm tính cho mycoplasma. + Nếu B/A từ 0,9 - 1,2: lặp lại thí nghiệm sau 24 giờ. + Nếu B/A > 1,2: kết quả nhiễm mycoplasma (dương tính). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết quả nuôi cấy mô dây rốn phân lập tế bào gốc: sau 24 giờ các mảnh mẫu mô được nuôi cấy bắt đầu bám dính vào bề mặt bình nuôi cấy, số lượng đạt khoảng 30 - 50%, sau 72 giờ các mẫu mô bám dính hoàn toàn vào bề mặt bình nuôi cấy và sau 5 - 7 ngày, các tế bào di cư xuất hiện ra tại rìa mảnh mô (hình 1A). T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 26 Hình 1: Sự di cư của TBGTM từ mẫu mô dây rốn trong thời gian nuôi cấy 5 - 21 ngày. (Hình 1A: Sau 7 ngày nuôi; hình 1B: Sau 10 ngày nuôi; hình 1C: Sau 14 ngày nuôi; hình 1D: Tế bào P1 sau 4 ngày cấy chuyển) TBGTM thu được từ mẫu mô dây rốn có khả năng bám dính trên bề mặt dụng cụ nuôi cấy, dạng thuôn dài gần giống với hình dạng của nguyên bào sợi (hình 1D). Sau 14 - 21 ngày, tế bào trong bình mô nuôi cấy trải đều, mật độ đạt khoảng 70%, đây là thời điểm có thể tiến hành đợt cấy chuyền đầu tiên (P0 cấy ra P1) (hình 1B-C). Bảng 1: Kết quả kiểm tra các marker của TBGTM từ mô dây rốn bằng flowcytometry. Marker dương tính (%) Marker âm tính (%) Mẫu TBGTM từ mô dây rốn CD44 CD73 CD90 CD14 CD45 HLADR Mẫu 1 95,64 97,50 98,57 5,98 3,80 0,24 Mẫu 2 99,94 99,74 99,86 0,73 0,06 0,01 Mẫu 3 99,94 98,21 99,77 0,72 0,26 0 Mẫu 4 99,64 96,65 98,02 4,81 0,38 0,51 Mẫu 5 99,7 99,37 99,63 3,04 4,33 0,64 A B D C T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 27 Hình 2: Khảo sát các dấu ấn của TBGTM từ mô dây rốn bằng flowcytometry (mẫu 2). Về biểu hiện dấu ấn của TBGTM, kết quả dương tính cao (> 95%) với các marker CD44, CD73, CD90 và âm tính với các marker CD14, CD45, HLADR (< 5%) ở cả 5 mẫu dây rốn khảo sát (bảng 1, hình 2). Đây là một kết quả khả quan về hiệu quả phân lập TBGTM từ mô dây rốn theo tiêu chuẩn định danh TBGTM theo kiểu hình miễn dịch tế bào. Theo kết quả công bố của Hội Liệu pháp tế bào quốc tế, TBGTM từ mô dây rốn vẫn giữ được tính gốc tính tới lần cấy chuyển thứ 15. Tuy nhiên, trong nghiên cứu gần đây của De Witte S.F và CS (2017) khảo sát về tính ổn định của kiểu hình và chức năng của TBGTM qua các giai đoạn cấy chuyền lần thứ 4, lần thứ 8 và lần thứ 12 cho thấy, không có sự thay đổi đáng kể về kiểu hình miễn dịch TBGTM nhưng khả năng điều biến miễn dịch, định hướng tế bào T cảm ứng biệt hóa thành tế bào TCD4+ và TCD8+ suy giảm [5]. Vì vậy, để đảm bảo chất lượng TBGTM ổn định về hình thái, chức năng cảm ứng và điều biến miễn dịch, tế bào sử dụng cho ứng dụng thử nghiệm lâm sàng, nghiên cứu của chúng tôi dự kiến giới hạn sử dụng tế bào ở lần cấy chuyển thứ 4. Từ đó các mẫu TBGTM được kiểm tra tính ổn định ở lần cấy chuyển thứ 5 tiếp đó. Kết quả cho thấy, không có biến động về số lượng NST của tế bào (2n = 46) sau 5 lần cấy chuyển liên tiếp ở tất cả các mẫu tế bào được phân lập và nuôi cấy. Bên cạnh đó còn đánh giá tính an toàn của việc nuôi cấy TBGTM mô dây rốn qua kết quả kiểm tra nội độc tố và mycoplasma. Vì đây là 2 tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng điều trị và có khả năng biến động trong quá trình nuôi cấy. Kết quả các mẫu TBGTM từ mô dây rốn (n = 5) phân lập được trong quá trình nuôi cấy: không có mẫu nào nhiễm nội độc tố và mycoplasma. 0.73 % 0.06 % 0.01 % 99.94 99.74 99.86 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 28 Bảng 2: Kết quả kiểm tra nội độc tố bằng chế phẩm LAL. Mẫu TBGTM Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Kết quả Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Bảng 3: Kết quả kiểm tra mycoplasma. Mẫu TBGTM Tỷ số B/A Kết quả Mẫu 1 0,75692 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 2 0,2 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 3 0.77747 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 4 0.15242 Không nhiễm mycoplasma Mẫu 5 0.15929 Không nhiễm mycoplasma Kiểm tra nội độc tố bằng chế phẩm LAL từ 5 mẫu TBGTM dây rốn đều cho kết quả âm tính, không có sự tạo gel từ các mẫu kiểm (bảng 2). Kiểm tra mycoplasma cũng cho kết quả tất cả các mẫu đều âm tính (bảng 3). Đây là hai thông số quan trọng xác định tính an toàn của sản phẩm tế bào sử dụng cho BN trong điều trị lâm sàng hiện nay theo tiêu chuẩn của FDA (Mỹ). Kết quả này cho thấy quy trình phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô dây rốn của chúng tôi hoàn toàn phù hợp. Tế bào gốc phân lập và nuôi cấy được đạt tiêu chuẩn để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng liệu pháp tế bào trong thử nghiệm và điều trị lâm sàng. Kết quả này mở ra một hướng đi mới về tiềm năng ứng dụng của TBGTM từ mô dây rốn trong điều trị lâm sàng. KẾT LUẬN Đã phân lập và nuôi cấy được TBGTM từ mô dây rốn, các tế bào có khả năng bám dính, có hình dạng giống nguyên bào sợi, biểu hiện dương tính (> 95%) với các dấu ấn của TBGTM CD44, CD73, CD90, ổn định về bộ NST, tế bào đảm bảo tính an toàn không nhiễm nội độc tố, mycoplasma, đạt yêu cầu để sử dụng cho nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị lâm sàng. Lời cảm ơn Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài mã số KC.10.15/16-20. Nhóm tác giả trân trọng cảm ơn những người đã tình nguyện tham gia nghiên cứu, Học viện Quân y, Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh và Viện Tế bào gốc đã ủng hộ, tạo điều kiện và tích cực hợp tác trong quá trình nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Caplan A.I, S.P Bruder. Mesenchymal stem cells: Building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends in Molecular Medicine. 2001, 7 (6), pp.259-264. 2. Romanov Y.A, V.A Svintsitskaya, V.N Smirnov. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: Candidate MSC-like cells from umbilical cord. Stem Cells. 2003, 21 (1), pp.105-110. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 29 3. Dalous J, J Larghero, O Baud. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: Technical aspects, preclinical studies and clinical perspectives. Pediatric Research. 2012, 71 (4-2), p.482. 4. Gnecchi M, L.G Melo. Bone marrow- derived mesenchymal stem cells: Isolation, expansion, characterization, viral transduction and production of conditioned medium, in Stem Cells in Regenerative Medicine. Springer. 2009, pp.281-294. 5. De Witte S.F et al. Aging of bone marrow-and umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells during expansion. Cytotherapy. 2017, 19 (7), pp.798-807. 6. Squillaro T, G Peluso, U Galderisi. Clinical trials with mesenchymal stem cells: An update. Cell Transplantation. 2016, 25 (5), pp.829-848. 7. Marofi F et al. Mesenchymal stromal/stem cells: A new era in the cell-based targeted gene therapy of cancer. Frontiers in Immunology. 2017, p.8. 8. Can A, F.T Celikkan, O Cinar. Umbilical cord mesenchymal stromal cell transplantations: A systemic analysis of clinical trials. Cytotherapy. 2017, 19 (12), pp.1351-1382.