Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic để sản xuất thử nghiệm giấm ăn từ nguyên liệu chuối tiêu (musa acuminata colla) bằng phương pháp lên men nhanh

98 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ACID ACETIC ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM GIẤM ĂN TỪ NGUYÊN LIỆU CHUỐI TIÊU (Musa acuminata Colla) BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN NHANH ISOLATION AND SELECTION OF ACETIC ACID BACTERIA FOR THE TRIAL PRODUCTION OF VINEGAR FROM BANANAS (Musa acuminata Colla) USING RAPID FERMENTATION Bùi Văn Tú, Nguyễn Đức Thắng Email: buitu2802@gmail.com Trường Đại học Sao Đỏ Ngày nhận bài: 16/8/2018 Ngày nhận bài sửa sau phản biện: 21/9/2018 Ngày chấp nhận đăng: 28/9/2018 Tóm tắt Acid acetic là một acid hữu cơ quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm. Mục đích của nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn acetic có khả năng tạo nhiều acid acetic và xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men. Phân lập được thực hiện trong môi trường YPGD bổ sung 4,0% (v/v) ethanol, 0,5% CaCO3 (w/v). Kết quả đã tuyển chọn được 01 loài vi khuẩn được dự đoán là Acetobacter tropicalis và được đặt tên là chủng A. tropicalis SĐ01. Chủng này tạo vòng halo có kích thước lớn và thích nghi tốt với môi trường dịch ép chuối. Mối quan hệ giữa các giá trị pH lên men, thời gian lên men, tỷ lệ men cái/nguyên liệu và nồng độ ethanol với hàm lượng acid acetic được khảo sát và xác định thông qua phương pháp đáp ứng bề mặt. Kết quả khảo sát điều kiện lên men acid acetic của chủng Acetobacter tropicalis ở nhiệt độ phòng (26÷28oC), nồng độ ethanol của dịch lên men là 4,4%, pH lên men là 6,5, thời gian lên men là 9 ngày, tỷ lệ giống/nguyên liệu là 6,0% (men cái có mật độ vi khuẩn là 107 TB/ml). Lượng acid acetic được tạo thành là 3,32%. Từ khóa: Acetobacter; acid acetic; lên men acid acetic; vi khuẩn acetic; chuối. Astract Acetic acid is an important organic acid that is widely used in many fields, especially in food industry. The purpose of the study is to isolate and select acetic acid bacteria that could produce high level of acetic acid and determine the factors affecting fermentation. Isolation was performed in a YPGD medium supplemented with 4.0% (v/v) ethanol, 0.5% CaCO3 (w/v). One strain was isolated and predicted as Acetobacter tropicalis and designated as A. tropicalis SĐ01. This strain is able to create a large halo ring and adapt to banana material. The relationship or corelation between factors: fermentation pH, fermentation time, yeast / material ratio and ethanol concentration with acetic acid was investigated by response surface methodology. The parameters were determined as follows: fermentation at room temperature (26÷28oC), fermentation ethanol concentration 4.4%, pH 6.5, fermentation time of 9 days, the rate of seed / material is 6.0% (female yeast has a bacterial density of 107 TB/ml). The amount of acetic acid formed is 3.32%. Keywords: Acetobacter; acid acetic; acid acetic fermentation; acetic bacteria; banana. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam từ xa xưa, giấm được sử dụng như một gia vị trong ẩm thực và ngày nay giấm được ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống. Nó không chỉ được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm mà còn được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp nhẹ, y học và một số loại mỹ phẩm dành cho phái đẹp. Giấm là loại gia vị truyền thống có tính acid, được sản xuất rộng rãi từ gạo, mạch nha, táo, các dạng rượu vang khác nhau và các vật liệu nông nghiệp (Horiuchi và cộng sự, 1999) [2]. Quá trình lên men giấm cơ bản là quá trình hai giai đoạn với giai đoạn đầu tiên là chuyển đổi kỵ khí các loại đường lên men thành ethanol bằng Người phản biện: 1. PGS.TS. Phan Thanh Tâm 2. TS. Bùi Văn Ngọc 99 LIÊN NGÀNH HÓA HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 nấm men, sử dụng loài Saccharomyces, và thứ hai là quá trình oxy hóa hiếu khí ethanol do vi khuẩn, thường loài Acetobacter (Horiuchi và cộng sự, 2000) [3]. Giấm chuối có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, tốt cho sức khoẻ, ngoài ra còn có tác dụng làm đẹp. Acid acetic có thể được chế biến từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như mật rỉ, nước hoa quả chín, tinh bột, cồn... và được ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm như giấm, sorbose, dihydroxyacetone, gluconate, keto-D- gluconates... [14]. Việt Nam là một nước thuộc khu vực nhiệt đới nên rất dồi dào về các nguồn nguyên liệu có thể ứng dụng trong sản xuất acid acetic. Chuối có sản lượng cao, giá thấp và có thời gian sử dụng ngắn, nhanh chóng suy giảm với tỷ lệ lớn sau thu hoạch. Lượng vitamin và khoáng chất, đặc biệt là kali, vitamin B6, vitamin C dồi dào [12]. Trong báo cáo tổng hợp từ các nghiên cứu, tiêu thụ 1,3÷1,4 g kali mỗi ngày sẽ giảm được 26% nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Catechin cũng đã được tìm thấy trong chuối và được chứng minh là đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch [14]. Vi khuẩn acetic thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, với khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic cho phép chúng có thể sinh trưởng ở các môi trường có chứa ethanol [1]. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Chuối Cây chuối tiêu thuộc bộ Scitaminales, họ Musaceae, họ phụ Musoidae, chi Musa. Chuối được sử dụng là chuối tiêu được trồng tại khu vực Chí Linh, Hải Dương. Yêu cầu kĩ thuật: Chuối có màu vàng đặc trưng, không bị hỏng, không bị thối, Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát. Hình 1. Chuối tiêu (Musa acuminata Colla) 2.1.2. Nước Sử dụng nước ở xưởng nước Khoa Thực phẩm và Hóa học, Trường Đại học Sao Đỏ. Đạt QCVN 6-1:2010/BYT đối với nước khoáng thiên nhiên và nước uống đóng chai. 2.1.3. Rượu Sản xuất tại Công ty cổ phần Cồn Rượu Hà Nội. Địa chỉ: 94 Lò Đúc, Phạm Đình Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội. Đảm bảo theo QCVN 6-3:2010/BYT. 2.1.4. Môi trường đệm: CH3COOH/CH3COONa Dung dịch được pha theo TCVN 4320-86, đủ điều kiện dùng trong thực phẩm. 2.1.5. Chất bảo quản: sorbate kali Yêu cầu: Sorbate kali ở dạng sùn, màu trắng, mùi đặc trưng dùng trong phụ gia thực phẩm, độ tinh khiết cao, đảm bảo tiêu chuẩn được dùng trong thực phẩm và đồ uống. Xuất xứ: Trung Quốc. 2.1.6. Enzyme pectinase Ảnh hưởng của pH: phạm vi hoạt động là pH từ 3,0 đến 5,0; pH tối ưu là pH từ 3,5 đến 4,0. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ hiệu dụng từ 25 đến 65oC, phạm vi nhiệt độ tối ưu là từ 40 đến 55oC. Enzyme pectinase có thể phá vỡ thành tế bào của trái cây và làm giảm độ nhớt của nước trái cây, tăng tốc độ quá trình lọc, giảm thời gian chế biến tăng cường trái cây, giảm chi phí, nâng cao chất lượng sản phẩm. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu thập mẫu để phân lập vi khuẩn acetic Ba mẫu dịch lên men từ quả được thu thập bao gồm: Mẫu dịch lên men chuối; mẫu dịch lên men mơ; mẫu dịch lên men tự nhiên được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm Trường Đại học Sao Đỏ bằng cách chuẩn bị dịch chuối, thêm nước, rượu loãng, mở nắp và để ở điều kiện thường. Vi khuẩn acid acetic được phân lập như sau: pha loãng dịch lên men chuối đến nồng độ thích hợp rồi cấy trải trên môi trường Yeast extract Peptone Glycerol D-glucose (YPGD: yeast extract 5 g/l, peptone 5 g/l, glycerol 5 g/l và D-glucose 5 g/l) có bổ sung 4% v/v ethanol, 2% agar và 0,5% CaCO3. Lấy 5 ml mẫu cho vào môi trường, ủ ở 30oC trong 1÷2 ngày, ủ ở 30°C trong 2÷3 ngày, cấy chuyển nhiều lần đến khi khuẩn lạc đạt độ thuần nhất. Chọn các khuẩn lạc tạo vòng halo trên môi trường là vi khuẩn acid acetic. Quan sát dưới kính hiển vi để xác định độ đồng nhất của tế bào vi khuẩn. 2.2.2. Phân lập, tuyển chọn dòng vi khuẩn lên men acetic mạnh Cấy ria các dòng vi khuẩn lên môi trường YPGD có bổ sung 0,5% CaCO3 và 4% ethanol, ủ ở 30ºC trong 24÷48 h, xác định tỉ lệ đường kính vòng halo trên đường kính khuẩn lạc, chọn dòng vi khuẩn có tỉ lệ lớn nhất. Thí nghiệm được lặp lại ba lần. 100 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 Phương pháp định danh vi khuẩn dựa vào hình thái: Quan sát khuẩn lạc bằng mắt thường. Quan sát khả năng di động bằng cách làm tiêu bản giọt treo. Làm tiêu bản vi khuẩn không nhuộm màu và nhuộm Gram theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram, soi dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 100. Dự đoán tên vi khuẩn bằng hình thái dựa trên miêu tả của nhiều nguồn tài liệu (Nguyễn Lân Dũng, 1976 [8]; Nguyễn Đức Lượng, 2006 [7]; Nicholas Camu, 2007 [9]; Schwan RF, Wheals AE, 2004 [13]. 2.2.3. Bố trí nghiệm xác định phương pháp xử lý trước khi ép Chuối sau khi thu mua về được bóc vỏ, hấp, cân mẫu. Mỗi mẫu cân 100 g quả. Mẫu thứ nhất được cấp đông chậm ở t = -25oC, τ = 6 giờ. Mẫu thứ hai sử dụng enzyme pectinase với nồng độ 0,1% (w/w), τ = 2 giờ, nhiệt độ phòng. Các mẫu trên được thêm 150 ml nước đem đi ép để thu dịch và tính toán hiệu quả. Bên cạnh hai cách đó ta sử dụng phương pháp thu dịch ép thông thường để ép thu dịch và so sánh hiệu quả ép với hai phương pháp trên. 2.2.4. Bố trí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) được lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện lên men. Bốn thông số quan trọng của quá trình chiết được nghiên cứu bao gồm: pH lên men (X1), thời gian lên men (X2), tỉ lệ men cái/nguyên liệu (X3) và nồng độ ethanol (X4). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu trực tâm quay (Rotatable Central Composite Design) và ma trận thí nghiệm được xây dựng bằng phần mềm Design Expert 11.0. Trong các nghiên cứu thăm dò, chúng tôi đã xác định được giá trị biên của các nhân tố chiết như trình bày trong bảng 1. Trong số 27 thí nghiệm được tiến hành (bảng 5), 16 (24) thí nghiệm ở hai mức (trên và dưới), 8(2 × 4) thí nghiệm ở điểm sao và 3 thí nghiệm ở tâm. Mỗi thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Mô hình toán học mô tả ảnh hưởng của các biến độc lập đối với biến phụ thuộc có dạng hàm đa thức bậc hai có dạng tổng quát như sau: 4 4 4 2 0 1 , 1 1 k j j ij i j ij j j i j j Y B B X B X X B B = = = = + +∑ ∑ ∑ trong đó: Yk : biến phụ thuộc (k = 1 ÷ 4); Xi,j: nhân tố mã hóa của biến độc lập ảnh hưởng đến Yk; B0: hệ số hồi qui bậc 0; Bj: hệ số hồi qui bậc 1 mô tả ảnh hưởng của biến Xj đến Yk; Bij: hệ số ảnh hưởng đồng thời của biến Xi và Xj đến Yk; Bjj: hệ số hồi qui bậc hai mô tả ảnh hưởng của biến X2j đến Yk. Bảng 1. Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập Tên biến Mức nghiên cứu Biến thực Biến mã - α - 1 0 + 1 + α a X1: pH lên men U1 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 X2: Thời gian lên men (ngày) U2 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0 X3: Tỉ lệ men cái/nguyên liệu (%) U3 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 X4: Nồng độ ethanol (%) U4 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 Ghi chú: α = 2, Umax, Umin là giá trị cận trên (+1) và cận dưới (-1) của biến độc lập, U0 = (Umin + Umax)/2 là giá trị trung bình của cận trên và cận dưới. Nguyên liệu chuối được xử lý bằng pectinase, sau đó tiếp tục được thêm nước sao cho tỷ lệ nguyên liệu/nước tương ứng là 1/2. Quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ phòng (26÷28oC). Mật độ tế bào của dịch men cái là 107 TB/ml. pH trong quá trình lên men được ổn định bằng hệ đệm acetat. 2.3. Phương pháp phân tích 2.3.1. Phương pháp cảm quan Kiểm tra chất lượng cảm quan theo tiêu chuẩn TCVN 3215:79. Tiêu chuẩn sử dụng hệ 20 điểm xây dựng trên một thang thống nhất có 6 bậc (từ 0 đến 5) và điểm 5 là điểm cao nhất cho một chỉ tiêu. Các chỉ tiêu được lựa chọn là màu sắc và độ trong 101 LIÊN NGÀNH HÓA HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 (hệ số quan trọng 0,8), mùi (hệ số quan trọng 1,2), vị (hệ số quan trọng 2,0). 2.3.2. Phương pháp xác định hiệu quả ép dịch Cân (m) quả, bóc vỏ, bổ sung v1 (ml) dung dịch đệm cho vào máy xay xay nhuyễn rồi bổ sung 0,2% enzyme để ủ ở to = 45oC, τ = 2 giờ. Lượng dịch thu được khi bổ sung enzyme và ủ ở nhiệt độ và thời gian như trên v (ml) trừ đi số mililit dung dịch đệm ban đầu cho vào cùng với 100 g chuối ta thu được số mililit dịch chuối. Từ đó ta tính được hiệu quả ép dịch. Hiệu quả ép dịch: hq= (% v/w) 2.3.3. Phương pháp phân tích Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Xác định hàm lượng ethanol bằng cách sử dụng cồn kế với rượu trắng theo TCVN 8008:2009. Hàm lượng acid của dịch lên men được xác định bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1 N. pH được xác định bằng pH kế (Sartorius, PB-20, Đức). Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. Xác định đường tổng số bằng phương pháp Bertrand. 2.4. Thiết bị lên men Thiết bị lên men gồm: Thân thiết bị được chia hai phần: phần dưới chứa dịch lên men, phần trên chứa chất mang và vi khuẩn acetic là nơi lên men giấm. Máy bơm (AC 240 V; 50/60 Hz; 24 Vdc; 1,2 A; 110 psi). Thiết bị sục khí (AC 220-240 V; 50 Hz; 3 W; 0,02 MPa; 0,017 A). 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nhận được là giá trị trung bình của ba lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel. Các thí nghiệm được thiết kế và xử lý bằng phần mềm Design Expert 11.0. Phân tích ANOVA được tiến hành bằng phần mềm SPSS17.0. SPSS (Statistical Product and Services Solutions). 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập Bảng 2. Kết quả phân lập vi khuẩn acetic Loại vi khuẩn Hình dạng khuẩn lạc Hình thái tế bào Loại màu trắng sữa Tròn, đều, tạo vành, bóng ướt, bề mặt nhẵn, màu trắng sữa Gram âm, hình que ngắn, que dài, tế bào kết thành cụm hoặc đứng riêng rẽ a) b) c) Hình 2. Hình thái tế bào và khuẩn lạc chủng Acetobacter tropicalis SĐ1 phân lập được Nicholas Camu (2007) [9]; Schuwan và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và định danh được Acetobacter tropicalis với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào: Gram âm, hình hạt, hình trụ ngắn, tế bào kết thành đôi, hình cụm hoặc đứng riêng rẽ. Khuẩn lạc tròn, đều, bóng ướt, bề mặt lồi, màu trắng sữa. Từ những đặc điểm như vậy, so sánh với hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào của vi khuẩn trong nghiên cứu phân lập được, sơ bộ dự đoán vi khuẩn màu trắng là vi khuẩn Acetobacter tropicalis. 3.2. Kết quả xác định phương pháp xử lý nguyên liệu trước khi ép Bảng 3. Bảng kết quả xác định phương pháp xử lý nguyên liệu trước khi ép Các phương pháp xử lý nguyên liệu trước khi ép Số ml dịch ép/100 g thịt quả Độ Bx Đông chậm 50,4 8,5 Pectinase 60,7 8,7 Đối chứng 40,8 8,1 102 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 Hình 3. Đồ thị ảnh hưởng của các phương pháp ép đến lượng dịch thu được Kết quả xử lý thu dịch cho thấy số mililit dịch ép thu được ở mẫu xử lý enzyme là lớn nhất (60,7 ml/100 g thịt quả), thứ hai là mẫu được cấp đông chậm (50,4 ml), mẫu đối chứng (40,8 ml). Lý thuyết lạnh đông đã chứng minh khi cấp đông chậm, các tinh thể đá có kích thước lớn hình thành sẽ làm rách màng tế bào, phá vỡ cấu trúc tế bào, tạo ra các lỗ màng tế bào lớn làm cho dịch quả thoát ra ngoài. Lượng dịch thu được ở phương pháp này cũng tương đối nhiều, màu sắc, hương vị của dịch thu được cũng tốt. Tuy vậy, khi sử dụng phương pháp chậm đông thì thời gian chậm đông lâu nên rất tốn thời gian và chi phí cho quá trình chậm đông lớn. Enzyme pectinase có tác dụng làm phá vỡ thành tế bào của nguyên liệu quả. Tế bào thực vật được cấu tạo bằng vỏ tế bào (thành tế bào). Vỏ tế bào như một lớp bảo vệ rất hữu hiệu và tạo hình cho tế bào. Ở vỏ tế bào thực vật có nhiều chất pectin, các chất pectin được xem như chất ciment gắn các tế bào với nhau. Phá vỡ sự gắn kết này sẽ tạo điều kiện cho các vật chất trong tế bào thoát ra khỏi tế bào. Xử lý thống kê bằng SPSS 17.0 hiệu quả thu dịch cho thấy có sự sai khác có ý nghĩa với hai phương pháp còn lại (α = 0,05). Do vậy, chọn phương pháp xử lý nguyên liệu bằng enzyme cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3. Kết quả xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men acid Ảnh hưởng của các nhân tố X1 (pH), X2 (thời gian lên men, ngày), X3 (tỷ lệ men cái/nguyên liệu), X4 (nồng độ ethanol) được trình bày ở bảng 4 và hình 4. Bảng 4. Kết quả bố trí thí nghiệm đầy đủ theo phương pháp bề mặt đáp ứng TT Biến mã hóa Biến thực Nồng độ acetic (%) Điểm cảm quan U1 U2 U3 U4 X1 X2 X3 X4 1 -1 -1 -1 -1 4,5 5 2 4 2,50 14,7 2 1 -1 -1 -1 6,5 5 2 4 3,10 18,0 3 -1 1 -1 -1 4,5 9 2 4 2,71 16,5 4 1 1 -1 -1 6,5 9 2 4 3,21 18,4 5 -1 -1 1 -1 4,5 5 6 4 2,78 16,6 6 1 -1 1 -1 6,5 5 6 4 3,21 18,4 7 -1 1 1 -1 4,5 9 6 4 2,80 17,0 8 1 1 1 -1 6,5 9 6 4 3,36 18,8 9 -1 -1 -1 1 4,5 5 2 6 2,58 14,9 10 1 -1 -1 1 6,5 5 2 6 2,85 16,9 11 -1 1 -1 1 4,5 9 2 6 2,63 15,2 12 1 1 -1 1 6,5 9 2 6 3,11 17,9 13 -1 -1 1 1 4,5 5 6 6 2,65 15,3 14 1 -1 1 1 6,5 5 6 6 3,21 18,3 15 -1 1 1 1 4,5 9 6 6 2,72 16,1 16 1 1 1 1 6,5 9 6 6 3,20 18,1 17* -2 0 0 0 3,5 7 4 5 2,53 14,5 18* 2 0 0 0 7,5 7 4 5 3,34 18,6 19* 0 -2 0 0 5,5 3 4 5 2,72 15,8 20* 0 2 0 0 5,5 11 4 5 2,92 17,7 21* 0 0 -2 0 5,5 7 0 5 2,87 17,3 22* 0 0 2 0 5,5 7 8 5 3,10 17,8 103 LIÊN NGÀNH HÓA HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 23* 0 0 0 -2 5,5 7 4 3 2,72 15,6 24* 0 0 0 2 5,5 7 4 7 2,48 14,3 25t 0 0 0 0 5,5 7 4 5 2,95 17,7 26 t 0 0 0 0 5,5 7 4 5 2,88 17,4 27 t 0 0 0 0 5,5 7 4 5 2,87 17,2 Ghi chú: (*) thí nghiệm được tiến hành ở điểm sao; (t) thí nghiệm được tiến hành ở điểm tâm. Hình 4. Ảnh hưởng tương tác của các yếu tố (X1, X2, X3, X4) đến hàm mục tiêu Kết quả cho thấy cả bốn yếu tố đều ảnh hưởng đến hàm mục tiêu là nồng độ acid. Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với lý thuyết về lên men bởi vi khuẩn. Theo đó, các nhân tố là pH lên men, thời gian lên men, tỷ lệ men cái/nguyên liệu, nồng độ ethanol đều có ảnh hưởng đến việc tạo thành acid acetic. Kết quả cũng chỉ ra, cả bốn yếu tố đều có tương tác với nhau và tương tác đến hàm mục tiêu. Cụ thể, yếu tố X1 (pH), X2 (thời gian lên men), X3 (tỷ lệ men cái/nguyên liệu) có ảnh hưởng đồng biến đến hàm mục tiêu, yếu tố X4 (nồng độ ethanol) có ảnh hưởng nghịch biến với hàm mục tiêu. Điều này có nghĩa là, trong phạm vi nghiên cứu khi tăng giá trị pH, tăng thời gian TT Biến mã hóa Biến thực Nồng độ acetic (%) Điểm cảm quan U1 U2 U3 U4 X1 X2 X3 X4 104 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 lên men, tăng tỷ lệ men cái bổ sung vào thì hàm lượng acid được tạo thành càng lớn. Ngược lại, khi tăng lượng ethanol vào môi trường lên men thì quá trình lên men sẽ bị ức chế, lượng acid tạo thành giảm. 3.4. Tối ưu hóa một số điều kiện lên men Bảng 5 trình bày kết quả phân tích phương sai (ANOVA) ảnh hưởng của các nhân tố đến hàm mục tiêu là hàm lượng acid acetic. Kết quả cho thấy các biến X1, X2, X3, X4, X 2 3, X 2 4 đều có ảnh hưởng đến hàm mục tiêu (p<0,05). Các biến khác (p>0,05) mặc dù không ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu (xem bảng 5), tuy nhiên vì các biến đơn có ảnh hưởng đáng kể nên được giữ lại trong mô hình để phục vụ cho việc tối ưu hóa. Bảng 5. Bảng phân tích phương sai (ANOVA) của các nhân tố đến hàm mục tiêu Source Sum of Squares df Mean Square F-value p-value Model 1,70 14 0,1213 19,13 < 0,0001 significant A-pH 1,25 1 1,25 197,19 < 0,0001 B-Thời gian lên men 0,0656 1 0,0656 10,35 0,0074 C-Tỷ lệ men cái /nguyên liệu 0,1219 1 0,1219 19,22 0,0009 D-Nồng độ Ethanol 0,0602 1 0,0602 9,50 0,0095 AB 0,0013 1 0,0013 0,2044 0,6592 AC 0,0018 1 0,0018 0,2899 0,6001 AD 0,0060 1 0,0060 0,9456 0,3500 BC 0,0104 1 0,0104 1,63 0,2255 BD 0,0009 1 0,0009 0,1430 0,7119 CD 6,419E-06 1 6,419E-06 0,0010 0,9751 A² 0,0102 1 0,0102 1,61 0,2282 B² 0,0008 1 0,0008 0,1204 0,7346 C² 0,0272 1 0,0272 4,29 0,0405 D² 0,0821 1 0,0821 12,94 0,0037 Residual 0,0761 12 0,0063 Lack of Fit 0,0725 10 0,0072 4,00 0,2167 not significant Pure Error 0,0036 2 0,0018 Cor Total 1,77 26 Tiến hành xử lý bằng phần mềm Design Expert 11.0 thu được mô hình toán học như sau: Y=2,90 + 0,2283X1 + 0,0523X2 + 0,0713X3 – 0,0501X4 + 0,0090X1X2 + 0,0107X1X3 – 0,0194X1X4–0,0254X2X3 – 0,0075X2X4 – 0,0006X3X4 + 0,0357X3 2 – 0,0560X4 2. Giá trị p kiểm định không tương thích (lack of fit) của mô hình là 0,2167 > p=0,05. Do đó, mô hình hồi quy là tương thích với thực nghiệm. Bằng việc tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert 11.0 thu được giá trị tối ưu ứng với cực đại của hàm mục tiêu như sau: X1 = 6,5; X2 = 9, ngày; X3 = 6,0%; X4 = 4,4%. Lượng acid acetic được tạo thành là 3,32%. Hình 5. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm mục tiêu là nồng độ acetic 105 LIÊN NGÀNH HÓA HỌC - CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 Điều kiện lên men và hàm lượng acid acetic cũng được nghiên cứu và công bố bởi một số tác giả. Trịnh Nguyệt Trân và cộng sự [15] đã xác định các điều kiện lên men giấm từ dịch quả sơri với tỷ lệ giống là 1% (v/v) A. senegalensis và 1% (v/v/) Saccharomyces cerevisiae, mật số giống chủng ban đầu tương ứng 105 tb/ml và 107 tb/ml, dịch quả sơri với nồng độ chất khô hòa tan là 10º Brix và pH 5,0 thu được sản phẩm giấm sơri có hàm lượng acid đạt 6,99% (w/v) sau 8 ngày lên men ở 28÷32°C.Huỳnh Xuân Phong và cộng sự [4] đã lên men acid acetic với chủng A. sicerae A18 ở 39°C, nồng độ ethanol ban đầu 4,32%, pH 4,0 và số lượng tế bào giống vi khuẩn là 105 tb/ml, hàm lượng acid acetic đạt 2,61% (w/v). Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Gullo và cộng sự [6], Beheshti và cộng sự [5] về khả năng phát triển tốt của các chủng vi khuẩn acetic ở môi trường có bổ sung 5% (v/v) ethanol với hiệu suất chuyển hóa ethanol thành acid acetic là cao nhất. Với chủng A. tropicalis DK4 được Phong và cộng sự [11] công bố hàm lượng acid đạt 2,52% (w/v) vào ngày thứ bảy trong môi trường YPGD bổ sung 4% (v/v) ethanol ở 39°C. Kết luận của Phạm Hồng Quang và cộng sự [10] xác định loài Acetobater aceti cho khả năng lên men cao Dịch lên men đạt nồng độ acid cao sau 7÷9 ngày lên men ở mật số giống chủng 105 tế bào/ml, nồng độ đường 15ºBx, pH 5,5 và nhiệt độ ủ 30°C. Như vậy, so với nhiều nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, hàm lượng acid acetic trong nghiên cứu thu được ở mức cao hơn khá nhiều. Nghiên cứu cũng so sánh về hàm lượng giấm với giấm toan Hà Nội (1,30%), giấm gạo nếp Hà Nội (2,5%), giấm trắng Trung Thành (2,52%). Sản phẩm sau khi lên men được lọc cặn lơ lửng và bổ sung kali sorbate ở nồng độ là 500 mg/l. Quá trình thanh trùng được tiến hành ở 85oC, thời gian 10 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng và đem bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát, tránh ánh nắng trực tiếp của mặt trời. Hình 6. Sản phẩm giấm chuối 4. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã tuyển chọn được 01 chủng dự đoán là chủng Acetobacter tropicalis SĐ1 và xây dựng được mô hình toán thể hiện mối quan hệ giữa giá trị pH lên men, thời gian lên men, tỷ lệ men cái/nguyên liệu và nồng độ ethanol với hàm lượng acid acetic. Các giá trị tối ưu để thực hiện quá trình lên men như sau: X1 = 6,5; X2 = 9 ngày; X3 = 6,0%; X4 = 4,4%. Lượng acid acetic được tạo thành là 3,32%. Sản phẩm giấm ăn được hội đồng đánh giá cảm quan theo thang điểm 20, hệ số quan trọng 4 đánh giá được 18,7 điểm, đạt loại tốt. Sản phẩm được bổ sung sorbate kali với nồng độ 500 mg/l. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Bùi Ái (2003). Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia. TP. Hồ Chí Minh, trang 53-57. [2]. Horiuchi, J. I., Kanno, T., & Kobayashi, M (1999). New vinegar production from onions. Journal of bioscience and bioengineering, 88(1), pp. 107-109. [3]. Horiuchi, J. I., Kanno, T., & Kobayashi, M (2000). Effective onion vinegar production by a two-step fermentation system. Journal of bioscience and bioengineering, 90(3), pp. 289-293. [4]. Huỳnh Xuân Phong và cộng sự (2017). Tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt ứng dụng trong lên men acid acetic. Tạp chí KHCN Việt Nam, tập 20, số 9, trang 44-49. [5]. M. Gullo, C. Caggia, L.D. Vero and P. G.iudici (2006). Characterization of acetic acid bacteria in traditional balsamic vinegar. International Journal of Food Microbiology, 106(2), pp. 209-212. [6]. M.K. Beheshti, and R. Shafiee (2009). Isolation and identification of an Acetobacter strain from Iranian white-red cherry with high acetic acid productivity as a potential strain for cherry vinegar production in food and agriculture biotechnology. International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, 3(6), pp. 281-283. [7]. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Anh Tuyết (2003). Thí nghiệm công nghệ 106 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Tạp chí Nghiên cứu khoa học - Đại học Sao Đỏ, ISSN 1859-4190. Số 3(62).2018 sinh học, tập 1. NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, trang 45-50. [8]. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạnh, Phạm Văn Tỵ (1976). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2. 303-328, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [9]. Nicholas Camu, Tom De Winter, Kristof Verbrugghe, Lise Cleenwerck. Dynamics and biodiversity of populations of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneoap heap fermentation of cocoa bean in Ghana. Applid environment microbiology, Mar, 2007, pp. 1809-1824. [10]. Phạm Hồng Quang, Nguyễn Vân Sơn, Lê Thị Mỹ Xuyên (2014). Phân lập, tuyển chọn nấm men và vi khuẩn acid acetic thử nghiệm lên men trà thủy sâm (kombucha). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 34 (2014): 12-19. [11]. Phong Huynh Xuan, Chanhom Loinheuang, Gunjana Theeragool, Kazunobu Matsushita, Toshiharu Yakushi (2012). Geographical distribution of thermo-tolerant acetic acid bacteria, Summary Book of Asian Core Program, pp. 77-80, International Exchange Core Program in Yamaguchi University, Yamaguchi, Japan [12]. Pingyi Zhang, Roy L, Whistler, James N, BeMiller. Banana starch: production, physicochemical, and digestibility – a review. [13]. Schwan RF, Wheals AE (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its rule in chocolate quality. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 44(4): 205-221. [14]. Shinichi Someyaa, Yumiko. Antioxidant compounds bananas (Musa cavendish). [15]. Trịnh Nguyệt Trân, Ngô Thị Phương Dung, Nguyễn Ngọc Thạnh, Huỳnh Xuân Phong, Huỳnh Diễm Mi (2016). Tuyển chọn vi khuẩn acetic và ứng dụng trong lên men giấm từ dịch quả sơri. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Số 11, trang: 96-104.