Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas có khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng (Arachis hypogaea L) ở điều kiện mặn

Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 Open Access Full Text Article Bài Nghiên cứu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG-HCM Liên hệ Hoàng Thị ThanhMinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG-HCM Email: httminh@hcmus.edu.vn Lịch sử  Ngày nhận: 30-8-2019  Ngày chấp nhận: 13-11-2019  Ngày đăng: xx-3-2020 DOI :10.32508/stdjns.v4i1.834 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM. Đây là bài báo công bố mở được phát hành theo các điều khoản của the Creative Commons Attribution 4.0 International license. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas có khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) ở điều kiện mặn Chu Nguyên Thanh, Phạm Văn Nhựt Tiếng, Bùi Văn Lệ, Hoàng Thị ThanhMinh* Use your smartphone to scan this QR code and download this article TÓM TẮT Sử dụng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (Plant growth promoting rhizobacteria- PGPR) được xem như là một giải pháp tiềm năng trong việc hỗ trợ thực vật đối phó với stress mặn. Trong số các PGPR, Pseudomonas là chi vi khuẩn sở hữu nhiều cơ chế đa dạng trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật và cảm ứng tính chống chịu với stress sinh học cũng như phi sinh học. Nghiên cứu này chọn lọc được 3 chủng Pseudomonas tiềm năng và đánh giá hiệu quả của chúng trên cây đậu phộng. Cả 3 chủng vi khuẩn được khảo sát đều sở hữu những đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật như sản sinh indole-3-acetic acid (IAA), hòa tan phosphate, cố định đạm. Bên cạnh đó, cả 3 chủng vi khuẩn đều mang gene mã hóa cho 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase là một enzyme có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ thực vật chống chịu với các điều kiện stress khác nhau. Chủng BT00P03 cho thấy tiềm năng khi cải thiện các thông số tăng trưởng của cây đậu phộng trong điều kiện bình thường và stress mặn. Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ chủng vi khuẩn BT00P03 có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật, cho thấy tiềm năng của chúng trong thực hành nông nghiệp bền vững. Nghiên cứu này là tiền đề cho những nghiên cứu mở rộng nhằm tìm hiểu cơ chế tương tác giữa vi khuẩn và thực vật trong điều kiện stress, đồng thời, mở ra hướng đi ứng dụng các chủng vi khuẩn này vào thực hành sản xuất. Từ khoá: cây đậu phộng, PGPR, Pseudomonas, khả năng chống chịu stress mặn GIỚI THIỆU Xâmnhiễmmặn làmột yếu tố nghiêm trọng làmgiảm diện tích đất canh tác nông nghiệp, hạn chế năng suất và chất lượng cây trồng. Trên thế giới có hơn 45 triệu hecta đất đang bị ảnh hưởng bởi nhiễm mặn và mỗi năm diện tích này lại tăng lên 10% - một con số thật đáng lo ngại1. Ở Việt Nam, tình hình đất nhiễmmặn đang ở mức báo động, do sự dâng cao của mực nước biển và hạn hán kéo dài bởi ảnh hưởng của El Nino. Đặc biệt, tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long sự ngăn dòng của các đập thủy điện thượng nguồn sông Mê Kông làm cho tình hình nhiễm mặn càng trở nên nghiêm trọng hơn. Trong các tỉnh bị ảnh hưởng bởi nhiễm mặn, thì Bến Tre được xem như là một điểm nóng về tình trạng này. Hiện trạng trên đặt ra những thách thức, không chỉ trong việc chọn giống cây trồng chịu mặn, mà còn phải cải tạo hệ sinh thái đất thông qua việc tương tác của rễ thực vật với hệ vi sinh vật trong đất nhiễm mặn2. Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (Plant growth promoting rhizobacteria- PGPR) là những vi khuẩn cư trú tại vùng rễ thực vật có khả năng hỗ trợ tăng trưởng và kiểm soát các tác nhân gây bệnh ở thực vật thông qua một loạt các cơ chế khác nhau. Cơ chế kích thích tăng trưởng thực vật của vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện mặn liên quan đến việc sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng như indole-3- acetic acid (IAA); tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cho cây thông qua quá trình hòa tan phos- phate, cố định đạm; giúp cây duy trì cân bằng ion; sinh tổng hợp 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase; cảm ứng sự chống chịu có hệ thống (in- ducing systemic tolerance-IST)3–5. Đậu phộng (Arachis hypogaea) – một loài cây có giá trị kinh tế cao trong nông nghiệp, được xem như là loại cây chủ lực ở các nước có nền kinh tế đang phát triển ở châu Phi và châuÁ.Đậu phộng là cây khá nhạy cảm với stress mặn, vì vậy sự giảm sản lượng của cây đậu phộng trong điều kiện stress mặn là một vấn đề đáng quan tâm5,6. Trước đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn vùng rễ và bước đầu khảo sát hiệu quả trên cây mô hình Arabidopsis 4 . Trong nghiên cứu này, nhóm tập trung vào nhóm vi khuẩn là Pseu- domonas tại vùng ngập mặn Bến Tre nhằm đánh giá, chọn lọc một số vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có Trích dẫn bài báo này: Thanh C N, Tiếng P V N, Lệ B V, Minh H T T. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas có khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) ở điều kiện mặn. Sci. Tech. Dev. J. - Nat. Sci.; 4(1):347-356. 347 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 khả năng kích thích tăng trưởng trên đối tượng cây đậu phộng trong điều kiện stress mặn. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phân lập vi khuẩn Pseudomonas Vi khuẩn được phân lập từ mẫu đất và rễ cây bắp (Zea mays), cây khoai lang (Ipomoea batatas), dừa cạn (Catharanthus roseus) và đậu phộng (Arachis hy- pogaea) được thu nhận từ vùng đất nhiễmmặn thuộc xã An Thủy, huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre. Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng chịu mặn thực hiện theo quy trình đã báo cáo trước đó bởi nhóm nghiên cứu4. Huyền phù thu được từ vùng đất xung quanh rễ (S), dịch rửa siêu âm bềmặt rễ (P) và dịch ly trích rễ sau khi khử trùng bềmặt (E) được trải lênmôi trường King B agar bổ sung 10% NaCl. Sau 48h ủ ở (30  1)oC, các khuẩn lạc phát huỳnh quang dưới đèn UV bước sóng 366 nm được làm thuần và bảo quản bằng kỹ thuật đông sâu ở -70oC. Các chủng đã phân lập sau đó được xác nhận lại bằng kỹ thuật PCR nhằm phát hiện đoạn trình tự rDNA 16S chuyên biệt cho chi Pseudomonas. Vi khuẩn được tăng sinh trênmôi trường Tryptone Soya Broth (TSB) khoảng 18h ở (30  1)oC. Sử dụng bộ kit Rapid Bac- teria Genomic DNA isolation (Bio Basic Inc.) để ly trích gDNA vi khuẩn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng PCR (25 mL) bao gồm 2,5 m l gDNAvi khuẩn; 2,5 mL dung dịch đệmphản ứng PCR (10X); 200 nM mỗi mồi và 1 U i-TaqTM DNA poly- merase (iNtRON). Trình tự mồi xuôi (Psmn289: 5’ – GGTCTGAGAGGATGATCA GT– 3’) và mồi ngược (Psmn1258: 5’ – TTAGCTCCACCTCGCGGC–3’) 7. Chương trình nhiệt của phản ứng gồm 5 phút ở 95oC; 30 chu kỳ (30 giây ở 94oC, 30 giây ở 55oC và 1 phút ở 72oC); 10 phút ở 72oC. Sản phẩm PCR (khoảng 960 bp) sau đó được phát hiện bằng điện di trên gel agarose. Khảo sát các hoạt tính sinh học của các chủng tiềm năng Khảo sát độ chịu mặn: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSB bổ sung NaCl có nồng độ từ 0 đến 24%. Kết quả được ghi nhận sau 1 – 4 ngày nuôi cấy lắc ở 150 vòng/phút, (30 1)oC. Khả năng sinh IAA: Hàm lượng IAA sản sinh bởi vi khuẩn được xác định nhờ phản ứng màu với thuốc thử Salkowski cải tiến 8. Vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở trong môi trường TSB chứa 5% NaCl, có bổ sung 0,1 g/l tryptophan. Sau 5 ngày nuôi cấy lắc ở ở 150 vòng/phút, (30  1)oC, thu 1ml dịch khuẩn, ly tâm loại bỏ sinh khối, bổ sung thuốc thử Salkowski cải tiến với tỷ lệ dịch khuẩn: thuốc thử là 1:2. Ủhỗnhợp trong 1 giờ, phản ứng dương tính sẽ cho màu từ hồng nhạt đến đỏ, đo độ hấp thụ ở bước sóng 530 nm xác định hàm lượng IAA dựa vào đường chuẩn IAA. Khả năng cố định đạm: Thu nhận sinh khối vi khuẩn, rửa nhiều lần với đệm phosphate rồi cấy lên môi trường vô đạm (Nitrogen Free Mineral Medium- MNFM), chứa 3% NaCl9. Ghi nhận những chủng vi khuẩn có khả năng hình thành khuẩn lạc, đổi màu môi trường sau 5 ngày nuôi cấy. Khả năng hòa tan Phosphate: Thu nhận sinh khối vi khuẩn, huyền phù trong đệm phosphate và pha loãng tới giá trị OD600nm = 0,1 (khoảng 108 CFU/ml). Hút 2 m l sinh khối vi khuẩn trong nước muối sinh lý cấy thành 3 điểm trên môi trường thạch PKV 3%NaCl, ủ đĩa ở (30 1)oC.Quan sát sự xuất hiện của vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc và vòng phân giải sau 7 ngày nuôi cấy10. Chỉ số hòa tan phosphate (SI: solubilization Index) sau 7 ngày được tính theo công thức: SI= Đường kính vòng phân giải/ Đường kính khuẩn lạc Kiểm tra sự hiện diện của gene mã hóa ACC deami- nase: Phản ứng PCR (25 mL) bao gồm 2,5 m l gDNA vi khuẩn; 2,5 mL dung dịch đệm phản ứng PCR (10X), 200 nM mỗi mồi và 1 U i-TaqTM DNA polymerase (iNtRON). Trình tự mồi xuôi (5’ – ATG AAC CTG CAA CGA TTC – 3’) và mồi ngược (5’ – TCA GCC GTC GGA AGA T – 3’) 11. Chương trình nhiệt của phản ứng gồm 5 phút ở 95oC; 35 chu kỳ (15 giây ở 95oC, 15 giây ở 58oC và 75 giây ở 72oC); 5 phút ở 72oC. Sản phẩm PCR (khoảng 750 bp) sau đó được phát hiện bằng điện di trên gel agarose. Khảo sát kích thích tăng trưởng đậu phộng trong điều kiệnmặn của vi khuẩn Thử nghiệm in vitro Hạt đậu phộng được khử trùng và cho nảy mầm trên bông gòn được tẩm ướt với môi trường khoángMS 12 . Cây con 7 ngày tuổi được chuyển sang: môi trường khoáng MS 12 có hoặc không có bổ sung vi khuẩn; môi trường khoángMS 12 chứa 100mMNaCl có hoặc không có bổ sung vi khuẩn6. Mật độ vi khuẩn bổ sung vàomôi trường đạt 106 CFU/mL. Cây được tăng trưởng trong điều kiện quang kỳ 16 giờ sáng / 8 giờ tối; nhiệt độ phòng sáng dao động từ 23 – 27oC. Ghi nhận khối lượng tươi của cây sau 4 tuần tăng trưởng. Thử nghiệm trong chậu trồng ngoài vườn ươm Hạt đậu phộng được khử trùng và cho nảy mầm trên bông gòn được tẩm ướt với môi trường khoáng MS 1 2 có hoặc không có bổ sung vi khuẩn ở mật độ 106 CFU/mL. Sau khi hạt nảy mầm, đậu phộng được 348 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 chuyển sang chậu đất: đất không xử lý mặn hoặc đất được trộn với NaCl 75 mM. Cây được tưới nước 2 lần/tuần. Ở các nghiệm thức xử lý khuẩn, huyền phù vi khuẩn được bổ sung vào nước đạt mật độ 106 CFU/ml và tưới 2 tuầnmột lần. Với nghiệm thức xử lý mặn, cách 2 tuần sẽ tưới bổ sung bằng dung dịchNaCl 50 mM5. Sau 40 ngày gieo hạt, khối lượng tươi được ghi nhận. Điều kiện nhiệt độ (ngày: 34-38oC; đêm: 29-32oC) và độ ẩm tương đối 48-62 %RH trong vườn ươm được ghi nhận trong suốt quá trình thí nghiệm. Xử lý thống kê số liệu Tất cả các số liệu được xử lí thống kê dựa trên phần mềmMicrosoft Excel 2010 và phầnmềm SASUniver- sity Edition. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập và nhận diện vi khuẩn Từ các nguồn mẫu thu nhận, 12 chủng vi khuẩn bao gồm 7 chủng (BT00S01, BT00S02, BT00P03, BT00P04, BT00P05, BT00P06 và BT00P07) từ cây bắp; 2 chủng (BT01S02 và BT01P01) từ cây khoai lang; 1 chủng (BT02E01) từ cây dừa cạn và 2 chủng (BT03S02 và BT03S03) từ cây đậu phộng được phân lập. Phần lớn các chủng phân lập được là từ vùng đất xung quanh rễ (các chủng được ký hiệu bởi chữ “S”) và từ bề mặt rễ (các chủng được ký hiệu bởi chữ “P”). Chỉ có duy nhất 1 chủng BT02E01 (ký hiệu bởi chữ “E”) là nội cộng sinh bên trong rễ. Trong thực tế, Pseudomonas là chi vi khuẩn rất phổ biến trong đất và vùng rễ của thực vật, nhưng do sự đa dạng về thành phần loài cùng với hiệu quả chọn lọc tương đối thấp của môi trường King B làm hạn chế khả năng phân lập vi khuẩn mục tiêu, đặc biệt là đối với những mẫu có sự phát triển của nấm mốc trên đĩa thạch. Để khẳng định các chủng được chọn thuộc chi Pseu- domonas, phản ứng PCR đã được sử dụng để khuếch đạimột đoạn trình tự rDNA16S chuyênbiệt choPseu- domonas7,12,13. Kết quả thí nghiệm cho thấy, chỉ có 7/12 chủng cho kết quả dương tính trên bản điện di (Hình 1). Do số lượng chủng khảo sát không lớn, nên 12 chủng được phân lập (bao gồm cả các chủng âm tính với kết quả PCR) sẽ được tiến hành đánh giá các đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng. Đánh giá khả năng chịumặn của vi khuẩn Khảnăng chịumặn của các chủng vi khuẩnđược đánh giá, từ đó làm tiền đề để khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật trong điều kiện muối cao. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường chứa hàm lượng NaCl tăng dần từ 6% đến 24% (khoảng cách giữa các nồng độ là 2%). Kết quả thí nghiệm trong Bảng 1 cho thấy các chủng khuẩn được phân lập ở Bến Tre có khả năng tồn tại trong môi trường chứa hàm lượng muối khá cao, đặc biệt là hai chủng BT03P01 và BT02E01 có thể tăng trưởng trong môi trường chứa nồng độ NaCl lên tới 20% và 22%. Khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Kết quả thí nghiệm trình bày trong Bảng 1 cho thấy tất cả các chủng khuẩn phân lập được đều có khả năng sản sinh IAA. Tuy nhiên, hàm lượng IAA sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn sau 7 ngày nuôi cấy tương đối thấp trong khoảng 1,168 – 4,423 mg/ml14. Nhưng theo Bùi Trang Việt (2016) thì nồng độ IAA chỉ cần đạt từ 0,1 – 1 mg/ml đã có thể tác động lên sự phát triển của cây theo chiều hướng có lợi 15. Nên nếu đồng nuôi cấy các chủng khuẩn với thực vật trong thời gian kéo dài thì các chủng khuẩn này vẫn cung cấp đủ lượng IAA ngoại sinh cho sự phát triển thực vật bằng cách tăng trưởng rễ thông qua kéo dài rễ và làm giảm lượng ethylene. Ba yếu tố chính ảnh hưởng đến sự sản sinh IAA của các chủng vi khuẩn vùng rễ theo Mutluru và Konada (2007) là sự khác nhau giữa các loài và chủng vi khuẩn; thời gian nuôi cấy, giai đoạn phát triển của vi khuẩn và tiền chất tổng hợp IAA16. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có sự sản sinh IAA khác nhau. Một số chủng vi khuẩn nổi bật cho sự sản sinh IAA như Pseudomonas aureantiaca TSAU22, Pseudomonas ex- tremorientalis TSAU6 và Pseudomonas extremorien- talis TSAU20 đã làm tăng đáng kể sự phát triển của rễ cây lên đến 25% trong điều kiện bình thường và lên đến 52% ở nồng độ NaCl 100 mM so với cây đối chứng17. Cố định đạm Dựa vào kết quả trong Bảng 1 thì đa số các chủng khuẩn được phân lập đều có khả năng tăng trưởng trên môi trường MNFM, trừ chủng khuẩn BT03S02. Môi trường MNFM là một môi trường vô đạm, sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường này chứng tỏ các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng nguồn nitơ không khí cho các quá trình của tế bào. Trong môi trường MNFM có bổ sung bromophenol blue, đây là một chất chỉ thị pH, cómàu vàng khimôi trường acid, màu xanh lá ở pH trung tính và chuyển sang màu xanh dương khi môi trường bazơ. Trong thí nghiệm này, môi trường chuyển từ màu xanh lá sang màu xanh dương là do vi khuẩn cố định đạm tạo ra sản phẩmNH4+ làm pHmôi trường tăng lên. Sự cố định đạm của vi khuẩn được thực hiện theo phương trình phản ứng: N2 + 10H+ + nMgATP + 8e!2NH4+ + H2 + nM- gADP + nPi2NH4+ 18 . 349 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 Hình 1: Phản ứng PCR phát hiện trình tự rDNA 16S chuyên biệt cho chi Pseudomonas. Từ trái qua: Thang chuẩn DNA (abm 100bp plus); 1-Đối chứng âm; 2-Đối chứng dương (Pseudomonas protegens ATCC 17386), 3-BT00S01, 4-BT00S02, 5-BT00P03, 6-BT00P04, 7-BT00P05, 8-BT00P06, 9- BT00P07, 10- BT01S02, 11- BT01P01, 12- BT02E01, 13- BT03S02, 14- BT03S03. Bảng 1: Kết quả khảo sát một số hoạt tính sinh hóa liên quan đến đặc tính kích thích tăng trưởng của các chủng vi khuẩn được phân lập trong điều kiện stress mặn Chủng vi khuẩn Nồng độ NaCl cao nhất (%) Nồng độ IAA (mg/ml) Chỉ số hòa tan Phosphate Cố định đạm BT00S01 6 4,316 0,133a + (*) + BT00S02 8 3,487 0,206b 1,654 0,301abc + BT00P03 8 3,458 0,114b 1,839 0,350ab + BT00P04 10 3,049 0,292c 1,108 0,026e + BT00P05 6 3,039 0,151c + (*) + BT00P06 6 4,423 0,196a + (*) + BT00P07 6 3,536 0,160b + (*) + BT01S02 12 1,976 0,203 f 1,198 0,090de + BT01P01 10 2,610 0,281d 1,453 0,057cd + BT02E01 22 3,495 0,107b 1,597 0,084bc + BT03S02 12 2,428 0,075de 1,882 0,055a - BT03S03 12 1,470 0,220g 1,623 0,021abc + Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt ở mức p0,05 (*) Dấu + chỉ ra khả năng hòa tan phosphate nhưng ở mức độ thấp, không thể xác định chỉ số SI 350 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 Hòa tan phosphate Trong 12 chủng vi khuẩn phân lập, chỉ có 8 chủng xuất hiện vòng phân giải sau 7 ngày nuôi cấy (Bảng 1). Tuy nhiên sau 7 ngày nuôi cấy, 8 chủng khuẩn chỉ xuất hiện các vòng phân giải khá nhỏ và chỉ số hòa tan dao động từ 1,108 – 1,882. Các cơ chế hòa tan phosphate bởi vi khuẩn rất đa dạng, nhưng theo Sharma và cộng sự (2013) thì có 3 cơ chế chính là sản sinh acid hữu cơ, giải phóng acid vô cơ và tổng hợp các polymer ngoại bào (Extracellular polymeric substances-EPSs) 19. So sánh chọn lựa các chủng vi khuẩn tiềm năng Dựa vào kết quả về các đặc điểm kích thích tăng trưởng của các chủng khuẩn được phân lập, trong các chủng phân lập từ vùng rễ cây bắp thì BT00S02, BT00P03 và BT00P04 là có đầy đủ các đặc tính như sinh IAA, cố định đạm và hòa tan phosphate. Tuy nhiên, khi xét về kết quả nồng độ IAA và cũng như chỉ số hòa tan phosphate thì 2 chủng BT00S02 và BT00P03 có ưu thế hơn so với chủng BT00P04. Trong 6 chủng vi khuẩn được phân lập từ cây đậu phộng, cây khoai lang và cây dừa cạn, 4 chủng BT01S02, BT01P01, BT02P01 và BT03S03 có đầy đủ 3 khả năng sinh hóa là sinh IAA, cố định đạm và hòa tan phos- phate. Có thể thấy, chủng BT03S03 có khả năng hòa tan phosphate cao hơn so với chủng BT02E01 nhưng sự khác nhau không quá lớn, tuy nhiên chủng BT02E01 sinh ra nồng độ IAA cao hơn hẳn so với BT03S03. Vì vậy, 3 chủng BT00S02, BT00P03 và BT02E01 được chọn lọc để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Cả 3 chủng này đều cho kết quả PCR dương tính với cặp mồi chuyên biệt cho Pseudomonas. Các chủng Pseudomonas phân lập từ vùng rễ và các mẫu đất nông nghiệp được đánh giá tương đối an toàn với người và động vật. Mặc dù mỗi loài thực vật có hiệu ứng chọn lọc khác nhau lên độ đa dạng của quần xã vi sinh vật vùng rễ, P. fluorescens và P. putida vẫn là những loài chiếm ưu thế nhất20. Nhiều chế phẩm thương mại từ 2 loài này đã được ứng dụng rộng rãi. Một số trường hợp P. putida gây bệnh cho người đã được ghi nhận, tuy nhiên, số ca này là rất hiếm và hầu hết gặp ở những người suy giảm miễn dịch21. Một thành viên khác thuộc chi này là P. aeruginosa có tiềm năng rất lớn trong việc thúc đẩy tăng trưởng thực vật và khả năng đối kháng mạnh mẽ với các tác nhân gây bệnh vùng rễ. Không giống như P. fluorescens và P. putida, một số chủng P. aeruginosa là tác nhân gây bệnh cơ hội trên người21. Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong nguồn nước, đất và thậm chí là trong một số loại thực phẩm. Tuy nhiên, mức độ rủi ro gây ra bởi vi khuẩn này không lớn và chỉ được xếp vào nhóm nguy cơ an toàn sinh học cấp II. Hơn nữa, không phải tất cả các chủng thuộc loài này đều có khả năng gây bệnh liên quanđến sự vắngmặt của các gene gây bệnh trong genome. Tóm lại, các chủng PGPR thuộc chi Pseu- domonas có thể ứng dụng rộng rãi trong thực hành nông nghiệp với mức độ rủi ro thấp và có khả năng kiểm soát. Sự hiện diện gene mã hóa ACC deaminase Nhằmxác định sự hiện diện genemãhóaACCdeami- nase trong các chủng tiềm năng, phản ứng PCR nhằm khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho gene này ở Pseu- domonas được thực hiện theo quy trình của Sheehy và cộng sự (1991)22. Ngoài ra, D. Saravanakumar và R. Samiyappan (2006) đã chứng minh được cặp mồi này là một cặp mồi đặc trưng cho Pseudomonas flu- orescens23. Kết quả điện di trênHình 2 cho thấy sản phẩmmục tiêu khoảng 750 bp xuất hiện ở cả 3 chủng được chọn. Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng Trong thí nghiệm này, tiềm năng của các chủng vi khuẩn trong việc hỗ trợ thực vật chống chịu với stress mặn sẽ được đánh giá trên mô hình cây nông nghiệp. So với cây bắp, chỉ nhạy cảm với stress mặn ở mức độ trung bình24, thì cây đậu phộng là một loại rất nhạy cảm với stress mặn5,6. Do đó, mặc dù 3 chủng được chọn cónguồn gốc từ rễ cây bắp và cây dừa cạn, nhưng trong thí nghiệm này cây đậu phộng đã được chọn làm mô hình để tiến hành các thử nghiệm đáp ứng với stress. Thử nghiệm in vitro: Trong điều kiện thường, cây được xử lí với chủng vi khuẩn BT00P03 cho thấy sự kích thích tăng trưởng thể hiện ở sự gia tăng khối lượng tươi toàn cây (tăng 30%), khối lượng thân (tăng 37%) và khối lượng rễ (tăng 13%) so với đối chứng. Trái lại, chủng vi khuẩn BT02E01 lại cho thấy dấu hiệu ức chế lên sự phát triển của cây trong khi cây được xử lý với chủng BT00S02 lại không cho thấy sự khác biệt so cây đối chứng (Hình 3A và Bảng 2). Tuy nhiên, trong điều kiện stress mặn, tất cả các nghiệm thức được xử lý vi khuẩn đều cho thấy có sự gia tăng khối lượng của cây so với nghiệm thức đối chứng. Trong đó, nghiệm thức được xử lý với chủng vi khuẩn BT00P03 cho hiệu quả cao nhất (Hình 3B và Bảng 2). Điều này cho thấy vi khuẩn có khả năng làm giảm tác động của stress mặn lên sự tăng trưởng của cây đậu phộng. Thử nghiệm trong chậu trồng ngoài vườn ươm: Trong điều kiện thường, các cây được xử lý với chủng BT00P03 có sự gia tăng khối lượng thân và rễ lần lượt 351 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 Hình 2: Phát hiện gene mã hóa ACC deaminase bằng phản ứng PCR Bảng 2: Tác động của vi khuẩn lên khối lượng tươi cây đậu phộng trồng trênMS 12 vàMS 1 2 bổ sung 100mM NaCl sau 4 tuần gieo hạt trong điều kiện in vitro. Nghiệm thức Khối lượng tổng (mg) Khối lượng thân (mg) Khối lượng rễ (mg) 0 mM NaCl 100 mM NaCl 0 mM NaCl 100 mM NaCl 0 mM NaCl 100 mMNaCl Đối chứng (ĐC) 2308,3b 266,0 2046,1b 300,6 1625,0b 113,4 1661,4b 266,7 683,2a 179,0 384,7b 97,4 BT00S02 2237,4b 367,5 2281,3ab 70,3 1799,6b 214,1 1789,6b 146,0 437,8b 157,3 491,7a 91,4 BT00P03 2991,3a 183,7 2629,6a 27,4 2218,6a 202,6 2011,9a 97,2 772,7a 276,7 617,7a 52,7 BT02E01 1466,0c 94,7 2463,1ab 344,8 1171,5c 139,9 1927,9b 396,9 294,5c 52,7 535,2a 55,3 Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt ở mức p0,05 352 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 Hình 3: Hình thu hoạch cây đậu phộng trong tương tác với các chủng vi khuẩn (Trong đó, A: Điều kiện in vitro không stress; B: Điều kiện in vitro stress mặn; C: Điều kiện tự nhiên không stress; D: Điều kiện tự nhiên stress mặn) là 54% và 278% so với cây đối chứng. Trái lại, các cây được xử lý với chủng BT00P02 và BT02E01 lại cho thấy sự giảm nhẹ về khối lượng so với cây đối chứng (Hình 3C và Bảng 3). Trong điều kiện stress mặn, tất cả các cây được xử lí với vi khuẩn đều có khối lượng tươi cao hơn so với cây đối chứng (Hình 3D và Bảng 3). Kết quả thí nghiệm cho thấy sự phù hợp giữa điều kiện thử nghiệm in vitro và điều kiện thử nghiệm trong vườn ươm. Như vậy, chủng BT00P03 không những có hiệu quả kích thích tăng trưởng cây đậu phộng trong điều kiện thườngmà còn có khả năng cải thiện tăng trưởng của cây trong điều kiệns tress mặn. Trong khi đó, 2 chủng còn lại chỉ có hiệu quả tích cực trong điều kiện stressmà không cho thấy hiệu quả ứng dụng trong điều kiện thường. Từ những kết quả trên, chủng BT00P03 đã cho thấy là một chủng tiềm năng trong việc sản xuất phân bón vi sinh giúp cải thiện năng suất cây trồng kể cả trong điều kiện thường hay điều kiện stress mặn. KẾT LUẬN Nghiên cứu này đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas từ Bến Tre, có khả năng sống trên điều kiện mặn. Trong đó 3 chủng vi khuẩn BT00S02, BT00P03 và BT02E01 được chọn lọc dựa trên khả năng hòa tan phosphate, cố định đạm và sản sinh IAA. Chủng vi khuẩn BT00P03 có khả năng kích thích tăng trưởng cây đậu phộng cả trong điều kiện bình thường và điều kiện stress mặn, cho thấy tiềm năng của chủng này trong thực hành nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên, trước khi đưa vào ứng dụng rộng rãi hoặc thương mại hóa, chủng vi khuẩn BT00P03 cần được tiến hành đánh giá về nguy cơ gây bệnh trên người và động vật, cũng như tác động lên môi trường sinh thái. Việc định danh tới mức độ loài, tầm soát sự hiện diện của các gene gây bệnh trong bộ gene cũng như thử nghiệm trên mô hình động vật sẽ cung cấp nhưng bằng chứng xác thực về mức độ rủi ro gây ra bởi chủng này. DANHMỤC VIẾT TẮT ACC: 1-aminocyclopropane-1-carboxylate 353 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 Bảng 3: Tác động của vi khuẩn lên khối lượng tươi cây đậu phộng trồng trong đất và đất bổ sung 75mMNaCl sau 40 ngày gieo hạt Nghiệm thức Khối lượng tổng (mg) Khối lượng thân (mg) Khối lượng rễ (mg) 0 mM NaCl 75 mM NaCl 0 mM NaCl 75 mM NaCl 0 mM NaCl 75 mM NaCl Đối chứng (ĐC) 2682,5b  29,2 1562,6b 215,9 2184,9b 122,4 1229,9b 117,8 555,1b 32,5 332,8b 98,4 BT00S02 2019,7c 64,5 2616,5a 523,3 1484,8c 22,1 1485,2b 213,0 534,9b 76,4 891,3a 346,5 BT00P03 5468,4a 48,3 2666,7a 310,5 3368,3a 182,4 1880,2a 214,4 2100,1a 134,6 786,5a 101,1 BT02E01 2002,7c 61,8 2194,9a 134,7 1437,4c 158,9 1441,8b 142,3 559,4b 14,4 606,1a 56,1 Các số trung bình trong các cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt ở mức p0,05 bp: base pair ĐC: Đối chứng EPSs: Extracellular polymeric substances IAA: Indole-3-acetic acid IST: inducing systemic tolerance MNFM: Nitrogen Free Mineral Medium PCR: Polymerase chain reaction PGPR: Plant growth promoting rhizobacteria OD: Optical Density TSB: Tryptone Soya Broth XUNGĐỘT LỢI ÍCH Các tác giả công bố không có sự xung đột về lợi ích. ĐÓNGGÓP CỦA TÁC GIẢ ChuNguyênThanh, PhạmVănNhựt Tiếng và Hoàng Thị Thanh Minh thiết kế thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm, thu thập số liệu, xử lý kết quả, tham gia viết bài. Bùi Văn Lệ cố vấn về thiết kế thí nghiệm. Chu Nguyên Thanh và Phạm Văn Nhựt Tiếng đóng góp như nhau. LỜI CẢMƠN Nghiên cứu được tài trợ bởiĐại họcQuốc gia - TP.Hồ Chí Minh trong khuôn khổ đề tài mã số C2018-18-19 và TWAS 16-142 RG/BIO/AS_I–FR3240293339. TÀI LIỆU THAMKHẢO 1. Das P, Nutan KK, Singla-Pareek SL, Pareek A. Understand- ing salinity responses andadopting ’omics-based’ approaches to generate salinity tolerant cultivars of rice. Front Plant Sc. 2015;6:1–16. Available from: https://doi.org/10.3389/fpls.2015. 00712. 2. Shrivastava P, Kumar R. Soil salinity: A serious environmen- tal issue and plant growth promoting bacteria as one of the tools for its alleviation. Saudi J Biol Sci. 2015;22(2):123–131. PMID: 25737642. Available from: sjbs.2014.12.001. 3. Chu TN, Tran BTH, Bui VL, Hoang M. Plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas PS01 induces salt tolerance in Arabidopsis thaliana. BMC Res Notes. 2019;12(1):1–7. PMID: 30635071. Available from: https://doi.org/10.1186/s13104- 019-4046-1. 4. Le PN, Chu TN, Hoang MTT. Đánh giá tính kháng mặn của Arabidopsis thaliana cảm ứng bởi vi khuẩn vùng rễ phân lập tại rừng ngập mặn Cần Giờ. 2017;20:-.:64–74. 5. Goswami D, Dhandhukia P, Patel P, Thakker JN. Screening of PGPR from saline desert of Kutch: Growth promotion in Arachis hypogea by Bacillus licheniformis A2. Microbiol Res. 2014;169(1):66–75. PMID: 23896166. Available from: http: //dx.doi.org/10.1016/j.micres.2013.07.004. 6. Sharma S, Kulkarni J, Jha B. Halotolerant rhizobacteria pro- mote growth and enhance salinity tolerance in peanut. Front Microbiol. 2016;7(OCT):1–11. Available from: https://doi.org/ 10.3389/fmicb.2016.01600. 7. Widmer F, Seidler RJ, Gillevet PM, Watrud LS, Giovanni GD. A highly selective PCR protocol for detecting 16S rRNA genes of the genus Pseudomonas (sensu stricto) in environmen- tal samples. Appl Environ Microbiol. 1998;64(7):2545–2553. PMID: 9647828. Available from: https://doi.org/10.1128/AEM. 64.7.2545-2553.1998. 8. Glickmann E, Dessaux Y. A critical examination of the speci- ficity of the Salkowski reagent for indolic compounds pro- duced by phytopathogenic bacteria. Appl Environ Micro- biol. 1995;61(2):793–796. PMID: 16534942. Available from: https://doi.org/10.1128/AEM.61.2.793-796.1995. 9. Wright SF, Weaver RW. Enumeration and Identification of Nitrogen-Fixing Bacteria from Forage Grass Roots Enumera- tion and Identification of Nitrogen-Fixing Bacteria from For- age Grass Roots. . 1981;42(1):97–101. PMID: 16345819. Avail- able from: https://doi.org/10.1128/AEM.42.1.97-101.1981. 10. Damodaran T, Sah V, Rai RB, Sharma DK, VK M, Jha SK, et al. Isolation of salt tolerant endophytic and rhizospheric bac- teria by natural selection and screening for promising plant growth-promoting rhizobacteria ( PGPR ) and growth vigour in tomato under sodic environment. African J Microbiol Res. 2013;7(44):5082–5089. 11. Saravanakumar D, Samiyappan R. ACC deaminase from Pseudomonas fluorescens mediated saline resistance in groundnut (Arachis hypogea) plants. J Appl Microbiol. 2007;102(5):1283–1292. PMID: 17448163. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2006.03179.x. 12. Yadav S, Yadav S, Kaushik R, Saxena AK, Arora DK. Genetic and functional diversity of fluorescent Pseudomonas from rhizo- spheric soils of wheat crop. J BasicMicrobiol. 2014;54(5):425– 437. PMID: 23681594. Available from: https://doi.org/10.1002/ jobm.201200384. 13. Kim J, Mele P, Crowley D. Application of PCR primer sets for detection of Pseudomonas sp. functional genes in the plant 354 Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(1):347-356 rhizosphere. J Agric Chem. 2013;2(1):8–15. Available from: https://doi.org/10.4236/jacen.2013.21002. 14. Malik DK, Sindhu SS. Production of indole acetic acid by Pseu- domonas sp.: Effect of coinoculation with Mesorhizobium sp. Cicer on nodulation and plant growth of chickpea (Cicer ari- etinum). Physiol Mol Biol Plants. 2011;17(1):25–32. PMID: 23572992. Available from: https://doi.org/10.1007/s12298- 010-0041-7. 15. Bui TV. Sinh lý thực vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh. 2016;p. 198. 16. Egamberdieva D. The Role of Phytohormone Producing Bac- teria in Alleviating Salt Stress in Crop Plants. Res Gate. 2015;p. 20–39. 17. Egamberdieva D. Alleviation of salt stress by plant growth regulators and IAA producing bacteria in wheat. Acta Phys- iol Plant. 2009;31(4):861–864. Available from: https://doi.org/ 10.1007/s11738-009-0297-0. 18. Rubio LM, Ludden PW. Biosynthesis of the Cofactor of Ni- trogenase. Annu Rev Microbiol. 2008;62(3):93–111. PMID: 18429691. Available from: https://doi.org/10.1146/annurev. micro.62.081307.162737. 19. Sharma SB, Sayyed RZ, Trivedi MH, Gobi TA. Phosphate solubilizing microbes: Sustainable approach for managing phosphorus deficiency in agricultural soils. Springerplus. 2013;2(1):1–14. PMID: 25674415. Available from: https://doi. org/10.1186/2193-1801-2-587. 20. Botelho GR, Mendonça-hagler LC. Fluorescent Pseudomonas associated with the rhizosphere of crops- An overview. Brazil- ian J Microbiol. 2006;p. 401–416. Available from: https://doi. org/10.1590/S1517-83822006000400001. 21. FernándezM, PorcelM, de la Torre J,Molina-HenaresMA, Dad- daoua A, Llamas MA, et al. Analysis of the pathogenic po- tential of nosocomial Pseudomonas putida strains. Front Mi- crobiol. 2015;6(AUG):1–11. Available from: https://doi.org/10. 3389/fmicb.2015.00871. 22. Sheehy RE, Honma M, Yamada M, Sasaki T, Martineau B, Hiatt W. Isolation, Sequence, and Expression in Escherichia- Coli of the Pseudomonas Sp Strain Acp Gene Encod- ing 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Deaminase. J Bacterio; ST-ISOLATION, SEQUENCE, AND EXPRESSIO. 1991;173(17):5260–5265. PMID: 1885510. Available from: https://doi.org/10.1128/JB.173.17.5260-5265.1991. 23. Saravanakumar D, Samiyappan R. ACC deaminase from Pseudomonas fluorescens mediated saline resistance in groundnut (Arachis hypogea) plants. J Appl Microbiol. 2007;102(5):1283–1292. PMID: 17448163. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2006.03179.x. 24. Zörb C, Schmitt S, Neeb A, Karl S, Linder M, Schubert S. The biochemical reaction of maize (Zea mays L.) to salt stress is characterized by a mitigation of symptoms and not by a spe- cific adaptation. Plant Sci. 2004;167(1):91–100. Available from: https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2004.03.004. 355 Science & Technology Development Journal – Natural Sciences, 4(1):347-356 Open Access Full Text Article Research Article University of Science, VNU-HCM Correspondence Hoang Thi ThanhMinh, University of Science, VNU-HCM Email: httminh@hcmus.edu.vn History  Received: 30-8-2019  Accepted: 13-11-2019  Published: 20-3-2020 DOI : 10.32508/stdjns.v4i1.834 Copyright © VNU-HCM Press. This is an open- access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license. Isolation and screening of Pseudomonas isolates enhance salinity tolerance of peanut ( Arachis hypogaea L.) Chu Nguyen Thanh, Pham Van Nhut Tieng, Bui Van Le, Hoang Thi ThanhMinh* Use your smartphone to scan this QR code and download this article ABSTRACT The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) is one of the most promising al- ternative approaches to improve plant growth under salt stress. Among PGPR, Pseudomonas is a bacterial genus that possesses a variety of mechanisms for plant growth promoting and induc- tion of biotic as well as abiotc stress tolerance. In this study, we screened 3 potential strains and testedgrowthpromotion of peanut (Arachishypogaea) under saline condition. All 3 isolates (strains) showed in vitro plant growth promoting traits such as production of indoleacetic acid (IAA), phos- phate solubilization and nitrogen fixation. Moreover, the 3 isolates present gene encoding ACC deaminase, an important enzyme can promote plant growth to ameliorate abiotic stresses. Peanut inoculatedwith the strain BT00P03 showed the increase in fresh shoot biomass in normal and saline stress conditions. Our results showed that the BT00P03 strain may be used as a biological agent for eco-friendly agricultural practices. This research is the first step to understand the microbe-plant interactionmechanism under stress and to apply these strains to agricultural practices in the future. Key words: peanut, PGPR, Pseudomonas, salt stress tolerance Cite this article : Nguyen ThanhC, VanNhut Tieng P, Van Le B, Thi ThanhMinhH. Isolationand screening of Pseudomonas isolates enhance salinity tolerance of peanut ( Arachis hypogaea L.). Sci. Tech. Dev. J. - Nat. Sci.; 4(1):347-356. 356