Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao chiết từ lá trầu không

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 235 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HOẠT CHẤT KHÁNG NẤM CÓ TRONG CAO CHIẾT TỪ LÁ TRẦU KHÔNG. Nguyễn Thu Gương*, Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Lê Thị Lệ Uyên**, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Mục tiêu: phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao Trầu không. Vật liệu và phương pháp: Cao trầu không (cao TK): được chiết xuất từ lá Trầu không thu hái ở Hóc Môn, TP.HCM. Cao TK cho tác động kháng nấm men, nấm da, một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Phương pháp phân lập hoạt chất kháng nấm từ cao TK: Sử dụng sắc ký cột với sự hỗ trợ của sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hiện hình sinh học, phương pháp khuếch tán và phương pháp pha loãng để xác định hoạt tính kháng nấm của hoạt chất. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm trong cao TK bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR và 13C NMR). Kết quả và bàn luận: Đã phân lập và xác định được hoạt chất kháng nấm có trong cao TK là hydroxychavicol. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt chất cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có trong cao chiết từ lá Trầu không ở Ấn Độ, Mã lai, Từ khóa: Cao Trầu không, hydroxy chavicol. ABSTRACT ISOLATING AND DETERMINING CHEMICAL STRUCTURE OF ANTIFUNGAL PRINCIPLE AGENT IN BETLE EXTRACT Nguyen Thu Guong, Nguyen Vu Giang Bac, Le Thi Le Uyen, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 235 - 239 Objectives: Isolation and determination of chemical structure of antifungal agent in the betle extract. Material and methods: Betle extract was produced from leaves of Piper betle L. Piperaceae, harvested in Hoc Mon, District 12, HCM city. The antifungal agent in betle extract was isolated by column chromatography in support with thin layer chromatography (TLC), autobiography, disk diffusion and broth dilution method. Chemical structure of the antifungal agent in betle extract were determined by using TLC, GC, GC-MS, 1H NMR and 13C NMR. Outcome: The antifungal agent in betle extract was determined as hydroxy chavicol. These results may be used in verify raw material and betle products. Key words: Betle extract, hydroxy chavicol. ĐẶT VẤN ĐỀ Trầu không (Piper betle L. Piperaceae) được trồng nhiều nơi ở Việt Nam. Lá Trầu không đã được dùng nhai với cau để làm chắc răng, thơm miệng. Ngoài ra, y học cổ truyền còn dùng lá Trầu không chữa cảm, giảm đau trong bong gân, làm lành vết thương, se niêm mạc, kích thích tiết men gan, làm lành vết thương, kích thích sinh * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908836969 Email: nganguyendinh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 236 dục, trị hắc lào, lang ben, Trong một số nghiên cứu ở các nước Đông Nam Á như Ấn Độ, Mã Lai,.. các tác giả đã phân lập được từ cao lá Trầu không, chiết với nước hoặc cồn ethyl hợp chất hydroxychavicol(Error! Reference source not found.), và chứng minh đây là hợp chất chính cho tác động kháng khuẩn, đặc biệt là những vi khuẩn gây hôi miệng, gây sâu răng(4); kháng Aspergillus, nấm da, C. albicans, C. glabrata(Error! Reference source not found.) và kháng ung thư(1). Ở Việt Nam, cao chiết từ lá Trầu không và tinh dầu Trầu không đã được chứng minh kháng C. albicans in vitro(3), Betelvine (cao chiết từ lá Trầu không) phối hợp với sucrategel cho hiệu quả giảm đau trên các bệnh nhân viêm dạ dày mạn tính có Helicobacter pylori(6). Nhằm tạo cơ sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn cao trầu không, hướng ứng dụng làm thuốc kháng nấm, mục tiêu chính của đề tài nhằm “Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao chiết từ lá Trầu không”. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Cao Trầu không Cao trầu không được chiết xuất từ bột lá Trầu không thu hái ở Hóc Môn, quận 12, TP. HCM theo qui trình sau: Bột lá trầu được ngâm lạnh với ethanol 96% theo tỷ lệ 1:10 trong 24h. Dịch chiết ethanol được cô ở 40 oC với áp suất giảm đến còn khoảng 1/10 thể tích ban đầu. Cao chiết 1:1 được loại chlorophyll bằng ether dầu hỏa và lắc phân bố với dichloromethan, dịch chiết dichloromethan được thu hồi dung môi ở 50 oC để có cao Trầu không (cao TK). Cao TK chiết theo qui trình trên cho tác động kháng C. albicans, Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, T. tonsurans, Microsporum gypseum, Malassezia furfur, với MIC từ 0,064–0,512 mg/ml. Vi nấm sử dụng trong các thí nghiệm: Candida albicans ATCC 10231 Phương pháp nghiên cứu Phân lập hoạt chất kháng nấm có trong cao Trầu không Hoạt chất kháng nấm trong cao TK được phân lập bằng sắc ký cột Điều kiện sắc ký: Cột 30 cm x 0,5 cm; Chất hấp phụ: silica – gel G; cỡ hạt: 60 µm 10g hoạt hóa ở 105 oC/ 1 giờ ; Lượng mẫu: 0,6 g cao CH2Cl2 tương ứng với 30 g dược liệu khô; Dung môi khai triển CH2Cl2, CH2Cl2-EtOAc, MeOH; Tốc độ chảy: 11 giây/ giọt; Thể tích mỗi ống hứng: 2 ml. Gộp các phân đoạn có cùng tính chất trên sắc ký lớp mỏng, khảo sát tác động kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán và kỹ thuật hiện hình sinh học để xác định phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm trong cao Trầu không. Kỹ thuật hiện hình sinh học: Phân đoạn cho tác động kháng nấm từ sắc ký cột được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng và xác định vết sắc ký cho tác động kháng nấm. Điều kiện thực hiện: Bản mỏng Silicagel F 254 (Merck), dày 0,25 mm, 20 x 20 cm; Dung môi khai triển: n- Hexan – EtOAc – MeOH (4: 2: 1); Phát hiện các vết bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm; Vi nấm thử nghiệm: Candida albicans ATCC 10231; Môi trường thử nghiệm: thạch Sabouraud Xác định mức độ tinh khiết của hoạt chất kháng nấm bằng sắc ký lớp mỏng 2 chiều (Chiều 1: CH2Cl2 – EtOAc (8:2); Chiều 2: n-Hexan – Dietylete (4:6)); sắc ký khí và phổ UV-Vis. Xác định cấu trúc của hoạt chất kháng nấm trong cao TK bằng phổ khối, 1H NMR và 13C NMR. Tác động kháng Candida albicans của cao Trầu không và hoạt chất kháng nấm được xác đinh bằng phương pháp pha loãng theo hướng dẫn của CLSI M27-A2. Môi trường sử dụng: Mueller Hinton broth bổ sung xanh methylen và glucose. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập hoạt chất kháng nấm trong cao TK Phân lập hoạt chất kháng nấm trong cao TK Sau khi cao TK (0,6 g) được triển khai qua cột Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 237 đã thu được 10 phân đoạn, chỉ có PĐ 1 ở dạng dầu, màu vàng xanh (206,7 mg) và PĐ 2, tinh thể trắng xám, dễ chảy lỏng, Rf = 0,54, chiếm 307,4 mg cho tác động kháng C. albicans với đường kính vòng kháng nấm là 28 mm, các phân đoạn còn lại không cho tác động kháng nấm. Sắc ký đồ của phân đoạn 2 trên sắc ký lớp mỏng sạch và tinh hơn phân đoạn 1 nên được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. Kiểm tra phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm (PĐ 2) bằng sắc ký lớp mỏng và kỹ thuật hiện hình sinh học Kết quả ở hình 1 cho thấy phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm chỉ cho 1 vết duy nhất ở sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng (SKLM) một chiều (Rf = 0,54) và hai chiều. Vết này cho vòng kháng nấm ở kỹ thuật hiện hình sinh học. A B Hình 1: Phân đoạn chứa chất kháng nấm cho 1 trên sắc ký đồ SKLM và cho vòng kháng nấm xác định bằng kỹ thuật hiện hình sinh học. Hình 2: Sắc ký đồ sắc ký 2 chiều hoạt chất chiết từ cao TK (A: Phát hiện vết bằng UV 254 nm; B: Phát hiện bằng thuốc thử VS) Kiểm tra hợp chất kháng nấm bằng UV – vis và sắc ký khí Kết quả ở hình 3 và 4 cho thấy sắc ký đồ GC của hợp chất kháng nấm trong cao TK chỉ cho một đỉnh có thời gian lưu 35,56 và phổ UV – Vis của chất này cũng chỉ có 1 đỉnh hấp thu duy nhất tại 282 nm. Hình 3: Sắc ký đồ GC của hợp chất kháng nấm Hình 4: Phổ UV –Vis của hợp chất kháng nấm Xác định MIC của hợp chất phân lập từ cao TK Từ kết quả sắc ký lớp mỏng 1 chiều, 2 chiều, kỹ thuật hiện hình sinh học, phổ UV-Vis, sắc ký khí và MIC cho thấy hợp chất có trong phân đoạn phân tách từ cao TK chỉ chứa một chất, chất này là hoạt chất chính cho tác động kháng nấm có trong lá Trầu không. Bảng 1: Nồng độ MIC của chất kháng nấm và cao TK 1 2 1 2 VK Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 238 trên C. albicans Chất thử MIC (mg/ ml) Cao TK 0,512 Chất kháng nấm trong cao TK 0,256 Xác định cáu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm trong cao TK Bảng 2: Dịch chuyển hóa học trong phổ 1H NMR của chất kháng nấm có trong cao TK STT Độ dịch chuyển hóa học (ppm) Dạng đỉnh Hằng số ghép (Hz) Số proton Vị trí proton 1 8,705- S 1 OH 2 8,595 S 1 OH 3 6,647-6,631 D 8Hz 1 H-6 4 6,561-6,557 ds 2Hz 1 H-3 5 6,426-6,406 dd 2Hz, 8Hz 1 H-5 6 5,924-5,843 M 1 H-2’ STT Độ dịch chuyển hóa học (ppm) Dạng đỉnh Hằng số ghép (Hz) Số proton Vị trí proton 7 5,041-5,007 D 1 H-3’ 8 5,004-4,996 D 1 H-3’ 9 3,178-3,164 D 7Hz 1 H-1’ Bảng 3: Dịch chuyển hóa học trong phổ 13C NMR của chất kháng nấm có trong cao TK. STT Độ dịch chuyển hóa học (ppm) Vị trí C 1 145,076 C-2 2 143,390 C-1 3 138,292 C-2’ 4 130,432 C-4 5 118,993 C-5 6 115,810 C-6 7 115,475 C-3 8 115,033 C-3’ 9 38,910 C-1’ OH OH1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' Hình 5. Phổ khối của hợp chất kháng nấm trong cao TK. 2-hydroxy chavicol Qua phân lập và xác định hoạt chất kháng nấm có trong cao TK, các dữ liệu phổ khối (hình 5), 1H NMR và 13C NMR của hoạt chất kháng nấm trong cao TK, với độ dịch chuyển hóa học ở bảng 2 và bảng 3, cho thấy cấu trúc hóa học của chất kháng nấm trong cao TK phù hợp với cấu trúc của 2-hydroxychavicol với công thức nguyên C9H10O2, MW là 150 (7). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt chất cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có trong cao chiết từ lá Trầu không ở một số nước Châu Á như Ấn Độ (2), Mã lai (4), .. KẾT LUẬN Lá trầu không đã được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền Việt Nam từ xưa đến nay nhưng vẫn chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống. Các kết quả thu được này có thể được ứng dụng trong kiểm nghiệm nguyên liệu và các sản phẩm chiết xuất từ lá Trầu không. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hemamalini V, Dass Prakash MV, Sivaramakrishnan1 S (2012), “Evaluation of the In vitro antioxidant, Anti- Enteropathogenic and Anticancer Efficacy of Natural and Synthetic Hydroxychavicol”, Int J Med Res.,1(5): 250-254. 2. Kushagra N et al. (2011), “Piper betle L.: A review on its ethnobotany, phytochemistry, pharmacological profile and profiling by new hyphenated technique DART-MS (Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry)”, Journal of Pharmacy Research, 4(9): 2991-2997. 3. Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Văn Thanh (2010), “Thành phần và tác động kháng Candida spp. của tinh dầu và cao chiết từ lá Trầu không Việt Nam”, Tạp chí Dược Học, 410: 27-30. 4. Nalina T and Rahim ZHA, (2007), “The Crude Aqueous Extract of Piper betle L. and its Antibacterial Effect Towards Streptococcus mutans”, American Journal of Biotechnology and Biochemistry 3 (1): 10-15. 5. Rahul S. et al. (2009), “Antibacterial Activity of Fresh leaves of Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 239 Piper betle Linn”, The Pharma Research, 01: 110-113. 6. Tạ Thu Thủy, Nguyễn Văn Toại (2011), “Đánh giá tác dụng giảm đau của phác đồ BETELVINE (TRẦU KHÔNG) + SUCRATEGEL (BS) trong điều trị chứng viêm dạ dày mạn tính nhiễm HP (vị quản thống)”, Y học thực hành, 7(774): 159. 7. Properties of Hydroxy chavicol, 057-2. Ngày nhận bài báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014