Phân tích các týp gen Caga và Vaca của Helicobacter Pylori trong ung thư dạ dày

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học 43 PHÂN TÍCH CÁC TÝP GEN CAGA VÀ VACA CỦA HELICOBACTER PYLORI TRONG UNG THƯ DẠ DÀY Trần Thiện Trung*, Cao Minh Nga*, Nguyễn Thúy Oanh*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Hồ Huỳnh Thùy Dương** .TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu định týp gen cagA và các týp gen vacA của vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori), và mối liên quan đến ung thư dạ dày ở bệnh nhân khu vực Miền Nam Việt Nam và thành phố Hồ Chí Minh. Bệnh nhân và phương pháp: Từ tháng 12/2008 đến tháng 5/2010, tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các týp gen của vi khuẩn H. pylori bằng phương pháp multiplex PCR. Nghiên cứu bệnh chứng gồm 126 bệnh nhân ung thư được mổ cắt 2/3 dạ dày, nạo hạch R2, trong số này có 96 bệnh nhân ung thư dạ dày; và 93 bệnh nhân viêm dạ dày có H. pylori-dương tính được chẩn đoán bằng PCR, CLO test và Giải phẫu bệnh. Kết quả: Trong 162 bệnh nhân (71 ung thư và 91 viêm dạ dày), gen cagA (+) là 95,7% (150/157), ở bệnh nhân ung thư dạ dày là 100% so với 92,3% (84/91) viêm dạ dày, p = 0,018, tỷ số chênh = 1,845 (KTC 95%, 1,597 – 2,133). Gen vacA s1 là 98,1% (156/159), ở ung thư dạ dày là 100% (68/68) so với 96,7% (88/91) viêm dạ dày; gen vacA s2 là 3,3% (3/91) và chỉ gặp ở viêm dạ dày, với p= 0,261. Gen vacA m1 là 50,6% (81/160), ở ung thư dạ dày là 63,8% (44/69) so với 40,7% (37/91) viêm dạ dày; Gen vacA m2 là 49,4% (79/160), ung thư dạ dày là 36,2% (25/69) so với 59,3% (54/91) viêm dạ dày, p= 0,004, tỷ số chênh = 2,569 (KTC 95%, 1,348 – 4,895). Liên quan giữa gen cagA và vacA trên 157 bệnh nhân (66 ung thư dạ dày, 2 cagA (+) không xác định m, và 3 cagA (+) không xác định s; và 91 viêm dạ dày) đã được xác định. Ở 66 bệnh nhân ung thư dạ dày, cagA (+) là 100%, các týp gen vacA s1/m1 ở 63,6%, và vacA s1/m2 là 36,4%. Ở 91 viêm dạ dày, cagA (+) là 92,3% và cagA (-) là 7,7%. Các týp gen vacA trong nhóm này lần lượt là s1/m1 (42%), s1/m2 (55%) và s2/m2 (3%). Trong các trường hợp cagA (+), có sự khác biệt của các týp gen vacA s1/m1 và vacA s1/m2 giữa ung thư và viêm dạ dày, p=0,025, tỷ số chênh = 2,118 (KTC 95%, 1,094 – 4,1). Kết luận: Gen cagA (+) có ở tất cả các trường hợp ung thư dạ dày, và cagA (-) chỉ gặp ở viêm dạ dày. Gen cagA (+) kết hợp với kiểu gen vacA m1 của các chủng H. pylori. Đặc biệt, ở chủng H. pylori có gen cagA (+) và gen vacA s1/m1 cho thấy nguy cơ cao liên quan đến bệnh ung thư dạ dày. Từ khóa: Helicobacter pylori, gen cagA và gen vacA, ung thư dạ dày. ABSTRACT ANALYSIS OF VACA GENOTYPES AND CAGA GENE OF HELICOBACTER PYLORI IN GASTRIC CANCERS Tran Thien Trung, Cao Minh Nga, Nguyen Thuy Oanh, Hua Thi Ngoc Ha, Ho Huynh Thuy Duong * Y hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 – No. 1 – 2011: 43 - 51 Aim: The main objective of this study was to determine cagA and vacA genotypes of Helicobacter pylori and evaluating the relation of these genotypes to gastric cancer in patients in Ho Chi Minh city and the southern area of Vietnam. Patients and methods: From December 2008 to May 2010, at University Medical Center and University * Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. ** Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐH Quốc gia TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Thiện Trung ĐT: 0903645659 Email: drtranthientrung@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 44 of Natural Science in Ho Chi Minh city. We underwent a study to investigate cagA gene and vacA genotypes of Helicobacter pylori in infected patients with gastric cancer by multiplex polymerase chain reaction assay. The case-control study includes 126 patients with gastric cancer, operated by subtotal gastrestomy, R2 ganglion curage and 93 patients with gastritis. All patients were diganosed H. pylori infection by PCR, urease test (CLO test), or pathology. Results: Of the 162 patients, including 71 gastric cancers and 91 gastritis, the ratio of cagA-positive was 95.7% (150/157). All patients with gastric cancer and 92.3% patients with gastritis were cagA-positive (p=0.018, OR=1.845, CI=1.597-2.133). The vacA s1 was 98.1%. In gastric cancer group, allele s1 was 100%, compared to 96.7% in gastritis group; Allele s2 was 3.3% and just identified in gastritis group (p=0.261). The vacA m1 and m2 were 50.6 (81/160) and 49.4% (79/160). In gastric cancer group, allele m1 was 63.8% and allele m2 was 36.2%, while in gastritis group allele m1 was 40.7% and m2 was 59.3% (p=0.004, OR=2.569, CI=1.348-4.895). The relation between cagA gene and vacA genotypes with gastric cancer was identified. 157 patients were studied. Of 66 patients with gastric cancer, cagA-positive was 100% within this group, vacA s1m1 and s1m2 genotypes were 63.6% and 36.4%. Of 91 patients with gastritis, cagA-positive was 92.3% and cagA- negative was 7.7%. In this group, there were three genotypes for vacA gene: s1m1 (42%), s1m2 (50.5%), s2m2 (3%). In patients with cagA-positive, there was a significant difference between vacA genotype s1/m1 and s1/m2 in two groups (p=0.025, OR=2.118, CI=1.094 - 4.100). Conclusion: The cagA-positive genotype existed in all gastric cancer patients and cagA-negative just appeared in gastritis. The cagA-positive genotype always coexisted with vacA m1 genotype. Specially, H. pylori with cagA-positive and vacA s1m1 genotype showed a significant association with gastric cancer. Keywords: Helicobacter pylori, cagA and vacA genotypes, gastric cancer. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn H. pylori được tìm ra vào tháng 4 năm 1982, kể từ đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn này gây ra các bệnh ở dạ dày-tá tràng như viêm, loét và ung thư dạ dày(15). Năm 1983, Marshall là một trong hai người tìm ra H. pylori lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về sự kết hợp giữa nhiễm H. pylori và ung thư dạ dày(7). Năm 1994, Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (International Agency for Research on Cancer-IARC) dựa trên các bằng chứng dịch tễ học đã nêu lên sự liên quan giữa nhiễm H. pylori với carcinom hay là ung thư dạ dày, và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công nhận và xếp H. pylori là tác nhân quan trọng hàng đầu hay nhóm 1 các tác nhân gây carcinom dạ dày(8). Liên quan đến bệnh sinh, ngoài các yếu tố môi trường, yếu tố ký chủ có các thay đổi về di truyền như thay đổi về gen... là những tác nhân có khả năng gây bệnh. Một yếu tố quan trọng khác đó là độc lực của vi khuẩn H. pylori có thể nhiều hay ít hoặc là cao hay thấp tùy thuộc vào các chủng H. pylori liên quan đến các gen cagA và gen vacA. Gen cagA (cytotoxin-associated gene) và gen vacA (vacuolating toxin gene) là các gen được coi là yếu tố độc lực chủ yếu có khả năng gây bệnh và đặc trưng của vi khuẩn H. pylori(1, 6). Sự kết hợp giữa các gen cagA và các týp gen vacA có thể liên quan đến nguy cơ với các mức độ biểu hiện lâm sàng khác nhau của bệnh(5). Gen cagA có thể không có ở tất cả các chủng H. pyori(3). Protein cagA, có kích thước từ 128 đến 140 kDa, có khả năng kích thích phản ứng phosphoryl hóa tyrosine trong tế bào ký chủ, dẫn đến sự tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mô dạ dày(11). Gen vacA có chứa ít nhất hai vùng biến đổi gồm vùng tín hiệu và vùng giữa. Vùng giữa (middle) của gen vacA có các týp gen là m1/m2 và vùng tín hiệu (signal) có thể có các týp gen là s1/s2. Mức độ độc tố cao hay thấp của gen vacA phụ thuộc vào các týp gen của hai vùng này. Chủng H. pylori với týp gen vacA s1/m1 có độc tố trên tế bào mạnh hơn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học 45 týp gen vacA s1/m2, trong khi đó chủng H. pylori với týp gen vacA s2/m2 không gây độc tố(1). Để hiểu rõ hơn về tính đa dạng và vai trò của các týp gen vacA của H. pylori liên quan đến các bệnh dạ dày, Rhead và cs(12) đã nêu lên ngoài 2 vùng giữa của gen vacA có các týp gen là m1 hoặc m2 và vùng tín hiệu có các týp gen là s1 hoặc s2 còn có vùng trung gian (intermediate) ký hiệu là i. Ở vùng trung gian có 2 cặp alleles khác nhau gồm i1 (vacuolating) và i2 (nonvacuolating). Tất cả các cặp gen vacA s1/m1 thuộc týp i 1, tất cả các gen vacA s2/m2 thuộc týp i 2, và vacA s1/m2 có thể thuộc týp i 1 hoặc i 2. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm H. pylori cao, và ung thư dạ dày hiện đang là một vấn đề lớn, thời sự trong các bệnh ung thư đường tiêu hóa. Vì vậy việc nghiên cứu để hiểu rõ hơn về bệnh sinh của ung thư dạ dày nhằm tìm ra những chiến lược can thiệp có hiệu quả để điều trị và phòng ngừa là vấn đề hết sức quan trọng và cấp thiết. Công trình nghiên cứu này của chúng tôi dựa trên phương pháp multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) để xác định các týp gen cagA và vacA với các týp gen vacA s1/s2; vacA m1/m2 của H. pylori, và mối liên quan giữa các týp gen này với ung thư dạ dày ở bệnh nhân khu vực thành phố Hồ Chí Minh và miền Nam Việt Nam. Trên cơ sở đó nhằm mục đích tầm sóat và theo dõi những bệnh nhân nhiễm H. pylori với các týp gen mắc phải có nguy cơ cao của bệnh ung thư dạ dày. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Trong khoảng thời gian từ tháng 12/2008 đến tháng 5/2010, tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các týp gen của vi khuẩn H. pylori. Thiết kế nghiên cứu bệnh chứng gồm 2 nhóm: (1) 126 bệnh nhân ung thư dạ dày (hang vị) được mổ cắt 2/3 dạ dày, nạo hạch R2, trong số này có 96 bệnh nhân ung thư dạ dày có H. pylori-dương tính và 30 H. pylori-âm tính ; và (2) nhóm chứng 93 viêm dạ dày có H. pylori-dương tính được đưa vào nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu Tiêu chuẩn chọn bệnh và loại trừ Chọn các bệnh nhân sau mổ cắt bán phần dưới dạ dày do ung thư biểu mô tuyến (carcinoma). Loại trừ các trường hợp: bệnh phẩm không đạt yêu cầu về kích thước và bảo quản, các thương tổn khác như lymphôm, sarcôm dạ dày. Thu thập mẫu Bệnh nhân sau mổ cắt bán phần dưới dạ dày do ung thư Tiến hành lấy 6 mẫu mô : Mẫu mô ung thư (mô bệnh) được lấy ở ranh giới mô lành và mô ung thư, mẫu mô lành lấy cách thương tổn ít nhất 5 cm về phía trên của bờ cắt dạ dày. Hai mẫu mô (khoảng 0,5 cm) chẩn đoán CLO test. Bốn mẫu mô kích thước khoảng 1 cm - 1,5 cm gồm : 1 mô lành và 1 mô bệnh được gửi làm mô bệnh học tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Hai mẫu mô còn lại được gửi xác định týp gen tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. Nhóm chứng bệnh nhân viêm dạ dày có H. pylori-dương tính được lấy từ 3 mẫu sinh thiết dạ dày trong lúc nội soi, kích thước các mẫu khoảng 0,5 cm gồm : 1 chẩn đoán CLO test, 1 chẩn đoán mô bệnh học, và 1 gửi định danh týp gen của H. pylori. Chẩn đoán nhiễm H. pylori : Bệnh nhân trong nghiên cứu ở cả 2 nhóm ung thư và viêm dạ dày có H. pylori-dương tính được chẩn đoán đồng thời bằng 3 thử nghiệm : (1) thử nghiệm urease (CLO test) ; (2) Giải phẫu bệnh ; và (3) Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR). H. pylori- dương tính được định nghĩa khi có ít nhất 2 trong 3, và hoặc cả 3 thử nghiệm dương tính. Xác định các týp gen của H. pylori Sử dụng Master mix PCR kết hợp với các cặp mồi đặc hiệu. Mồi được tổng hợp từ công ty IDT (Hoa Kỳ). Mồi dùng cho phản ứng PCR xác Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 46 định VacA và cagA được lấy từ công trình của Kumar S, Kumar A, Dixit V K và cs năm 2008(9) và Chattopadhyay và cs năm 2004(5). Mồi dùng phát hiện gene urease được chúng tôi thiết kế dựa trên các phần mềm chuyên dụng. Chúng tôi cũng khảo sát tính đặc hiệu của mồi đã chọn trên chứng dương là các chủng H. pylori J99 (s1m1cagA+) ; và chứng âm là trên một số vi khuẩn khác và trên mẫu không chứa H. pylori. DNA bộ gen H. pylori sau khi tách chiết được dùng để tiến hành phản ứng multiplex PCR trong hệ thống PCR CFX96TM Real-Time (BioRad). Mẫu DNA H. pylori chứng trong các phản ứng PCR là các sản phẩm nhân bản có týp gen cagA (+) vacA s1m1 và cagA (+) vacA s1m2 được xác định bằng phương pháp giải trình tự. Kết quả điện di các sản phẩm của phản ứng multiplex PCR (hình 1) tương ứng với các kiểu gen cagA (+)/(-), vacA s1/s2, vacA m1/m2 và gen hGSTP từ mẫu sinh thiết chứa H. pylori của 4 bệnh nhân. Kết quả cho thấy các sản phẩm PCR tạo ra có kích thước phù hợp với kích thước dự kiến: vacA m1/m2 (567/642 bp), cagA (349 bp), vacA s1/s2 (259/286 bp) và hGSTP (192 bp). Tín hiệu thu được mạnh và đặc hiệu, không có sản phẩm ký sinh. Điều này cho thấy bộ mồi gồm 4 cặp mồi sử dụng trong phản ứng multiplex PCR hoạt động tốt với nồng độ và chương trình đã xác định. Các sản phẩm nhân bản được kiểm tra bằng giải trình tự cho thấy phù hợp với trình tự gen của H. pylori đã công bố. Phản ứng multiplex PCR dùng phát hiện và định týp gen của vi khuẩn H. pylori đạt hiệu quả và độ chính xác cao, với cường độ tín hiệu đặc trưng cho từng gen không chênh lệch. Điều này cho thấy các điều kiện của phản ứng đã được tối ưu hóa và phù hợp cho sự nhân bản của các gen. Kết quả áp dụng quy trình trên một số bệnh phẩm của bệnh nhân viêm và ung thư dạ dày trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ưu thế của týp gen cagA (+), vacA s1m1; và cagA (+), vacA s1m2. Hình 1: Kết quả multiplex PCR phát hiện và phân týp gen cagA và vacA của H. pylori Giếng (+), chứng dương là DNA H. pylori có kiểu gen cagA (+), vacA s1m2; giếng (-), chứng âm; giếng 1, cagA (-), vacA s1m2; giếng 2, cagA (+), vacA s1m2; giếng 3, cagA (+), vacA s1m1. Giếng 4, cagA (-), vacA s2m2; giếng M, thang phân tử 100-bp (Bio- Rad) Xử lý và phân tích thống kê Dữ liệu thu thập được nhập, xử lý và phân tích bằng phần mềm SPSS 15.0. Các phép kiểm T-test, Fisher’s exact, chi bình phương (χ2) được dùng trong nghiên cứu có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. Xác định các yếu tố nguy cơ bằng tỷ số chênh (Odds Ratio) với khoảng tin cậy 95%. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm bệnh nhân xác định týp gen 96 bệnh nhân ung thư dạ dày có H. pylori- dương tính được xác định týp gen, trong số này: - 25 trường hợp PCR không có kết quả cả vacA và cagA - 2 trường hợp cagA (+) nhưng không xác định được m - 3 trường hợp cagA (+) nhưng không xác định được s. Nhóm chứng 93 viêm dạ dày có H. pylori- dương tính, trong số này 2 trường hợp PCR không có kết quả cả cagA và vacA. Tuổi của bệnh nhân Bảng 1. Tuổi trung bình của bệnh nhân Nhóm bệnh nhân Số bệnh nhân Tuổi trung bình Ung thư dạ dày 71 59,54 ± 12,74 Viêm dạ dày 91 46,42 ± 12,75 Nhận xét: Tuổi trung bình của bệnh nhân ở 2 nhóm bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày khác biệt có ý nghĩa với p< 0,001 (T test). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học 47 Giới tính Bảng 2. Giới tính Nhóm bệnh nhân Giới tính Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng Nam 48 (67,6%) 43 (47,3%) 91 (56,2%) Nữ 23 (32,4%) 48 (52,7%) 71 (43,8%) Tổng cộng 71 (100%) 91 (100%) 162 (100%) Nhận xét: Có sự khác biệt về giới ở nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày, với p = 0,01(χ2). Tỷ số chênh = 2,33 (Khoảng tin cậy 95%: 1,222 – 4,442). Đặc điểm các thử nghiệm chẩn đoán H. pylori Tất cả trường hợp trong nghiên cứu ở 2 nhóm ung thư dạ dày (n=71) ; và nhóm viêm dạ dày (n=91) đều có cùng kết quả H. pylori-dương tính với cả 2 thử nghiệm : urease (CLO test) dương tính, và PCR dương tính. Kết quả giải phẫu bệnh chẩn đoán H. pylori ở nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày là 57,7% (41/71), và ở nhóm viêm dạ dày là 44% (40/91) trường hợp. Giải phẫu bệnh chẩn đoán H. pylori có kết quả thấp hơn so với 2 thử nghiệm CLO test, và PCR. Kết quả định týp gen cagA của H. pylori Bảng 3 : Kết quả định týp gen cagA của H. pylori Nhóm bệnh nhân Gen cagA Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng cagA (+) 71 (100%) 84 (92,3%) 155 (95,7%) cagA (-) 0 (0%) 7 (7,7%) 7 (4,3%) Tổng cộng 71 (100%) 91 (100%) 162 Nhận xét: cagA (+) có trong 100% các trường hợp ung thư dạ dày so với 92,3% trong viêm dạ dày, với p = 0,018 (Fisher’s exact). Tỉ số chênh = 1,845 (Khoảng tin cậy 95%, 1,597 – 2,133). Kết quả định týp gen vacA s1 và vacA s2 Bảng 4 : Kết quả định týp gen vacA s1/ vacA s2 của H. pylori Nhóm bệnh nhân Gen vacA Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng vacA s1 68 (100%) 88 (96,7%) 156 (98,1%) vacA s2 0 (0%) 3 (3,3%) 3 (1,9%) Tổng cộng 68 (100%)* 91 (100%) 159 Nhận xét: * 3 trường hợp cagA (+) nhưng không xác định được s nên không đưa vào trong phân tích. Không có sự khác biệt týp gen vacA s1 giữa 2 nhóm ung thư và viêm dạ dày, với p= 0,261 (Fisher’s exact). Týp gen vacA s2 chỉ gặp trong nhóm bệnh nhân viêm dạ dày. Kết quả định týp gen vacA m1 và vacA m2 Bảng 5 : Kết quả định týp gen vacA m1/ vacA m2 của H. pylori Nhóm bệnh nhân Gen vacA Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng vacA m1 44 (63,8%) 37 (40,7%) 81 (50,6%) vacA m2 25 (36,2%) 54 (59,3%) 79 (49,4%) Tổng cộng 69 (100%)* 91 (100%) 160 Nhận xét: * 2 trường hợp cagA (+) nhưng không xác định được m nên không đưa vào trong phân tích. Có sự khác biệt giữa týp gen vacA m1 và vacA m2 giữa 2 nhóm ung thư và viêm dạ dày, với p= 0,004 (χ2). Tỉ số chênh = 2,569 (Khoảng tin cậy 95%, 1,348 – 4,895). Kết quả định týp gen vacA s1/s2 và vacA m1/m2 Bảng 6: Kết quả định týp gen vacA s1/m1; vacA s1/m2; và vacA s2/m2 của H. pylori Nhóm bệnh nhân Gen vacA Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng vacA s1/m1 42 (63,6%) 38 (41,8%) 80 vacA s1/m2 24 (36,4%) 50 (54,9%) 74 vacA s2/m2 0 (0%) 3 (3,3%) 3 Tổng cộng 66 (100%) 91 (100%) 157* Nhận xét: * 5 trường hợp cagA (+) nhưng không xác định được s, hoặc m nên không đưa vào trong phân tích. Các týp gen vacA giũa 2 nhóm bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày khác biệt có ý nghĩa thống kê với p= 0,014 (χ2). Týp gen vacA s2/m2 có số liệu nhỏ và chỉ gặp ở nhóm viêm dạ dày. Khi tính gộp nhóm s1/m2 với nhóm s2/m2, kết quả thu được như sau (bảng 7): Bảng 7 : Kết quả định týp gen vacA s1/m1; vacA s1/m2; và vacA s2/m2 của H. pylori Nhóm bệnh nhân Gen vacA Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng vacA s1/m1 42 (63,6%) 38 (41,8%) 80 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 48 Nhóm bệnh nhân Gen vacA Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng vacA s1/m2; s2/m2 24 (36,4%) 53 (58,2%) 77 Tổng cộng 66 (100%) 91 (100%) 157* Nhận xét: Các týp gen vacA giũa 2 nhóm bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày khác biệt có ý nghĩa thống kê với p= 0,007 (χ2). Tỉ số chênh = 2,441 (Khoảng tin cậy 95%, 1,272 – 4,685). Liên quan các týp gen vacA khác nhau khi có gen cagA (+) hoặc cagA (-) Bảng 8 : Liên quan giữa gen cagA với các týp gen vacA của H. pylori Nhóm bệnh nhân Gen cagA Gen vacA Ung thư dạ dày Viêm dạ dày Tổng cộng cagA (+)* (n=150) vacA s1/m1 42 (63,6%) 38 (42%) 80 (51%) vacA s1/m2 24 (36,4%) 46 (50,5%) 70 (44,5%) cagA (-) (n=7) vacA s1/m2 0 (0%) 4 (4,5%) 4 (2,5%) vacA s2/m2 0 (0%) 3 (3%) 3 (1,9%) Tổng cộng 66 (100%) 91 (100%) 157 (100%) Nhận xét: * 2 trường hợp cagA (+) nhưng không xác định được m, và 3 cagA (+) không xác định được s nên không đưa vào phân tích. Các trường hợp cagA (+), có sự khác biệt các týp gen vacA s1/m1 và vacA s1/m2 giữa 2 nhóm bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày có ý nghĩa thống kê với p=0,025 (χ2). Tỉ số chênh = 2,118 (Khoảng tin cậy 95%, 1,094 – 4,1). Các trường hợp cagA (–) chỉ gặp ở nhóm bệnh nhân viêm dạ dày, số lượng bệnh nhân quá nhỏ không phân tích thống kê. BÀN LUẬN Gen cagA của vi khuẩn Helicobacter pylori Tỷ lệ gen cagA của các chủng H. pylori được báo cáo từ các vùng khác nhau trên thế giới từ 50-70% trong dân số ở các nước phương Tây và có thể chiếm >90% ở các nước phương Đông(4). H. pylori có thể chia ra hai nhóm: sinh độc tố và không sinh độc tố là do kiểu gen biểu hiện khác nhau, nói cách khác do có hoặc không có gen cagA. Ở cụm gen CagPAI, protein cagA được chuyển dời vào trong các tế bào đích thông qua hệ thống cơ cấu bài tiết typ IV, được phosphoryl-hóa và tác động như một yếu tố tăng trưởng(15). Vai trò của gen cagA được coi như là yếu tố chính với độc lực cao gây ung thư dạ dày. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy mối liên quan giũa nhiễm các chủng H. pylori có gen cagA (+) thì có nguy cơ cao gây ung thư dạ dày. Chattopadhyay và cs(5), gen cagA khi kết hợp với các týp gen vacA có thể gây ra các nguy cơ với biểu hiện lâm sàng và mức độ nặng nhẹ khác nhau của bệnh nhân. Trong nghiên cứu của Kumar và cs năm 2008(9), bằng phương pháp multiplex PCR phát hiện và phân tích gen cagA và các týp gen vacA trên 232 trường hợp (gồm cả 56 người khỏe mạnh), gen cagA chiếm 63,2%. Tỷ lệ gen cagA (+) trong các nguyên nhân viêm dạ dày, loét, ở người bình thường lần lượt là 70%, 54,3%, và 17,9% ; nhưng đặc biệt ở bệnh nhân ung thư dạ dày gen cagA (+) là 100% trường hợp và kết hợp với gen vacA s1/m1 hoặc là s1/m2. Trong nghiên cứu của chúng tôi, cũng bằng phương pháp multiplex PCR phát hiện và phân tích gen cagA và các týp gen vacA trên 162 bệnh nhân (71 ung thư dạ dày và 91 viêm dạ dày), tỷ lệ cagA (-) chung chiếm 4,3% (7/162), và chỉ gặp ở nhóm bệnh viêm dạ dày 7,7% (7/91); gen cagA (+) chiếm 95,7% trường hợp, ở bệnh nhân ung thư dạ dày là 100% (71/71) so với 92,3% (84/91) viêm dạ dày với p = 0,018 và tỷ số chênh = 1,845 (Khoảng tin cậy 95%, 1,597 – 2,133), (Bảng 3). Ở Việt Nam, Tạ Long và cs(13), nghiên cứu mối liên quan giữa ung thư dạ dày và nhiễm H. pylori, trong thời gian từ tháng 3/2003 đến tháng 4/2004, tại các bệnh viện Trung ương Quân đội 108, bệnh viện Bưu điện và Việt Đức-Hà nội. Có 208 bệnh nhân, được chia làm 2 nhóm: (1) 104 ung thư dạ dày; và (2) 104 viêm dạ dày mạn tính xác định bằng mô bệnh học. Ba mươi tám mẫu (38) được gửi làm PCR tại Đại học Fukui (Nhật Bản), cho thấy typ cagA (+) Á đông có khả năng gây bệnh viêm dạ dày chiếm tỷ lệ 82,3%, cao hơn so với 47,6% trong ung thư dạ dày. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học 49 Nghiên cứu của Trần Ngọc Ánh(14) năm 2006, cho thấy tỷ lệ H. pylori typ I trong ung thư dạ dày là 78,6% cao hơn trong viêm dạ dày là 33,3%, tỷ lệ H. pylori có cagA (+) và vacA (+) ở nhóm bệnh nhân ung thư dạ dày lần lượt là 80,9% và 97,6%, cao hơn ở nhóm bệnh nhân viêm dạ dày là 47,6% và 52,3% (p<0,05), nguy cơ ung thư dạ dày cao gấp 4,86 lần với cagA (+) và gấp 32,27 lần với vacA (+) so với nhiễm H. pylori cagA (-) và vacA (-). Nghiên cứu mới đây của Nguyễn Thị Nguyệt và cs (10), xác định các týp gen cagA và vacA của các chủng H. pylori từ 90 bệnh nhân viêm, loét và ung thư dạ dày. Các týp H. pylori được cống bố gồm : Týp I H. pylori của bệnh nhân viêm, loét dạ dày và ung thư dạ dày lần lượt là : 52,3%, 55,6%, và 19% ; Týp II H. pylori : 4,7%, 7,4%, và 19% ; Týp III H. pylori : 33,3%, 25,9%, và 14,3% ; Týp IV H. pylori : 9,5%, 11,1%, và 46,6%. Các tác giả kết luận týp I H. pylori có độc lực cao nhất và gặp hơn một nửa trong các bệnh viêm dạ dày, loét dạ dày ; Týp IV H. pylori có tỷ lệ cao ở bệnh nhân ung thư dạ dày. Tuy nhiên trong các công trình nghiên cứu của tác giả Việt Nam trước đây chưa có điều kiện để phân tích các phân týp của vacA nhằm đánh giá đầy đủ hơn về vai trò của týp gen của vacA s1/s2 và vacA m1/m2 cũng như mối liên quan giữa các týp gen này với các trường hợp có gen cagA (+) trong bệnh ung thư dạ dày. Mới đây trong nghiên cứu giữa các tác giả Nhật Bản Uchida và cs cùng các tác giả Việt Nam năm 2009 (16), phân tích các yếu tố gây bệnh trên 103 chủng H. pylori ở bệnh nhân Việt Nam (54 Hà nội và 49 thành phố Hồ Chí Minh). Tỷ lệ cagA (-) chiếm 5% ; cagA Glu-Pro-Ille-Tyr- Ala (EPIYA) chiếm 77% (80/103); Týp II cagA right-end junction chiếm ưu thế 84% (87/103). Gen vacA s1 là 100% (103/103) có trong tất cả các trường hợp, trong khi đó gen vacA s2 chỉ là 1% (1/103). Gen vacA m1 là 43% (44/103), ở bệnh nhân Hà nội là 54% (29/54) so với thành phố Hồ Chí Minh là 31% (15/49) với p<0,05. Gen vacA m2 chiếm 52% (54/103), ở Hà Nội là 41% (22/54) so với 65% (32/49) bệnh nhân tại thành phố Hồ Chí Minh. Các tác giả kết luận gen vacA m1 của các chủng H. pylori được phân lập trên bệnh nhân Hà nội, nơi có xuất độ ung thư dạ dày cao, có ý nghĩa hơn so với các chủng H. pylori được phân lập tại thành phố Hồ Chí Minh; và đưa ra giả thuyết gen vacA m1 là gen kết hợp với ung thư dạ dày ở bệnh nhân Việt Nam. Trong nghiên cứu của chúng tôi trên 162 bệnh nhân (71 ung thư dạ dày và 91 viêm dạ dày), tỷ lệ cagA (-) chung chiếm 4,3% và chỉ gặp ở nhóm viêm dạ dày; gen cagA (+) chiếm 95,7% trường hợp, ở bệnh nhân ung thư dạ dày là 100% (71/71) so với 92,3% (84/91) viêm dạ dày với p = 0,018 và tỷ số chênh = 1,845 (Khoảng tin cậy 95%, 1,597 – 2,133). Gen vacA s1 là 98,1% (156/159), ở bệnh nhân ung thư dạ dày là 100% (68/68) so với 96,7% (88/91) viêm dạ dày ; trong khi đó gen vacA s2 là 1,9% (3/159) và chỉ gặp ở viêm dạ dày, và không có sự khác biệt týp gen vacA s1 giữa 2 nhóm ung thư và viêm dạ dày, với p= 0,261 (bảng 4). Gen vacA m1 có tỷ lệ chung là 50,6% (81/160), ở bệnh nhân ung thư dạ dày là 63,8% (44/69) so với 40,7% (37/91) viêm dạ dày; Gen vacA m2 có tỷ lệ chung là 49,4% (79/160), ở bệnh nhân ung thư dạ dày là 36,2% (25/69) so với 59,3% (54/91) nhóm viêm dạ dày. Kết quả của chúng tôi cho thấy có sự khác biệt của týp gen vacA m1 và vacA m2 giữa 2 nhóm ung thư và viêm dạ dày, với p= 0,004, tỷ số chênh = 2,569 (Khoảng tin cậy 95%, 1,348 – 4,895), (Bảng 5). Tóm lại : Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi về các týp gen vacA s1, vacA s2 và gen vacA m1, vacA m2 là phù hợp với Uchida và cs cùng các tác giả Việt Nam năm 2009(16). Chúng tôi cũng có chung nhận định khi gen cagA (+) kết hợp với kiểu gen vacA m1 của các chủng H. pylori ở bệnh nhân khu vực thành phố Hồ Chí Minh và phía Nam Việt Nam có thể có liên quan đến bệnh ung thư dạ dày. Đặc biệt khi gen cagA (+) có các gen vacA s1/m1 gặp trong 100% trường hợp ung thư dạ dày. Điều đó đặt ra trong thực tế cần phải tầm sóat và theo dõi những bệnh nhân Việt Nam nhiễm H. pylori khi có gen cagA (+) kết hợp với các gen vacA s1/m1. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 50 Liên quan giữa gen cagA và các týp gen vacA Trong nghiên cứu của chúng tôi trên 157 bệnh nhân (66 ung thư dạ dày, 2 trường hợp cagA (+) không xác định được m, và 3 cagA (+) không xác định được s nên không đưa vào phân tích ; và 91 viêm dạ dày). Tỷ lệ gen cagA (+) chung là 95,5% (150/157), trong số này ở nhóm 66 bệnh nhân ung thư dạ dày cagA (+) trong 100% trường hợp, và chỉ gặp các týp gen vacA s1/m1 ở 63,6% (42/66), và hoặc là vacA s1/m2 ở 36,4% (24/66). Ở nhóm chứng 91 viêm dạ dày, tỷ lệ cagA (+) chiếm 92,3% (84/91); cagA (-) chung là 4,4% (7/157), và chỉ gặp ở nhóm viêm dạ dày 7,7% (7/91) trường hợp. Trong nhóm viêm dạ dày, ở bệnh nhân có cagA (+), chúng tôi gặp các týp gen vacA s1/m1 ở 42% (38/91), gen vacA s1/m2 là 50,5% (46/91); ở bệnh nhân cagA (-), có các týp gen vacA s1/m2 ở 4,5% (4/91), gen vacA s2/m2 là 3% (3/91) (bảng 8). Các trường hợp cagA (+), có sự khác biệt các týp gen vacA s1/m1 và vacA s1/m2 giữa 2 nhóm bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày có ý nghĩa thống kê với p=0,025, và tỷ số chênh = 2,118 (Khoảng tin cậy 95%, 1,094 – 4,1). Trong nghiên cứu của Kumar và cs, năm 2008 (9), liên quan đến các týp gen vacA, các týp chiếm ưu thế gồm s1 và m1 là 92,3% và 58,2% ; tiếp theo là các týp gen m2 là 41,7%, và s2 là 7,7%. Tỷ lệ gen vacA s1 trong các nguyên nhân viêm dạ dày, loét, ở người bình thường và ung thư dạ dày lần lượt là 100%, 87,1%, 82,1% và 100%. Tỷ lệ gen vacA m1 ở viêm dạ dày, loét, ở người bình thường và ung thư dạ dày lần lượt là 80%, 60%, 25%, và 56,8%. Ở nhóm 44 ung thư dạ dày, gen cagA (+) trong 100% các trường hợp; và chỉ gặp các týp gen vacA s1/m1 ở 56,8% (25/44), và hoặc là s1/m2 ở 43,2% (19/44). Trong nhóm bệnh lành tính, (1) ở 40 bệnh nhân viêm dạ dày có gen vacA s1, và có 80% (32/40) gen vacA s1/m1 nhưng chỉ có 75% (24/32) có gen cagA (+) ; và (2) Tương tự ở nhóm loét 87,1% (61/70) gen vacA s1, trong số này 42 (60%) có gen vacA s1/m1 nhưng chỉ có 28 (66,6%) gen cagA (+), và gen vacA s2/m2 ở 9 bệnh nhân và đều có gen cagA (-). Ở 28 người bình thường nhiễm H. pylori nhưng không có biểu hiện triệu chứng bệnh tiêu hóa, 7 có gen vacA s1/m1 (5 gen cagA (+), và 2 cagA (-)); 16 (57,1%) có gen vacA s1/m2 nhưng gen cagA (-) ; 5 trường hợp còn lại có gen vacA s2/m2 và gen cagA (-). Tóm lại : Nghiên cứu của chúng tôi có kết quả tương tự với các tác giả Kumar và cs, 2008(9). Chúng tôi tóm tắt một số nhận xét như sau: (1) Týp gen vacA s1/m1 gặp ở cả 2 nhóm ung thư và viêm dạ dày nhưng gen cagA (+) gặp 100% các trường hợp ung thư dạ dày, trong khi đó cagA (- ) chỉ gặp ở nhóm bệnh lành tính ; (2) Týp gen vacA s1/m2 có cagA (+) có thể gặp ở 2 nhóm bệnh lành tính và ung thư dạ dày nhưng gen vacA s1/m2 có cagA (-) chỉ gặp ở nhóm bệnh lành tính; (3) Týp gen vacA s2/m2 chỉ gặp ở bệnh nhân có cagA (-),và ở nhóm bệnh lành tính hoặc ở người bình thường ; (4) Týp gen vacA s2/m1 không gặp trong nghiên cứu của chúng tôi mặc dù gen vacA s2 chiếm 3,3% (3/91) ở nhóm viêm dạ dày. Để hiểu rõ hơn về tính đa dạng và vai trò của các týp gen vacA của H. pylori liên quan đến các bệnh dạ dày, Rhead và cs(12) đã chứng minh ngoài 2 vùng giữa gen vacA có các týp gen là m1/m2 và vùng tín hiệu có các týp gen là s1/s2, còn có vùng trung gian (intermediate) ký hiệu là i. Trong nghiên cứu của Basso và cs(2), trên 203 bệnh nhân nhiễm H. pylori gồm 53 ung thư dạ dày, 52 loét dạ dày, và 98 viêm dạ dày. Kết quả chủng H. pylori có cagA (+) có liên quan đến ung thư dạ dày (p<0.001), và loét dạ dày (p<0,05). Gen vacA s1 và vacA týp i 1 có liên quan đến ung thư dạ dày và vacA týp i 1 với loét dạ dày, tỷ số chênh 2,58 (khoảng tin cậy 95%: 1,19-5,61). Các tác giả kết luận ở các Phương Tây, nguy cơ bệnh ung thư dạ dày có liên quan đến chủng H. pylori với gen cagA EPIYA-C, tỷ số chênh 7,37 (khoảng tin cậy 95%: 1,98-27,48) ; đối với nguy cơ loét dạ dày liên quan đến vùng trung gian của gen vacA týp I 1. KẾT LUẬN Bằng phương pháp multiplex PCR xác định các týp gen cagA và các týp gen vacA s1/s2; vacA Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học 51 m1/m2 của vi khuẩn H. pylori và mối liên quan đến bệnh ung thư dạ dày. Gen cagA (+) có ở tất cả các trường hợp ung thư dạ dày, týp gen vacA s1/m1 có thể gặp, nhưng có sự khác biệt giữa bệnh ung thư dạ dày và viêm dạ dày; gen cagA (-) chỉ gặp ở nhóm viêm dạ dày. Týp gen vacA s1/m2 với cagA (+) có thể gặp, và có sự khác biệt ở 2 nhóm ung thư dạ dày và viêm dạ dày nhưng gen vacA s1/m2 có cagA (-) chỉ gặp trong viêm dạ dày. Týp gen vacA s2/m2 có gen cagA (-), chỉ có ở nhóm viêm dạ dày. Týp gen vacA s2/m1 không gặp trong nghiên cứu mặc dù gen vacA s2 có ở nhóm viêm dạ dày. Gen cagA (+) kết hợp với kiểu gen vacA m1 của các chủng H. pylori ở bệnh nhân khu vực Miền Nam Việt Nam và thành phố Hồ Chí Minh có thể có liên quan đến bệnh ung thư dạ dày, đặc biệt khi gen cagA (+) có các gen vacA s1/m1. Điều đó đặt ra trong thực tế cần phải tầm sóat và theo dõi những bệnh nhân nhiễm H. pylori với các týp gen mắc phải có nguy cơ cao của bệnh ung thư dạ dày khi có gen cagA (+) kết hợp với các gen vacA s1/m1. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Atherton, J. C., P. Cao, R. M. Peek, Jr., M. K. Tummuru, M. J. Blaser, and T. L. Cover (1995). Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J Biol Chem, 270:17771-17777. 2. Basso D, Zambon CF, Letley DP, Stranges A, Marcher A, Rhead JL, et al (2008). Clinical relevance of Helicobacter pylori cagA and vacA gen polymorphisms. Gastroenterology; 135: 91-99. 3. Blaser MJ, Perez-Perez GI, Kleanthous H, Cover TL, Peek RM, Chyou PH, Stemmermann GN, Nomura A (1995). Infection with Helicobacter pylori strains possessing cagA is associated with an increased risk of developing adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res, 55: 2111-2115. 4. Bolek BK, Salih BA, Sander E (2007). Genotyping of Helicobacter pylori strains from gastric biopsies by multiplex multiplex polymerase chain reaction. How advantageous is it? Diag Microbiol Infect Dis; 58:67-70. 5. Chattopadhyay S, Patra R, Ramamurthy T, Chowdhury A, Santra A, Dhali GK, Bhattacharya SK, Douglas EB, Nair GB, Mukhopadhyay AK (2004). Multiplex PCR assay for rapid detection and genotyping of Helicobacter pylori directly from biopsy specimens. J Clin Microbiol; 42: 2821-2824. 6. De Martel C, Plummer M, Van Doorn LJ, Vivas J, Lopez G, Carillo E, Peraza S, Munoz N, Franceschi S (2009). Comparison of polymerase chain reaction and histopathology for the detection of Helicobacter pylori in gastric biopsies. Int J Cancer. 7. Forman D (1996). Helicobacter pylori and gastric cancer. Scand J Gastroenterol, 31(Suppl 215): 48-51. 8. International Agency for Research on Cancer monographs on the evaluation of carcinogenic risks to human. Schistosomes, Liver Fluskes and Helicobacter pylori. (Lyon, France) IARC 1994; 61:177-240. 9. Kumar S. Kumar A, Dixit VK (2008). Direct detection and analysis of vacA genotypes and cagA gene of Helicobacter pylori from gastric biopsies by a novel multiplex polymerase chain reaction assay. Diag Microbiol Infect Dis; 62: 366-373. 10. Nguyễn Thị Nguyệt, Trần Văn Hợp, Nguyễn Thị Hồng Hạnh. (2010) Xác định týp cagA và vacA của các chủng Helicobacter pylori phân lập từ các bệnh nhân bị viêm, loét, ung thư dạ dày. Tạp chí Khoa học Tiêu hóa Việt Nam; 19: 1265- 1272. 11. Peek RM, Vaezi MF, Falk GW, Goldblum JR, Perez-Perez GI, Richter JE, Blaser MJ (1999). Role of Helicobacter pylori cagA (+) strains and specific host immune responses on the development of premalignant and malignant lesions in the gastric cardia. Int J Cancer; 82:520-524. 12. Rhead JL, Letley DP, Mohammadi M, Eshagh Hosseini M, Atherton JC (2007). A new Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin determinant, the intermediate region, is associated with gastric cancer. Gastroenterology; 133 : 926-936. 13. Tạ Long, Trịnh Tuấn Dũng, Nguyễn Quang Chung, Hoàng Kim Ngân, Vũ Văn Khiên, Dương Văn Thắng, Lê Văn Don, Nguyễn Văn Thịnh, Lê Văn Phủng, Đỗ Đức Vân, Azuma T, Okuda T, Yamazaki S (2006). Nghiên cứu mối liên quan giữa ung thư dạ dày và nhiễm khuẩn Helicobacter pylori. Tạp chí Khoa học Tiêu hóa Việt Nam; 1: 10-19. 14. Trần Ngọc Ánh (2006). Nghiên cứu các type của Helicobacter pylori và sự biểu lộ Protein P53 ở bệnh nhân ung thư dạ dày. Luận án Tiến sĩ Y học. Trường Đại học Y Hà Nội. 15. Trần Thiện Trung (2008). Bệnh dạ dày-tá tràng và nhiễm Helicobacter pylori. Nhà xuất bản Y học. 16. Uchida T, Lam Tung Nguyen, Takayama A, Okimoto T, Kodama M, Murakami K, Matsuhida T, Tuan Dung Trinh, Long Ta, Dang Quy Dung Ho, Hoa Hai Hoang, Kishida T, Fujioka T, Moriyama M, and Yamaoka Y (2009). Analysis of virulence factors of Helicobacter pylori isolate from Vietnamese population. BMC Microbiology; 9:175.